心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用.方法 Western blot检测小鼠NOL3表达谱.构建αMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠.PCR 鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型.结果 NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变.通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加.单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化.结论 成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具.     

shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用

目的观察shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用。方法将质粒DNA采用Hydrodynamic技术注入HBV转基因小鼠体内,观察血清ALT和AST水平、血清HBsAg和肝组织HBcAg表达和HBVmRNA的变化。结果在注射质粒后,ALT和AST呈一过性升高,3天后降至正常;血清HBsAg和肝细胞内HBcAg表达减少,蛋白抑制至少持续14天;质粒注射后第5天,实验组肝脏HBVmRNA与注射前相比明显减少,而对照组HBVmRNA信号无明显变化。结论shRNA表达质粒对HBV转基因小鼠HBV有抑制作用。     

小鼠肝脏特异的微RNA在HeLa细胞中的转染与表达

目的观察miR-122在HeLa细胞内表达情况.方法将构建的miR-122真核表达质粒pAVU6 27-mir122以电穿孔法转染HeLa细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Northern杂交和点杂交验证miR-122在HeLa细胞中的表达.结果阳性转染细胞与小鼠肝脏细胞Northern杂交及斑点杂交均出现放射自显影,而转染空质粒的HeLa细胞则无放射显影.结论 miR-122在HeLa细胞中获得正确表达.     

微RNA对心脏发育影响的研究进展

近来研究表明，一类名为小RNA的非编码RNA分子掌握真核细胞许多功能，影响基因表达、细胞周期调控和个体发育等多种行为^[1-4]。小RNA是指21-28nt的调控RNA分子，主要包括①微RNA（miRNA），②小干扰RNA（siRNA），③其他小RNA：包括核糖体开关，反义核酸等非编码RNA。     

小鼠肝脏特异的微RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的利用分子克隆技术,构建微RNA(microRNA,miRNA)真核细胞载体.方法人工合成小鼠肝脏特异的微RNA(miR-122)前体基因序列,并添加酶切位点及polyT转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pAVU6 27中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-122真核表达载体(pAVU6 27-mir122).结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pAVU6 27上.结论 miR-122真核表达载体的构建,为进行真核细胞转染及miR-122表达的研究奠定了基础.     

WIF-1心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析

目的建立心脏特异表达WIF-1转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用。方法RT-PCR法克隆人WIF-1基因,把WIF-1基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转WIF-1C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Westernblot检测基因表达水平,超声检测不同月龄WIF-1转基因小鼠心脏结构及功能变化。结果建立了2个系的心脏特异表达WIF-1转基因小鼠。心脏超声检查证实,WIF-1转基因小鼠与对照小鼠比较,左心室重量减小,舒张期左室内径和容积变小,每搏输出量和心输出量减小。结论WIF-1基因是心脏功能的负调控因子。     

小肠RNA对小鼠辐射损伤修复的差异基因表达

0　引言　辐射外源核酸 (RNA,DNA)对受照小鼠肠腺的恢复作用已有文献报道 [1 - 3] .我们建立辐射模型后给予 RNA治疗 ,采集肠组织标本后用消减杂交基础上的 L D- PCR技术 ,观察外源小肠 RNA对受照小鼠损伤修复的差异基因表达 ,为进一步研究电离辐射对小鼠肠道损伤的修复机制奠定基础 .1　材料和方法1 .1　材料　 m RNA提取采用 Promega公司 Poly ATtract RSystem1 0 0 0试剂盒 ,反转录采用 SMARTTMPCR c DNA Syn-thesis Kit (Clontech) ,PCR产物纯化试剂盒采用 Promega公司 Wizard R Plus Minipreps DNA Purification…     

双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因小鼠抗病毒疗效的研究

目的探讨针对乙型肝炎病毒（HBV） X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法构建表达HBV X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用酶联免疫法检测血清HBsAg;用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量;用免疫组化法检测肝细胞HBsAg、HBcAg的表达;小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏常规病理切片,观察反义RNA对小鼠脏器的影响.结果小鼠血清HBsAg表达,pLXSN-asX组和pLXSN-asXP组均于第四周明显低于给药前,最高抑制率分别达24%、27%;其余组未出现明显变化.与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在pLXSN-asX组和pLXSN-asP组分别于第2周、第8周达到抑制高峰,抑制率均为58%;在pLXSN-asXP组于第1周、第8周出现两次抑制高峰,抑制率分别为66%、77%;其余组未出现明显变化.8周后,pLXSN-asX组、pLXSN-asP组和pLXSN-asXP组小鼠肝细胞HBsAg、HBcAg的表达显著低于其他组.小鼠脏器组织学观察未见异常.结论 HBV X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠有显著抗HBV作用,且在作用效率和作用时间上优于单靶区反义RNA.     

