小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达影响的实验研究

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,并在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,明确感染后,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg,HBeAg(MEIA),通过RT-PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组,空载体对照组和无关干扰对照组。结果注射后第6天血清中HBsAg,HBeAg在pHBV1.5感染组中高表达。psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与感染组比较差异有显著性(P<0.01),RT-PCR显示肝内HBVCmRNA水平亦明显降低。而无关干扰对照组则无相应的干扰作用。结论RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBV的复制和表达,同时通过水动力学方法,成功建立了小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,为进一步研究乙型肝炎病毒奠定了基础。     

干扰灵联合免疫核糖核酸治疗慢性乙肝疗效分析

采用干扰灵联合抗乙肝免疫核糖核酸治疗慢性乙肝２６例，并与１８例对照组比较。结果表明：治疗结束时，ＨＢｓＡｇ转阴率１５４％（４／２６），ＨＢｅＡｇ转阴率７７２％（１７／２２），ＨＢＶＤＮＡ转阴率５７７％（１５／２６），明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）；随访一年１例患者ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ转阴，２例患者ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ转阴后变阳，其有效率仍显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）。上述结果表明：干扰灵联合抗乙肝免疫核糖核酸疗法能明显抑制ＨＢＶ复制，提高抗病毒疗效。本文并对影响抗病毒疗效的诸多因素进行了分析。     

干扰灵联合核糖核酸与无环鸟苷联合胸腺肽抗乙肝病毒疗效比较

比较干扰灵联合抗乙肝免疫核糖核酸与无环鸟苷联合胸腺肽抗乙肝病毒疗效。采用ELISA和PCR法检测慢性乙肝患者治疗前、结束以及治疗后 6mon血清HBsAg、抗 -HBs、HBeAg、抗 -HBe、抗 -HBc以及HBVDNA。治疗结束时 ,干扰灵组HBsAg转阴率 2 0 % (6 /30 )、HBeAg转阴率 6 6 7% (18/2 4)、HBVDNA转阴率 6 0 % (18/30 ) ,随访 6mon 2例HBsAg、HBeAg、HBVDNA复阳、1例HBeAg、HBVDNA转阴 ;无环鸟苷组治疗结束时 ,HBsAg、HBeAg、HBVDNA转阴率分别为 6 1% (2 /33)、5 5 2 %(16 /2 9)、5 4 5 % (18/33) ,随访结束时其转阴率分别为 2 7 3% (9/33)、5 8 6 % (17/2 9)、6 0 6 % (2 0 /33)。两组治疗后及随访期末 ,HBeAg、HBVDNA转阴率均显著高于对照组 (P <0 0 1) ,但两组间比较其转阴率无明显差异 (P >0 0 5 )。两种联合疗法均能显著抑制乙肝病毒复制 ,两种联合疗法疗效基本一致 ,但无环鸟苷联合组疗程短、价廉、远期疗效好。     

血清HBsAg和HBeAg阳性乙型肝炎患者HBsAg浓度与HBV复制水平的关系

目的：分析血清HBsAg和HBeAg阳性乙型肝炎病例的HBsAg浓度与HBV复制水平的关系,并探讨HBsAg浓度用于HBeAg阳性病例监测HBV复制水平的可行性。方法：随机抽取其中血清HBsAg和HBeAg阳性者共296例,应用荧光定量PCR（fuorescence quantitmivePCR,FQ-PCR）和时间分辨免疫荧光法（time-resolved fluoroimmunoassay,TRIFA）测定乙型肝炎病例的血清HBVDNA水平、血清HBeAg和HBsAg浓度。比较不同DNA复制水平病例的HBsAg浓度,以及不同HBsAg浓度病例的DNA水平,同时进行HBsAg浓度与DNA水平相关性分析。并根据不同浓度的HBsAg初步推测HBV复制状态的阳性预测值、阴性预测值和符合率。结果：若以血清HBVDNA大于或等于10^5拷贝／mL为阳性,则其中228例为DNA阳性（77．03％）。血清HBsAg浓度与HBVDNA复制水平呈正相关,但不同DNA复制水平病例的HBsAg浓度差异并无统计学意义。除HBsAg浓度特别增高达180p．g／L以上的病例DNA阳性率稍高外（χ^2=3．998,P〈0．05）,其余不同HBsAg浓度的病例DNA阳性率及定量水平差异均无统计学意义。采用不同HBsAg浓度水平推测HBV复制状态的阳性预测值、阴性预测值及符合率差异无统计学意义。结论：血清HBsAg和HBeAg阳性乙型肝炎病例血清HBsAg浓度与HBV复制水平有一定相关性,但不宜以HBsAg浓度监测这些病例的HBV复制水平。     

