重组人高密度脂蛋白B族I型清道夫受体基因腺相关病毒血 清型2/1杂合载体的构建及其在HepG2肝细胞的表达

 【目的】 构建含绿色荧光蛋白(EGFP)重组人高密度脂蛋白B族I型清道夫受体(SR-BI)基因腺相关病毒(rAAV)2/1杂合载体,观察其在HepG2肝细胞的表达｡【方法】以pCMV.SPORT6-SR-BI质粒为模板PCR扩增目的基因cDNA,将其克隆至pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa载体中,经酶切及测序鉴定后,脂质体介导转染BHK21细胞,经G418筛选得到含SR-BI基因的BHK/SR-BI-IRES-EGFP载体细胞株,用携带rep2-cap1基因的辅助病毒(rHsv/r2cl)感染该细胞株｡通过细胞孵育､裂解和病毒纯化,得到杂合载体rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒｡免疫荧光显微镜检测绿色荧光表达,计算转染效率,Western Blot检测转染后SR-BI蛋白的表达｡ 【结果】 酶切鉴定表明pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP重组成功,基因测序显示装入pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa质粒中的SR-BI基因正确;成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒载体｡转染HepG2肝细胞后免疫荧光显微镜检测最佳MOI值为1 × 105时, 以此值转染HepG2肝细胞荧光高效表达; Western Blot检测未转染组及rAAV2/1-IRES-EGFP组HepG2肝细胞均有SR-BI蛋白表达,rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP组SR-BI蛋白表达水平较rAAV2/1-IRES-EGFP组及未转染组显著增加｡【结论】 成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP杂合载体系统,转染后SR-BI蛋白在HepG2肝细胞高效表达,为SR-BI生理学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础｡     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

B-Myb在肺癌中的作用与分子机制初探

【立论依据】 B-Myb是经典癌基因Myb家族的成员之一,其编码蛋白隶属于转录因子,在细胞周期和肿瘤发生发展过程中均具有重要作用。我们前期已发现,B-Myb在肺癌中表达异常上调,提示其在肺癌中具有重要作用,但其具体功能与分子机制仍不清楚,本课题拟对此进行研究。 【设计思路】 基于B-Myb在肺癌中表达上调,故选用“功能失活”策略进行研究。即:采用RNA干扰技术,抑制人肺癌细胞系H1299中B-Myb的高水平表达,构建B-Myb基因沉默稳定细胞株,分析B-Myb基因沉默后肺癌细胞的生长增殖、细胞周期和迁移侵袭能力以及全基因组基因表达谱的变化,由此初步揭示B-Myb在肺癌中的潜在作用与分子机制。 【实验内容】 首先,分别构建阴性对照和靶向B-Myb的RNA干扰质粒;然后,将上述质粒瞬时转染人肺癌细胞系H1299,结合嘌呤霉素抗性筛选和绿色荧光蛋白追踪,分别建立阴性对照和B-Myb基因沉默稳定细胞株,通过定量RT-PCR和蛋白质印迹技术检测确认B-Myb基因表达的抑制程度;最后,使用上述构建的稳定细胞株,分别采用MTT实验、流式细胞仪、软琼脂克隆形成实验、迁移侵袭实验对细胞的生长增殖、细胞周期分布、克隆形成能力和迁移侵袭能力进行分析,并通过基因芯片技术对全基因组基因表达谱进行检测。 【材料】 人肺癌细胞系H1299、细胞培养基、RNA干扰质粒、转染试剂、定量PCR试剂、B-Myb抗体、基因芯片等。 【可行性】 理论可行性:本课题是依据大量文献、我们的前期研究结果以及经典的分子肿瘤学理论,经过严密论证而提出。技术可行性:本课题采用的实验技术均为经典和成熟的肿瘤分子生物学研究技术,指导教师提供全程指导。 【创新性】 采用“功能失活”策略,综合运用RNA干扰、稳定细胞株构建、细胞表型分析和基因芯片技术,以期首次初步阐明B-Myb在肺癌中的作用与潜在分子机制,目前国内外尚未见报道。     