胸腺肽对HBV转基因小鼠表达HBV DNA的影响

应用胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠进行腹腔内注射（３ｍｇ／只）连续３个月，同时设促肝细胞生长素及生理盐水对照组，定期取血检测ＨＢＶＤＮＡ，结果发现胸腺肽组ＨＢＶＤＮＡ阴转率为２２％～５５％，停药２２ｄ后阴转率为２２％，而对照组小鼠ＨＢＶＤＮＡ无阴转，结果提示胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠表达ＨＢＶＤＮＡ有抑制作用。     

心脏特异表达人源FAM55A转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为研究该基因在心肌病发病中的作用提供模型。方法 Western blot检测FAM55A在野生型小鼠与cTnTR141W转基因小鼠心脏组织中的表达变化及其在野生小鼠的组织表达谱。克隆人源FAM55A基因入α-MHC启动子下游构建a-MHC-FAM55A表达载体,显微注射法建立FAM55A转基因小鼠。PCR鉴定转基因首建鼠的基因型。Western blot鉴定人源FAM55A在转基因小鼠心脏中的表达,超声检测转基因小鼠心脏的几何构型和功能。HE染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 FAM55A在野生型小鼠心脏中有少量表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达增加。建立了1个心脏组织特异表达人源FAM55A转基因小鼠品系。与野生型小鼠相比,FAM55A转基因小鼠的心脏收缩期和舒张期左室前壁从1月龄到5月龄持续增厚,3月龄转基因小鼠心脏射血分数和短轴缩短率稍有增强,1月龄和5月龄转基因小鼠心脏功能则与同龄野生型小鼠相比无变化。组织学检测显示,转基因小鼠心脏左室心肌细胞不均匀肥大,但不发生紊乱。结论 FAM55A在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达上调,建立了心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。     

黑素瘤抑制蛋白在转基因小鼠胚胎乳腺组织中的表达

目的：检测黑素瘤抑制蛋白（ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ）在小鼠胚胎乳腺组织中的表达。方法：剖腹分离出１０．５－１６．５ｄ的ＭＩＡ－ＣＤ／ＲＡＰ启动子－半乳糖苷酶（２．２１ｌａｃＺ）转基因小鼠胚胎,利用Ｘ－ｇａｌ全胚胎染色观察转基因的组织和细胞染色,并以免疫组织化学染色检测内源性ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ蛋白在胚胎乳腺组织叫的表达。结果：ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ在孕期１１．５ｄ的小鼠胚胎乳腺上皮细胞中开始表达,至１３     

心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠的心脏功能分析

目的建立心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠,研究Calponin 1对心脏发育及心肌病的调节作用。方法利用心脏特异启动子α-MHC构建转基因表达载体,显微注射法建立Calponin 1转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western Blot检测Calponin 1在心脏组织中的表达,心脏超声检测转基因小鼠的心脏结构和功能,HE染色和Masson染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 Calponin 1在野生型小鼠心脏中有表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏组织表达降低。通过显微注射法,建立了2个心脏组织Calponin 1基因高表达的转基因小鼠系。与野生型小鼠相比,Calponin 1转基因小鼠收缩期左室内径(LVID,systolic)增加28%(P<0.01,n=12),舒张期左室内径(LVID,diastolic)增加16.2%(P<0.01,n=12),收缩期左室后壁厚度(LVPW,systolic)减小15.7%(P<0.01,n=12),舒张期左室后壁厚度(LVPW,diastolic)减小21%(P<0.01,n=12),射血分数(ejection fraction,EF)降低11.5%(P<0.01,n=12),短轴内径缩短率(fraction shortening,FS)降低14.6%(P<0.05,n=12)。转基因小鼠心脏组织病理H&E染色和Masson染色显示,转基因小鼠心室扩张,心肌细胞不均匀肥大,细胞间隙变大,心肌间质纤维增多。结论 Calponin 1在心脏特异过表达引起转基因小鼠心脏左室内径增加,收缩期容积和舒张期容积显著增大,心室壁变薄,射血分数及短轴缩短率降低等扩张性心肌病表型,推测Calponin 1是参与心肌病病理发生的基因之一。     

