丙肝病毒核心蛋白抑制乙肝病毒转录与复制的实验研究

目的观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)对乙型肝炎病毒(HBV)基因转录和病毒复制的影响。方法将不同剂量的HCVcore表达质粒(pNKF-HC Vcore)转染HepG2.2.15细胞。以空载质粒(pNKF)转染HepG2.2.15细胞作为阳性对照,转染HepG2细胞作为阴性对照。以Northern吸印杂交检测HBV mRNA的转录水平,以Southern吸印杂交检测HBV复制中间体DNA的复制水平。结果20μg pNKF-HCV core转染HepG2.2.15细胞后,可使细胞中HBV mRNA转录水平及HBV复制中间体DNA复制水平明显降低,抑制率分别为51.9%及36.5%。10μg及15μg pNKF-HCV core较pNKF转染的HepG2.2.15细胞的HBV mRNA信号与HBV复制中间体DNA检出信号强度无显著差异。结论HCV核心蛋白达到一定的剂量后能够在一定程度上抑制HBV的转录与复制。     

乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制

目的 观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响.方法 应用高压射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northem印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平.结果 野生型HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制.结论 HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制.     

MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的 研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性.方法 将pcDNA3.1-MXA重组质粒和PU19-1.24 HBV重组质粒分别按1:1、2:1共转染HepG2细胞(MXA组),对照组使用空pcDNA3.1、Salon DNA和PU19-1.24 HBV重组质粒共转染,3 d后Western blot检测MXA蛋白表达,Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量,定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平,统计学分析结果 .pcDNA3.1-MXA与PU19-1.24HBV重组质粒共转染HepG2细胞,对照组为pcDNA3.1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染,3 d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达.结果 Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达;与对照组相比,pcDNA3.1-MXA和PU19-1.24 HBV重组质粒按1:1转染时,MXA组HBeAg下降27%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0.6个log值;按2:1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1.9个和1.7个log值,差异均具有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别.结论 MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性,抑制活性与蛋白的表达量相关;在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解.     

慢性乙肝重叠戊肝病毒感染临床分析及病毒间干扰

目的;探索慢性乙肝重叠戊肝病毒感染后其临床表现、肝功能及对ＨＢＶ的影响。方法：对３０例慢性乙肝重叠戊型肝炎病毒感染后对临床表现、肝功能以及ＨＢＶ复制指标（ＨＢｅＡｇ,ＨＢＶ－ＤＮＡ）与单纯乙肝和戊肝病人进行对比观察。结果：发现慢性乙肝重叠戊型肝炎病毒感染后其临床类型偏中,重型多,与单纯慢性乙肝,戊肝血清总胆红素,ＡＬＴ、ＡＳＴ比较明显增高,与单纯乙肝比较,ＨＢｅＡｇ和ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率显著降低,     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制

目的: 了解VP22融合型显性负性(DN)突变体对抑制乙肝病毒(HBV)复制的作用. 方法: 将VP22全长及其不同区段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C端,克隆入pcDNA3.1(-)构成DN突变体真核表达质粒. 转染HepG2.2.15细胞后,免疫荧光鉴定DN突变体在细胞内的表达,并以培养上清HBV表面抗原(HBsAg)的浓度为指标,观察DN突变体对HBV病毒复制的抑制效应. 同时以MTT比色法观察转基因的表达对宿主细胞生长状态的影响. 结果: VP22及其不同区段构建的DN突变体可在HepG2.2.15细胞中进行表达,且对宿主细胞无毒性. VP22融合型DN突变体可有效地抑制HBV的复制,具有蛋白转导特性的DN突变体比无转导特性的DN突变体具有更强的抗病毒能力. 其中VP22全长构成的DN突变体具有最强的抑制效应,可使上清HBsAg浓度下降81.94%. 结论: VP22融合型DN突变体可以增强DN突变体对HBV复制的抑制.     