基于MUC1细胞内段抗炎多肽的体外构建

【目的】 在前期证实粘蛋白1(MUC1)通过封闭TLRs信号通路抑制呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的呼吸道炎症的基础上,以TLRs细胞内段TIR结构域相互作用的结构特点为基础,通过生物信息学分析确定MUC1胞内段(MUC1 CT)抗炎多肽的候选区域,并构建各种候选区域的缺失突变体真核、原核表达载体,进而找出发挥抗炎作用的多肽片段,并在体外验证其抗炎效果。 【方法】 根据生物信息学技术预测分析MUC1 CT潜在的抗炎片段;构建MUC1 CT各种缺失突变体的真、原核表达载体,即pEGFP-C2-MUC1 CT mutants、pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants以及pET14b-MCS-SBP-EGFP-MUC1 CT mutants-TAT;转染pEGFP-C2-MUC1 CT mutants入A549细胞(来源于II型肺泡上皮细胞),利用荧光显微技术明确各绿色荧光蛋白标记的突变体蛋白的细胞内定位;转染pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants(无异常定位的突变体)入A549细胞,待MUC1 CT mutants高表达后,用RSV感染各组细胞一定时间后,使用ELISA方法测定细胞培养上清中TNF-α的水平,筛选发挥抗炎作用的多肽片段;在明确MUC1 CT的核心抗炎片段的基础上,转化pET14b-SBP-EGFP-MUC1 CT mutant入大肠杆菌(DE₃),体外表达并纯化含有穿透肽(TAT)的MUC1 CT突变多肽,预先与A549细胞孵育,再给予RSV感染,通过测定上清中的TNF-α的水平,进一步明确具有抗炎活性的片段。 【结果】 (1)通过生物信息学分析MUC1 CT,确定四处具有潜在抗炎活性的候选区域,分别是氨基酸位点7-14位,19-26位,36-40位,44-53位;(2)成功构建基于pEGFP-C2和pcDNA3-HA真核表达载体的四种缺失突变体的真核表达载体;(3)通过pEGFP-C2-MUC1 CT mutants明确各种突变体的细胞内定位情况;(4)利用pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants明确MUC1 CT的抗炎片段;(5)通过带有TAT的MUC1 CT突变多肽进一步证实该段的抗炎活性。 【结论】 MUC1 CT抗炎片段在体外实验中具有抗炎性。     

截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用．方法：通过反转录PCR方法获取人全长bid基因，再经PCR方法克隆得到截短型bid(truncated bid，tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体，脂质体法转染HeLa细胞，通过间接免疫荧光，电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况．结果：成功获得人bid基因，构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素(PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体(pcDNA3-tbid61，pcDNA3-PE-tbid61)．与对照组相比，在转染后12～48h内两种基因的表达均导致．HeLa细胞发生凋亡，且两活性相当，结论：截短型Bid及其融合蛋白可促进转染的HeLa细胞发生凋亡．     

SP1调控PIWIL1基因启动子转录活性研究

目的 克隆转录因子SP1编码序列,构建真核表达质粒PCDNA3.1-SP1,并研究其对PIWIL1基因转录活性的影响。方法 RT-PCR法从正常人外周血总RNA中钓取SP1基因的编码序列,插入至真核表达载体PCNDA3.1（+）,酶切及测序鉴定重组质粒。Western blot法分别验证重组表达载体的在COS-7细胞中的表达效应。分别将活性最高的PIWIL1基因启动子报告基因截短体（即核心启动子区域）、活性最低的PIWIL1基因启动子报告基因截短体,与SP1重组质粒共转染COS-7细胞,利用Dual-Luciferase reporter assay system测定不同启动子活性区的PIWIL1基因转录活性的改变,同时应用光辉霉素A下调SP1的表达来进一步验证SP1对PIWIL1活性的影响。结果 酶切及测序鉴定结果显示SP1表达质粒构建成功,Western blot法结果表明重组SP1表达载体能有效表达于COS-7细胞,过表达SP1可明显提高PIWIL1不同活性区的启动子的活性（P<0.05）。结论 外源性SP1真核表达载体转染能有效表达于COS-7细胞,并对PIWIL1的转录活性起着上调的作用,提示SP1可能是PIWIL1转录活性的正调控元件之一。     