乙型肝炎急性感染小鼠模型的建立

目的 通过尾静脉注射感染性小鼠血清的方法 建立一种简单复制乙型肝炎急性感染的小鼠模型.方法 收集通过水压法复制第3天的小鼠血清,使用不同剂量尾静脉注射感染同系小鼠.分别在不同的时间阶段检测血清中的HBsAg和HBeAg,肝组织中的HBcAg和血清中HBV的DNA.结果 注射0.1 ml血清的感染组的检测结果 均高于0.2 ml组.结论 通过注射感染血清可以成功地复制急性小鼠感染模型.该模型复制方法 中,感染的结果 与注射感染血清的剂量无关.     

拉米夫定等六种药物的体外抗乙型肝炎病毒作用

目的：观察拉米夫定（3TC）等6种药物对抗乙型肝炎病毒（HBV）体外药效评价及不同指标之间的关系。方法：利用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系2．2．15细胞,检测细胞培养上清液中的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒e抗原（HBeAg)及乙肝病毒DNA（HBV－DNA）的含量作为药物抗HBV效果的观察指标。结果：（1）6种药物在一定浓度范围内对2．2．15细胞分泌的HBsAg和HBeAg抑制作用很弱或无抑制;（2）HBV－DNA定量检测拉米夫定和2′3′－二脱氧－3－氟鸟苷（FLG）对HBV DN水平有明显抑制作用,其半数有效剂量（IC50）分别为0．31μmol/L,0．53μmol/L,阿昔洛韦（ACV）和α－干扰素（α-IFN）之IC50分别为0．33mmo/L、96．18U／ml,膦甲酸钠（PFA）和利巴韦林（RBV）最大无毒浓度无任何抑制作用。结论：抑制HBsAg与HBeAg的病毒蛋白表达活性与抑制HBV DNA活性无一致相关性,以HBV DNA指标更能反映化合物的抑制作用。     

血清乙型肝炎病毒核酸定量检测及临床意义

目的: 探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式、肝损害程度的关系。方法: 采用荧光定量PCR分析系统检测126例乙肝病毒感染者HBV DNA,采用ELISA法检测HBVM。结果: 在HBsAg阳性+HBeAg阳性+抗HBc阳性的血清中HBV DNA阳性率和含量最高,血清HBeAg与HBV DNA含量有一定关系(P<0.01),血清丙氨酸氨基转移酶水平与HBV DNA含量亦有一定关系(P<0.05)。结论: HBV DNA含量与HBeAg有一定关系,肝脏损害程度与血清HBV DNA亦有一定关系。     

乙肝HBV DNA荧光定量检测与血清标志物结果相关性分析

目的 研究乙肝血清学标志物（HBV-M）结果与HBV-DNA水平的关系，分析HBV DNA阳性率在各年龄组的分布情况。方法对深圳市部分服务行业人员血清应用荧光定量PCR检测和ELISA法检测并对结果进行分析。结果1781例乙肝血清学标志物阳性血清中有1102例HBV-DNA阳性。其中883例1．3．5阳性（俗称“大三阳”）血清中HBV-DNA的阳性率为96．15％；722例1．4．5阳性（俗称“小三阳”）血清中HBV-DNA的阳性率为24．38％；138例1．5阳性血清中HBV-DNA的阳性率为38．41％；22例1．3阳性血清中HBV-DNA的阳性率为90．91％；11例HBsAg阳性血清中HBV-DNA阳性率为36．36％。结论两种方法检测乙肝标志物有密切的相关性。荧光定量PCR是检测HBV-DNA含量较精确的方法，能正确反映乙肝病毒的复制水平和活跃程度；HBsAg和HBeAg与HBV-DNA含量有着明显的相关关系。     

利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA 在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达

目的：通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达。方法：制备靶向HBV核心抗原（HBcAg）的纳米小干扰RNA（siRNA）,利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗原（HBcAg）。结果：成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低。结论：RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制。     

乙型肝炎血清标志物与HBV DNA的相关性分析

目的探讨乙型肝炎患者血清标志物（HBV-M）与HBV-DNA的关系. 方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光定量-PCR （FQ-PCR）法对1 433例乙肝患者进行HBV-M以及HBV-DNA定量检测. 结果在HBsAg（＋） HBeAg（＋） HBcAb（＋）血清中HBV-DNA阳性率和含量最高,血清中HBeAg与HBV-DNA含量密切相关,但部分HBeAg阴性或HBeAb阳性患者也有较高的HBV-DNA阳性率及含量. 结论单凭血清免疫标志物模式难以准确判断HBV的复制程度及传染性的强弱,定量检测HBV-DNA能真实反映HBV的复制情况,对诊断、治疗乙肝患者及疗效观察具有较大的指导意义.     