MxA蛋白对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响

目的 分析比较α干扰素(IFN-α)、抗黏液病毒A(MxA)蛋白及IFN-α联合MxA蛋白对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 以肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞为细胞模型,以IFN-α、基因转染表达MxA蛋白及IFN-α与MxA蛋白联合等方式处理细胞,Western blot法检测M...     

靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的 设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法 以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mRNA和蛋白的抑制作用...     

热休克蛋白B1抑制HBV复制的研究

目的 探讨热休克蛋白B1 (heat shock protein B1,HSPB1)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 采用Western blot检测正常肝细胞系(HepRG)和HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中HSPB1的蛋白水平.在HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中转染pCMV6-HSPB1质粒及对照质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对HBV复制中间体表达的影响;qRT-PCR检测HSPB1过表达对HBV3.5 kb mRNA表达的影响;ELISA检测HSPB1过表达对HBV s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响.在肝癌细胞系Huh-7中共转染pCH9/3091和pCMV6-HSPB1质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对瞬时转染的HBV复制中间体表达的影响.结果 HSBP1在HepAD38和HepG2.2.15中的表达明显低于HepRG.HSPB1在HepAD38和HepG2.2.15细胞中成功过表达,在过表达HSPB1的HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体水平以及3.5 kb mRNA水平均降低,细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平也降低.HSPB1在转染pCH9/3091的Huh-7细胞中成功过表达,HSPB1过表达抑制了瞬时表达的HBV的复制水平.结论 HSPB1可以抑制HBV复制.     

乙型肝炎病毒感染相关疾病中病毒基因型和亚型的分布及其与临床指标的关系

目的:明确乙型肝炎病毒(HBV)基因型及亚型在上海及周边地区HBV感染相关的肝细胞癌、慢性乙型肝炎和HBV携带者中的分布,探讨不同基因型及亚型在HBV相关疾病发展进程中的作用.方法:通过多重PCR对462例肝细胞癌患者(HCC组)、234例慢性乙型肝炎患者(CHB组)和110例HBV病毒携带者(ASC组)进行HBV基因型及亚型的鉴定.结果:与CHB组相比,HCC组C型比例增高(P=0.009),B型比例下降(P=0.045),可见少量A、D型;基因型B均为B2亚型;基因型C以C2亚型为主(98.5%),可见少量C1亚型(1.5%).B2和C2型患者中,HCC组比CHB组HBeAg阳性率低(P=0.005,P=0.008),而抗HBe阳性率高(P=0.003,P=0.001).HCC组内混合型HBeAg阳性率最高,明显高于B2型(P=0.016).在40～60岁的HCC患者中,HBV DNA载量B2型＜C2型＜混合型(B2型vs C2型,P=0.029;B2型vs混合型,P=0.021;C2型vs混合型,P=0.041).结论:上海及周边地区HBV基因亚型以C2型为主,B2型次之,HCC、CHB及ASC人群中的基因型构成不同;混合型感染比单一基因型引起的病毒载量和HBeAg阳性率高,更容易导致HCC的形成.     

HBcAg检出与其他HBV标志的关系

本文采用固相放免法对94例慢性HBV无症状感染者血清作HBcAg检出并比较其它HBV标志物的关系。结果表明:血清HBcAg能直接反映HBV存在,其检测可作为人体内是否存在Dane颗粒及其复制程度标志,是反映HBV传染性的可靠指标。     

山东地区HBeAg阴性慢性乙肝和乙肝肝硬化构成比变迁和病毒基因型分析

目的了解山东地区HBeAg阴性慢性乙型肝炎（CHB）和乙肝肝硬化（LC-B）构成比变迁及基因型。方法采用回顾性研究方法,分析了1996、2001和2006年1～6月住院的全部CHB和LC-B患者共2?561例。采用特异性引物巢式PCR法,检测了220例山东籍CHB和LC-B患者的基因型。结果HBeAg阴性LC-B比例（50.0％）高于CHB（23.8％）,P=0.000。HBeAg阴性LC-B构成比由1996年的46.1％上升至2006年的54.4％,P=0.047。山东地区HBeAg阴性CHB和LC-B的C、B/C基因型分别为94.7％、5.3％和90.0%、10.0%,与HBeAg阳性患者无差异;未见B和其他基因型。结论山东地区住院患者中,CHB仍以HBeAg阳性为主;近年来,LC-B中HBeAg阴性患者超过50％。HBeAg阴性和阳性患者,均以C基因型占绝对优势;在HBeAg阴性患者中,未见B基因型。     