全长及细胞内磷酸化位点缺失的人组织因子真核表达重组质粒的构建及其生物学功能

目的： 研究组织因子(tissue factor,TF)细胞内区域的功能,分析TF细胞内区域对人乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的影响。方法： Trizol一步法抽提人乳腺癌细胞MDA-MB-231总RNA,RT-PCR扩增TF全长(TF full-length)基因和TF细胞内磷酸化位点缺失(TF truncated)基因,分别克隆入pGEM-T载体,再构建人TF full-length基因和TF truncated基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated。将构建好的pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated瞬时转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达,并用发色底物法检测瞬时转染后TF的促凝血功能。利用Transwell小室检测转入人TF full-length基因和TF truncated基因后MCF-7细胞的迁移能力。结果： 扩增出人TF full-length基因和TF truncated基因,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),并且在MCF-7细胞中表达后具有促凝血活性。瞬时转染pcDNA3.1(+)-TF truncated不能增加MCF-7 细胞的迁移能力,而转染 pcDNA3.1(+)-TF full-length后可以显著增强MCF-7细胞的迁移能力。结论： 成功构建了带有人TF full-length,TF truncated基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated,为研究TF以及其细胞内磷酸化位点区域在肿瘤学中的作用奠定了基础。     

PPARγ通过结合脂肪因子Vaspin基因启动子促进其表达

【立论依据】 内脏脂肪组织丝氨酸蛋白酶抑制剂Vaspin是2005年首次从自发性T2DM肥胖大鼠脂肪组织中分离得到的一种cDNA片段,人体内脏脂肪组织中也有表达,在代谢性疾病中起代偿作用。PPARγ与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗关系密切,PPARγ激动剂罗格列酮能使体外培养的3T3-L1 前体脂肪细胞Vaspin mRNA的表达上调。因此提出假设,PPARγ与Vaspin基因启动子上的某一基因片段结合从而发挥促进Vaspin表达的作用。 【设计思路】 首先测定3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化过程中PPARγ与Vaspin的蛋白表达谱,比较两者是否有相同变化趋势。然后构建Vaspin启动子-PGL3(含荧光报告基因)质粒和PPARγ-pcDNA3.1(+)质粒,转入293细胞,检测PPARγ是否使报告基因表达。再用启动子截短试验、结合位点的核苷酸点突变结合Gel mobility shift和荧光报告试验确定与Vaspin启动子结合的位点。 【实验内容】 首先在3T3-L1 细胞诱导分化过程的第0、2、4、6、8天,用蛋白质印迹法测定PPARγ与Vaspin的蛋白表达谱。再PCR扩增小鼠Vaspin 启动子-1200bp的DNA序列,用Cloning方法构建Vaspin启动子-PGL3质粒和PPARγ-pcDNA3.1(+)真核载体,转染入293细胞中,检测PPARγ能否使报告基因表达,再分别加入PPARγ激动剂和抑制剂,检测报告基因表达是否增加和减少。再用启动子截短试验,确定PPARγ与Vaspin启动子结合的位置区间。最后利用结合位点的核苷酸点突变结合Gel mobility shift和荧光报告试验确定PPARγ与Vaspin启动子结合的位点。 【材料】 3T3-L1细胞,293细胞,小鼠全基因,PGL3质粒,pcDNA3.1(+)质粒,PPARγ激动剂,PPARγ抑制剂。 【可行性】 文献提示PPARγ可能对Vaspin的表达起促进作用。实验平台为复旦大学分子医学教育部重点实验室,设备优良齐全。所需的各项实验技术和材料均已得到成熟广泛的应用。指导教师在脂肪细胞分化中的基因转录调控方面研究经验丰富,课题组成员具备优良的基础医学知识水平和实验操作水平。 【创新性】 目前国内外无任何研究证实PPARγ对Vaspin的表达有直接促进作用,也无相关机制的报道。本实验成果不仅是Vaspin表达机制的新发现,还是对PPARγ功能的新补充,能够为2型糖尿病和肥胖等代谢性疾病的预测和治疗提供新靶点。     