HBV全基因C区突变株在永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达

目的 构建携带V60、G87和L97突变位点的HBV全基因组真核表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系（LCLs）。方法 用定点突变技术将HBVp3．8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60、G87、L97进行突变（p3．8Ⅱ-V60,G87,L97）,转化E．coli．XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶Sac I和Kpn I分别将野生型和突变型p3．8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBV-plpp真核细胞表达载体,转染LCLs,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞能够稳定表达。结果与结论 DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60、87、97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blotting和微粒子免疫荧光法证明转染的LCLs能稳定表达HBV抗原,证实成功构建了预期细胞模型。     

Apobec3B的真核表达及其抗HBV效应

目的：在真核细胞中表达Apobec3B,并探讨其在体外对HBV复制和表达的抑制作用。方法：应用RT-PCR法从人PBMC细胞中扩增Apobec3B基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Apo-bec3B,转染Hep G2 2.2.15细胞。W estern-blot鉴定细胞中Apobec3B蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,RT-PCR检测HBV DNA和HBV mRNA水平。结果：经酶切及测序鉴定pcDNA3.1-Apobec3B成功构建,Apobec3B蛋白可在Hep G22.2.15细胞中成功表达。转染pcDNA3.1-Apobec3B重组质粒的Hep G2 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg、HBV DNA及HBVmRNA水平均明显低于转染空载体组的Hep G2 2.2.15细胞。结论：成功在真核细胞中表达Apo-bec3B,其可明显抑制了Hep G22.2.15细胞中HBV的复制与表达,为深入研究Apobec3B抗HBV的作用机制奠定基础。     

慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与肝组织病理及免疫组化水平的关系

目的探讨慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与肝组织病理及免疫组化水平的关系。方法检测76例慢性乙型肝患者血清及肝组织外周血HBsAg，如BeAg和HBV DNA水平，常规病理和肝组织内的HBsAg，HBcAg。结果外周血中HBeAg阳性的患者中有91．49％HBV DNA阳性，而在如BeAg阴性的患者中，有58．62％的患者HBV DNA阳性，只有慢性乙型肝炎轻度患者的血清HBV DNA水平与其他各组差异有显著性（P〈0．05），而其余各组之间HBV DNA的复制水平均无明显差异，中度以上的血清HBV DNA多呈高水平分布。所有样本肝组织的HBsAg均为阳性，从肝组织不同HBsAg表达强度下，HBcAg表达的趋势来看，HBcAg有随着HBV DNA量的增加而表达增强的趋势。结论患者血清HBV DNA水平的变化可以反映HBV的复制水平而不能反应肝脏损伤程度。同时肝组织内的HBsAg检测更适合于低水平HBV感染的患者。     

Relationship between HBeAg and HBV DNA in patients with acute and persistent hepatitis B infection

The correlation between hepatitis B e antigen (HBeAg) and hepatitis B virus (HBV) DNA was studied in a number of hepatitis B surface antigen (HBsAg)-positive serum samples which had been submitted for routine hepatitis screening. In patients with either acute or persistent HBV infection, a good overall correlation between HBeAg and HBV DNA was noted, although in persistently infected patients with chronic liver disease, 28% of samples with hepatitis B e antibody (anti-HBe) were also positive for HBV DNA. Around 3% of the samples that were positive for HBV DNA were negative for HBeAg and anti-HBe while, conversely, 19% of HBeAg-positive sera were negative for HBV DNA. These results indicate that the presence or absence of HBeAg/anti-HBe may not necessarily reflect that of serum HBV DNA, particularly in persistent infection; this provides further support for the replacement of HBeAg/anti-HBe assays by detection of HBV DNA in the routine assessment of possible infectivity and chronic liver disease in HBsAg-positive patients.     

乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细胞内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

目的 :研究乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)人源单链可变区抗体 (ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用。方法 :用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBsAg人源单链可变区抗体 ,聚合酶链反应(PCR)法扩增HBsAg单链抗体基因 ,并构建表达HBsAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN HBsAgScFv,转染PA317细胞 ,将转染细胞分泌的假病毒颗粒感染 2 2 15细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg ,定量检测HBVDNA。结果 :成功筛选出HBsAgScFv ,PCR扩增出 75 0bp的全基因 ,构建HBsAgScFv基因的逆转录病毒载体 ,转染PA317细胞 ,在上清中检测出含HBsAgScFv假病毒颗粒的存在 ,上清感染 2 2 15细胞后第 3、5、7、14天 ,HBsAg、HBeAg逐渐下降 ,到第 14天时HBsAg已变为阴性 ,DNA定量检测无明显变化。结论 :HBsAgScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达 ,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用     

复方叶下珠胶囊体外抗乙型肝炎病毒作用的研究

目的研究复方叶下珠胶囊的体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。方法将HepG2.2.15细胞分为空白对照组、阳性对照组和不同浓度的复方叶下珠胶囊组,用CCK-8检测细胞毒性,酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg和HBeAg;荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞内、外的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）。结果复方叶下珠胶囊有明显的抗HBV作用,尤其当浓度为50mg/mL时,减少血清中的HB-sAg作用与拉米夫定组相当;当浓度为25 mg/mL,50mg/mL,和100mg/mL时,减少血清中HBeAg作用优于拉米夫定组;但是降低细胞内外的HBV DNA含量方面,与拉米夫定组无明显差别。结论体外试验中,复方叶下珠胶囊具有抗HBV作用。     

血清HBV-DNA检测的临床价值

选用分子斑点杂交法和多聚酶链反应（ＰＣＲ）观察１０７例疑为乙型肝炎患者ＨＢＶ－ＤＮＡ检出情况，分析ＨＢＶ－ＤＮＡ与ＨＢＶ血清抗原抗体标记物检出的关系，初步比较目前采用的这两种方去，认为分子斑点杂交法在应用中优于ＰＣＲ，值得推广。     

以S区为靶位的小干扰RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的以乙型肝炎病毒（HBV）S基因区为靶位,构建表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro,体外观察siRNA抗HBV的效果。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞,利用脂质体Metafectene转染表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro于细胞中,用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA法）检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,用定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测细胞上清DNA,用逆转录（RT）-PCR检测HBV mRNA。结果成功构建了表达siRNA的转录质粒载体,siRNA可抑制HBV的抗原表达和病毒复制,1、2、4μgsiRNA对HBsAg的抑制率分别为75％、82％、89％;对HBeAg的抑制率分别为32％、38％、43％;对HBVDNA的抑制率分别为30％、43％、49％;对HBVRNA的抑制率分别为30％、70％、90％。结论靶向HBVS区的siRNA能抑制HBV的抗原表达和复制;siRNA抑制作用呈剂量依赖性和序列特异性。     

应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和表达的影响。方法通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBV1.3建立小鼠急性乙型肝炎感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(pSI C)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg(ELISA),做肝组织HBcAg免疫组化,通过RT PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组。结果转染后第6天血清HBSAg在pHBV1.3感染组中高表达(A值为4.08～9.04,平均值为5.07±1.07,A值≥2.1为阳性),肝内HBcAg阳性率为5%～10%;pSI C干扰组HBSAg,HBcAg的表达均受到抑制,血清HBsAg阴性,A值为0.04～1.5,平均值为0.62±0.59,与感染组相比有显著性差异(P<0.01),肝内HBcAg几乎无表达,RT PCR示肝内HBVCmRNA水平明显降低。而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI Cmut则无此作用。结论RNAi技术能特异,高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达,提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能,而通过水动力法建立的小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,一定程度上解决了长期以来缺乏合适的HBV感染动物模型的问题,为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。     

Ad-1.2乙型肝炎病毒感染HepG2细胞后HBV cccDNA的动态分析

目的 研究Ad-1.2 HBV感染HepG2细胞后HBV的复制情况.方法 携带1.2拷贝FIBV DNA的腺病毒体外感染人肝癌细胞株HepG2,ELISA法检测培养上清中HBsAg、HBeAg的动态表达;利用质粒抽提试剂盒提取细胞内cccDNA,经绿豆核酸酶处理后,用特异引物进行实时定量PCR检测.结果 Ad-1.2HBV感染HepG2细胞后,可有效表达HBsAg及HBeAg;感染后第1天即可在细胞内检出cccDNA,第4天达到高峰.结论 Ad-1.2HBV感染细胞,可作为抗病毒药物筛选和评价的模型.