前S1抗原和HBV-DNA与HBV血清标志物之间的相关性探讨

目的 探讨前S1抗原和HBV-DNA与HBV血清标志物之间的关系.方法 对1158例慢性乙型肝炎患者用酶联免疫吸附试验(EUSA)检测HBV血清标志物和PreS1,聚合酶链反应(PCR)方法检测HBV-DNA.结果 1158例慢性乙型肝炎患者中HBV-DNA总阳性率68.9%,PreS1总阳性率54.8%,有显著性差异(X2=53.24,P<0.005).HBV-DNA、PreS1在HBeAg( )组的阳性率均明显高于HBeAg(-)组(HBV-DNA:X2=226.24,P<0.005;PreS1:X2=49.64,P<0.005).PreS1和HBeAg与HBV-DNA的总符合率分别为56.9%和63.3%,PreS1的敏感性高于HBeAg,但特异性则相反.随着HBV-DNA拷贝数的升高,PreS1和HBeAg的阳性率亦随之升高,HBV-DNA含量低时PreS1的阳性率明显高于HBeAg.结论 联合检测HBV血清标志物、PreS1,并动态监测HBV-DNA的含量,在观察慢性乙肝患者HBV复制、疗效时具有重要的临床应用价值.PreS1可作为HBeAg阴性、无条件开展HBV-DNA检测时的补充指标.     

慢性乙肝患者肝纤维化乙肝病毒复制水平的检测

目的探讨慢性乙肝患者肝组织纤维化与乙型肝炎病毒复制水平之间的关系。方法按HBV—DNA检测,分为阴性组94例、阳性组86例,采用核酸扩增荧光定量（FQ—PCR）检测HBV—DNA,放射免疫分析（RIA）检测肝纤维化标志物肝胆酸（CG）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原肽（PCⅢ）、四型胶原（Ⅳ—C）和层黏连蛋白（LN）。结果慢性乙肝患者HBV—DNA复制水平增高,血清肝纤维化标志物含量亦增高（P〈0．05,P〈0．01）。结论慢性乙肝患者乙型肝炎病毒复制水平增高可促使肝组织纤维化,抗病毒治疗、清除和控制病毒复制对阻止肝组织纤维化有益。     

HBV感染者HBV DNA载量与肝纤维化四项的关系

目的研究病毒性乙型肝炎(HBV)的HBV DNA载量与肝纤维化四项的关系。方法收集确诊的病毒性乙型肝炎患者266例,采用荧光定量PCR法检测患者血清样本HBV DNA载量,采用化学发光免疫分析法检测患者血清样本肝纤维化四项。结果 266例HBV感染患者中,HBV DNA阳性率为67%。乙肝病毒载量(血清HBV DNA)与各项肝纤维化指标无明显的相关性,差异均无统计学意义(P0.05)。结论HBV感染患者中,乙肝病毒载量与肝纤维化四项无明显的相关性。     

桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布研究

目的:研究桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布特点,为本地区乙型肝炎的防治提供依据.方法:采用巢式PCR技术扩增乙肝患者HBV的S基因,经测序后与标准序列比对,采用Mega 5.0构建系统树进行基因亚型分型.结果:从120例乙肝病毒患者中鉴定出3个以前报告的乙肝病毒亚型,序列分型B2 104例,占86.7％;B4 1例,占0.8％;B5 1例,占0.8％,其中14例未分出亚型,占11.7％.结论:桂林地区HBV B基因亚型主要以B2为主,其次为B4、B5,未发现B1、B3、B6亚型.     