构建一种新型穿膜活性hMsrA的酵母表达体系

【目的】 当机体代谢生成的活性氧簇超过了抗氧化系统的清除能力,可引起氧化应激而与心血管疾病、炎症、肿瘤等发生密切相关。甲硫氨酸亚砜还原酶A (methionine sulfoxide reductase A, MsrA)能够特异还原被氧化的甲硫氨酸, 是细胞内一道重要的蛋白抗氧化防御屏障。导师课题组曾构建大肠杆菌表达系统并获得人源性MsrA(hMsrA),证实其在体外的抗氧化作用。本课题试图利用酵母表达体系表达一种具有细胞穿膜活性的分泌型Pep-1-hMsrA,为进一步研究 MsrA 对细胞的抗氧化保护机制奠定基础。 【方法】 利用基因克隆技术,合成含有细胞穿膜肽的pUC19/pep-1载体,双酶切将Pep-1序列连接到pET28a/hMsrA质粒上,构建pUC19/pep-1-hMsrA,再双酶切亚克隆到酵母表达载体获得pPICZ9k/pep-1-hMsrA重组质粒。经线性化的质粒电转化导入毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选、PCR鉴定拷贝数,构建新的hMsrA酵母表达体系。经甲醇(0.5%V/V)诱导表达,SDS-PAGE鉴定发酵液中Pep-1-hMsrA融合蛋白的产量,利用Ni-NTA Agarose亲和层析分离纯化目的蛋白,蛋白质印迹法鉴定融合蛋白的细胞穿膜效率,利用特异荧光底物鉴定融合蛋白的催化活性。 【结果】 成功构建pPIC9k/Pep-1-hMsrA重组质粒,并筛选出17株表达Pep-1-hMsrA的GS115工程株。诱导表达并纯化的目的蛋白产量约为30~40 mg/L,SDS-PAGE显示MW为约50 kD的单一条带,糖染色表明目的蛋白糖基化。蛋白质印迹法鉴定纯化蛋白有免疫原性,并具有特异还原活性。 【结论】 建立了Pep-1-hMsrA重组蛋白的酵母表达体系,纯化的Pep-1-hMsrA存在高度糖基化可能影响其催化活性,有待进一步研究此MsrA融入蛋白的结构与功能。     

miRNA-145调控靶基因c-Myc抑制胃癌增殖、侵袭

目的 探索microRNA145（miR-145）对胃癌细胞增殖活性的影响,及与其靶基因c-Myc的调控关系。方法 选取人胃癌细胞株SGC-7901作为研究对象,并向细胞株内转染miR-145模拟物和miR-145阴性对照物,荧光显微镜观察、Q-PCR检测转染后细胞株miR-145的变化,并通过细胞软琼脂克隆增殖实验和MTT实验检测转染后SGC-7901细胞株的增殖能力、Transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力。Western blot法检测转染后SGC-7901细胞株中c-Myc蛋白的表达情况。结果 转染后,miR-145模拟物组中miR-145的表达明显高于miR-145阴性对照和空白组,转染miR-145模拟物后SGC-7901细胞增殖能力显著降低（P<0.05）,c-Myc蛋白表达也明显较低（P<0.05）。结论 miR-145能通过抑制靶基因c-Myc的表达,抑制胃癌细胞的增殖与侵袭能力。总之,miR-145可能在胃癌中发挥抑癌基因的作用,是胃癌潜在的早期诊断指标和治疗靶点。     

比格犬ERβ1293 基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的 观察比格犬Myc 标签ERβ₁₂₉₃重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法 以pEGFP-N1-ERβ₁₂₉₃重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ₁₂₉₃基因编码区全长。Myc标签ERβ₁₂₉₃重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western blotting）和间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence, IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ₁₂₉₃在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ₁₂₉₃重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ₁₂₉₃编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。     