微RNA对脊髓损伤小鼠恢复的影响

目的 研究微RNA(miRNA)对脊髓损伤模型小鼠恢复的影响。方法 查询、预测靶基因和miRNA并在293T细胞中验证;构建小鼠脊髓损伤模型并过表达miRNA,进行BBB评分,观察脊髓形态,检测标记基因及靶基因的表达。结果 miR-9、miR-124和miR-125在体外都能引起3个及以上靶基因的下调;miR-9和miR-124组小鼠脊髓钳夹伤口恢复较好;miR-9组小鼠运动功能恢复比对照组好,miR-124组比对照组差;miR-9组小鼠GFAP下调,MAP2和NeuN上调,靶基因GLIS3和CYBRD1下调。结论 脊髓损伤小鼠模型中,miR-9可能通过靶向下调GLIS3和CYBRD1促进脊髓损伤的修复。     

脑组织特异表达S100B转基因小鼠的建立

目的S100B在多种神经损伤性疾病中高表达,高浓度的S100B蛋白对中枢神经系统具有毒性作用。建立脑组织特异表达S100B转基因小鼠,用于研究该基因在帕金森病(Parkinson's disease,PD)发病中的作用。方法ELISA法检测S100B蛋白在α-synuclein A53T转基因小鼠脑组织中的表达情况。构建PDGF-hS100B表达载体,显微注射法建立S100B转基因小鼠。PCR鉴定转基因鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平。Rota-rod实验检测S100B转基因鼠的运动协调能力。结果S100B在9月龄和12月龄α-synucleinA53T转基因小鼠脑组织中的表达高于野生型小鼠。建立了2个品系的脑组织特异表达S100B转基因小鼠。与野生型小鼠相比S100B转基因小鼠表现出明显的进行性运动协调能力障碍。结论S100B转基因小鼠的建立为研究该基因在PD中的作用提供了工具。     

人bcl-xL基因在转基因小鼠中的整合和表达

目的研究人bcl—xL基因在显微注射所产生的子代小鼠中的整合、转录和表达情况。方法采用PCR和Southern blot方法检测人bcl—xL基因在小鼠体内的整合；RT—PCR方法检测它们的bcl—xL mRNA水平；用Western blot及免疫组化法检测目的蛋白的表达情况。结果在显微注射所产生的转基因小鼠中，有4只为Southern blot检测阳性，并且在这4只小鼠及其子代中均检测到人bcl—xL的mRNA和过表达的目的蛋白。结论由于在这些小鼠中既有外源基因的整合，又有其mRNA和蛋白质的表达，所以，它们是真正的转基因动物。     

条件性SV40 TAg转基因小鼠模型的建立

目的 建立可调控的脑组织特异性表达SV40 TAg的转基因小鼠模型.方法 构建由大鼠神经元特异性烯醇化酶基因(rat neuron-specific enolase, NSE)启动子驱动四环素基因表达调控系统的载体,从而控制SV40 TAg基因的表达;受精卵雄原核显微注射该线性化载体制备转基因小鼠;PCR方法鉴定首建鼠;RT-PCR方法检测小鼠组织中四环素反式激活子(rtTA)及SV40 TAg基因的表达情况.结果 显微注射获得17个首建鼠,其中的6个首建鼠建系成功;1#、6#品系小鼠的脑组织中表达rtTA基因;强力霉素诱导后,可检测到6#品系小鼠脑组织中SV40 TAg基因的特异性表达.结论 可调控的脑组织表达SV40 TAg的转基因小鼠模型已经建立.     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的 研究曲线精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法 选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白（pCMV－EGFP）表达载体，应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质料DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右，雄鼠与雌鼠合笼交配；分娩后3周，剪取仔鼠尾，提取基因组DNA，应用PCR、Southern blotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠，荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果 共注射41只雄性小鼠，存活34只，其中32只具有交配、受精能力，获得仔鼠382只。仔鼠经检测，PCR阳性133只，织冰冻切片中EGFP明显表达。结论 曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

Dkk3心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析

目的 建立心脏特异表达Dkk3转基因模型小鼠,研究Dkk3对心脏发育及和心肌病的调节作用. 方法把Dkk3基因插入心肌特异启动子α-MHC下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J Dkk3转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Northern blot检测Dkk3在心脏组织中的表达,HE染色和超声检查转基因小鼠心脏结构和功能.结果 建立了3个不同表达水平的Dkk3转基因小鼠品系.转入的Dkk3基因在心脏组织的表达水平均高于同龄对照小鼠.组织学分析显示Dkk3小鼠室壁变厚,心腔减小,心肌细胞排列轻度紊乱.超声检查显示心室壁变厚,收缩期容积和舒张期容积显著减小,射血分数,短轴缩短率增加.结论 Dkk3过表达导致转基因小鼠室壁变厚,心腔减小,心肌细胞排列轻度紊乱,心肌舒张功能轻度失调.