慢性乙型肝炎病毒基因型与血清病毒载量的关系

目的探讨徐州地区慢性乙型肝炎（CHB）患者血清中乙型肝炎病毒（HBV）基因型与病毒载量的关系。方法采用型特异性引物多重PCR方法对徐州地区160例CHB患者的HBV进行基因分型，用荧光定量PCR方法检测HBVDNA水平。结果B型14例（8．7％），C型88例（55．0％），BC混合型51例（31．9％），未分型7例（4．4％），未发现A、D、E、F型。不同基因型之间HBVDNA载量无明显差别。结论徐州地区CHB患者中HBV基因型主要是C型和BC混合型，感染的HBV基因型与血清病毒载量之间无明显相关。     

双位点核酶细胞内抑制乙型肝炎病毒基因的表达

目的：构建针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｃ区基因（２０２９－３１及２０６３－６５位点）的双位点核酶的真核表达载体,观察其在细胞内对ＨＢＶ基因表达抑制作用。方法：利用亚克隆从质粒ｐＧＥＭＲｚ１２３切下ＥｃｏＲ－ＢａｍＨＩ片段,双粘端克隆于真核质粒ｐＢＢＳ２１２中,将该质粒与ｐ１．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）共转染ＨＨＣＣ细胞（人肝癌细胞株）。观察该核酶对ＨＢＶ基因表达的抑制作用。结果：在ＨＨＣＣ细胞中Ｐ１．２     

慢性乙肝患者血浆内毒素水平与HBV DNA定量变化关系及其机制

目的探讨慢性乙肝患者血浆内毒素(ET)水平与HBVDNA定量变化的关系及其机制。方法随机选取住院的慢性乙肝患者108例及HBV标志均为阴性的健康人15例,均严格无菌空腹采血,进行ET、T细胞亚群、HBVDNA定量等指标的检测。结果慢性乙肝患者随着血浆ET水平的升高,HBVDNA定量亦显著升高,P<0·01,但CD3、CD4、CD4/CD8均明显下降,P<0·05。结论慢性乙肝患者血浆ET水平升高,可致机体细胞免疫功能低下,从而使乙肝病毒持续复制,HBVDNA定量显著升高。     

快程序接种改善HBV阳性母亲子女的免疫效果

目的研究快速乙肝疫苗接种方案对HBV标志阳性母亲子女的免疫效果。方法健康受试者分3组,组1、3为HBV标志阳性母亲的子女,组2为正常母亲子女．组159名,年龄1h-12（5．3）a。组254名,年龄1h-13（4．8）a。组3（对照组）62名,年龄1h-13（5．5）a。组1和组2按快程序（d0、7、14）、组3按标准程序（mo 0、1、6）三角肌内接种10μgCHO乙肝疫苗。于首针接种后1、3、7、12、24和36mo分别查HBsAb滴度等。结果全程接种完成率三组（100％、100％和91．9％）接近（P〉0．05）。首针接种后1、3mo组1（81-3％、83．1％）和组2（96.3％、96.3％）HBsAb阳转率显著高于组3（3．2％、22．6％）（P〈0．01）,组2明显高于组1和组3（P〈0．01）;7—36mo各时段者组1和组3接近（P〉0．05）,均明显低于组2（P〈0．01）。血清HBsAb保护率3组间差异与HBsAb阳转率类似。首针接种后1、3moHBsAb几何平均滴度（GMT）组1（84．3IU／L、84．5IU／L）和组2（138．4IU／L、143．6IU／L）显著高于组3（2．7IU／L、28．2IU／L）（P〈0．01）,7-36mo各时段者组1和组3接近（P〉0．05）,均明显低于组2（P〈0．01）。3组中父亲为HB病人／HBsAg／HBV携带者的19名中6名无反应,8名弱反应,5名反应;父亲为HBsAb阳性者均有反应。结论快程序接种方便;HBsAb阳转率高,GMT峰值出现早;为儿童乙肝免疫理想方案．