宿主因子NF90调节流感病毒复制的研究

【目的】 研究流感病毒的宿主因子NF90对流感病毒复制的影响。 【方法】 从 293T细胞中提取总RNA,以Oligo(dT)反转录cDNA。根据Gen Bank 中NF90的基因序列,设计上下游引物。以转录出的cDNA为模板扩增出NF90基因。用EcoR I 和Not I两种核酸内切酶对NF90 PCR扩增产物和PCDNA3.1-V5-HIS载体进行双酶切,酶切产物用高效DNA连接酶连接,然后鉴定选取正确的重组质粒,并命名为PCDNA3.1-NF90-V5-HIS。把PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至293T细胞,转染36 h后感染流感病毒A/WSN/1933 Moi 0.01,感染16 h后提取293T细胞的总蛋白,用蛋白质印迹法检测PCDNA-NF90-V5-HIS 重组质粒和流感病毒NP蛋白的表达。 【结果】 PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至细胞后,NP蛋白表达下降,流感病毒复制减弱。 【结论】 宿主因子NF90可以抑制流感病毒的复制。     

慢病毒载体法建立乳腺癌GFP-ST3稳定细胞株

目的 慢病毒载体法建立乳腺癌GFP-ST3稳定细胞株。 方法 采用PCR扩增α2,3-ST全长基因片段,克隆至慢病毒载体进行测序分析,将重组慢病毒载体转染人乳腺癌细胞,嘌呤霉素抗性筛选,经荧光显微镜观察、实时定量PCR、Western blot检测α2,3-ST的表达。 结果 成功构建了慢病毒载体pGLV5-H1-GFP-ST3,体外转染乳腺癌细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,α2,3-ST mRNA表达和蛋白水平均明显升高(P<0.05),获得稳转细胞株。 结论 成功构建了绿色荧光蛋白为报告基因的α2,3-ST慢病毒载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究乳腺癌细胞膜连α2,3-唾液酸水平增高与其侵袭和转移潜能的调控提供实验模型。     

巨噬细胞特异性表达载体的构建及鉴定

目的 构建巨噬细胞特异性白喉毒素受体过表达载体并检测其在巨噬细胞中的表达情况。方法 将白喉毒素受体基因Hbegf克隆入pcDNA3.1载体中扩增Hbegf与BGHpolyA尾片段,与克隆入 pUCm-T载体中的巨噬细胞特异性启动子相连接,分别转染巨噬细胞与其他细胞,通过荧光定量PCR鉴定其表达情况。结果 特异性表达载体通过测序以及酶切鉴定构建成功,在巨噬细胞中的表达高于未转染的巨噬细胞以及转染的非巨噬细胞。结论 构建了巨噬细胞特异性表达人白喉毒素受体载体,瞬时转染后可在巨噬细胞中特异性表达白喉毒素受体,为动脉粥样硬化易损性斑块的建立以及斑块内与凋亡相关的其他研究提供了一定依据。     

人疱疹病毒6型DR7蛋白在神经胶质瘤发生中的作用研究

【立论依据】 神经胶质瘤是人类最常见的颅内原发性肿瘤,恶性程度高,对人类健康造成严重威胁。近年来有关神经胶质瘤和病毒感染相关的证据逐渐增多。人疱疹病毒6型 (human herpesvirus 6, HHV-6)是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA病毒,分为HHV-6A和6B两个亚型。HHV-6是一种肿瘤相关病毒,近年来国内外文献均报道在胶质瘤标本中 HHV-6DNA和蛋白的阳性率明显高于对照组,表明HHV-6感染在神经胶质瘤的发生中具有重要作用,但是起关键作用的病毒基因及机制仍不十分清楚。HHV-6 DR7基因是潜在的转化基因,其表达产物是一种转录激活子。文献报道DR7蛋白能导致NIH3T3细胞体外转化以及裸鼠皮下成瘤,DR7蛋白还可以和肿瘤抑制基因p53结合导致p53功能缺失。为探究 DR7在神经胶质瘤发生中的作用,我们通过免疫组化检测了神经胶质瘤组织中DR7的表达,发现神经胶质瘤组织中DR7的阳性率明显高于瘤旁及正常组织。 【设计思路】 首先明确DR7蛋白对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和转移的影响,然后深入研究引起上述变化的分子机制,并在体内进一步证实DR7蛋白对神经胶质瘤肿瘤形成能力的影响。 【实验内容】 (1)构建 DR7过表达载体,建立DR7过表达稳定转染细胞系。(2)细胞水平上研究DR7蛋白对细胞增殖,侵袭和转移等生物学功能的影响。(3)运用基因芯片,real-time PCR和蛋白质印迹等技术确定引起上述变化的机制。(4)体内验证DR7蛋白对神经胶质瘤细胞肿瘤形成能力的影响。 【材料】 HHV-6标准株,U87细胞株,real-time PCR试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体,裸鼠。 【可行性】 (1)理论依据充分。HHV-6是嗜神经的DNA病毒,可长期潜伏于中枢神经系统。潜伏期的HHV-6基因组可整合于宿主染色体,一旦宿主免疫力下降则再激活,激活的HHV-6表达多种病毒蛋白,其中DR7是具有反式激活能力的转化基因。(2)有前期结果。我们已成功建立了DR7过表达稳定转染细胞系,MTT和Transwell实验均表明DR7蛋白能明显促进U87细胞的增殖和侵袭。 【创新性】 本研究基于临床,运用分子生物学的相关技术,首次研究HHV-6DR7在神经胶质瘤发生发展中的作用,将为神经胶质瘤的预防及治疗提供新靶点。     

乙肝病毒截短型中蛋白表达载体的构建及反式激活作用的研究

目的:构建含有不同长度的乙肝病毒(HBV)截短型中蛋白的表达载体,并研究其反式激活作用。方法:设计引物扩增两条不同长度的HBV截短型中蛋白基因片段,分别定向克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组表达质粒pcS2与pcTS。重组子经HindⅢ单酶切、PCR及测序鉴定。将测序正确的重组子与报告质粒pGL3-control共转染肝癌细胞系HepG2,检测荧光素酶表达强度。结果:构建了两种HBV截短型中蛋白基因的表达质粒pcS2与pcTS,通过共转染证明均具有反式激活作用,且pcS2反式激活作用强于pcTS(P<0.01)。结论:成功构建了具有反式激活作用的重组表达载体,并证明HBV截短型中蛋白发挥反式激活作用的关键区段在前S2区。     

稳定表达外源性p16基因肝癌SMMC-7721细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达外源性p16基因的肝癌SMMC-7721细胞株。方法利用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3．1( ),将外源性p16基因转染入此基因表达下调的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中,经G418筛选,建立稳定表达的细胞株,用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫组织化学法鉴定p16基因的表达,同时对细胞株分泌蛋白进行活性检测。结果转染p16基因的SMMC-7721细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达。结论建立稳定表达P16抑癌蛋白的SMMC-7721细胞株有助于研究p16抑癌基因在肝癌发生中的作用。     

靶向/促穿膜双功能肽介导的肿瘤靶向基因递送系统的构建及其抗肿瘤作用研究

【立论依据】 基因治疗(gene therapy)现已成为攻克肿瘤最具潜力,也是研究最活跃的领域,许多学者为基因治疗能成功应用于临床进行了大量相关研究。要成功地实施基因治疗,必须具备3个关键因素:针对性的治疗基因;基因传递系统;基因表达调节系统。基因传递系统是基因治疗的核心技术,而转染效率与细胞毒性相矛盾、稳定性与穿膜能力相矛盾以及靶向性差,是基因递送系统存在的3个关键问题。本课题旨在为肿瘤的基因治疗寻找到一种兼具高转染效率、高肿瘤细胞和组织特异靶向性及良好安全性和体内外稳定性的基因递药系统。 【设计思路】 首选通过将低分子量聚乙烯亚胺(LMW-PEI)连接到能形成单分子聚合物胶束的普朗尼克(Pluronic)表面,制得PEI衍生物;然后采用固相法合成兼具靶向和促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),其中DR5短肽对正常细胞无毒副作用、对肿瘤细胞具有高特异性和高选择性且自身具有抗肿瘤活性,TAT是具有促细胞穿膜作用的穿膜肽;再利用SMCC法将D21与Pluronic-PEI偶联,构建肿瘤靶向纳米基因载体递送系统(D21-Pluronic-PEI),并对其体内外性能进行评价。 【实验内容】 (1) Pluronic-PEI的合成,DNA/Pluronic-PEI纳米胶束的制备及其性能考察;(2) D21-Pluronic-PEI的构建及其性能考察; (3)载p53的靶向纳米非病毒基因给药系统 (p53/D21-Pluronic-PEI)的制备及其体内靶向特性和抗肿瘤效果评价 【材料】 分支状聚乙烯亚胺Pluronic 123 (Mw=2000 Da),DR5短肽,细胞穿膜肽TAT,p53等。 【可行性】 项目组有一定的专业基础,具有较强的创新意识和研究探索精神,具备开展该项目的素质与能力。该实验设计思路新颖、制定的项目方案切实可行,具有可靠的实施条件,可以保证该训练计划实施成效。项目组所在学校对学生实践创新及实验实训一贯积极支持和鼓励,匹配经费到位,配套扶持政策完善。因此,项目开展所需的人员、场地、实验设备、材料和经费等条件均可以保证。 【创新性】 (1)本课题拟采用不同PO/EO比的Pluronic连接低分子量PEI,并在此基础上合成具有可实现肿瘤靶向和具促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),将其与所得的PEI衍生物偶联,得到高效、低毒的新型基因靶向载体系统 (D21-Pluronic-PEI),该研究国内外尚未见报道。(2)重组人p53腺病毒注射液已应用于临床,但该药选择的载体为病毒基因载体-5型腺病毒,本课题拟采用高效,低毒且可主动靶向肿瘤细胞的新型聚阳离子载体系统(D21-Pluronic-PEI)作为p53载体,拟为p53的应用开辟新途径,国内外未见相关报道,具有潜在的应用价值。     

磷酸酶基因PTEN对骨肉瘤细胞凋亡机制研究

目的 探讨肿瘤抑制基因PTEN对人骨肉瘤细胞系MG-63细胞凋亡的影响及其分子作用机制。 方法 将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP),转染MG-63细胞系,流式细胞仪分析转染效率及细胞凋亡率,半定量RT-PCR检测PTEN mRNA水平变化,Western blot法检测PTEN蛋白表达,试剂盒检测caspase-3、caspase-7、caspase-9蛋白活性。 结果 以感染复数为100,转染MG-63细胞2天后腺病毒感染效率即达93.2%±4.7%。转染PTEN基因5天后,细胞凋亡率为29.8%,细胞形态出现明显凋亡改变。分子学检测结果显示转染PTEN基因后,PTEN mRNA及蛋白表达明显升高;caspase-3、caspase-7、caspase-9蛋白活性明显增加。 结论 PTEN基因可能通过提高caspase-3、caspase-7、caspase-9活性,诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡。     

蛋白酶体β5亚单位过表达对氧化环境下人晶状体上皮细胞的影响

 【目的】探讨蛋白酶体筇亚单位（PSMB5）基因过表达对氧化条件下晶状体上皮细胞的影响。【方法】构建重组质粒pcDNA3．1-PSMB5并将其转染人人晶状体上皮细胞株SRAO1／04中，形成稳定表达，同时设pcDNA3．1空载体为对照组。RT—PCR法及Western blot法分别检测PSMB5基因及蛋白的表达情况。H2O2分别作用PSMB5转染细胞及空载体转染细胞，MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】转染后用G418筛选3周后，获得PSMB5转染及空载体转染的G418抗性的细胞克隆。转染PSMB5基因的细胞PSMB5 mRNA表达强度明显增高．而空载体转染细胞与未转染细胞无显著差异：转染PSMB5基因的细胞的PSMB5蛋白表达也显著高于空载体转染细胞。低浓度H2O2作用后，转染PSMB5基因的细胞增殖能力高于空载体转染细胞。【结论】低浓度氧化环境下蛋白酶体历亚单位PSMB5过表达能对人晶状体上皮细胞具有保护作用。