沉默SIRT1基因对高糖诱导的系膜细胞NF-κB p65乙酰化

目的 探讨沉默信息调节因子1（SIRT1）对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞（RMC）核因子κB（NF-κB） p65蛋白乙酰化及单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达的影响。 方法 构建干扰SIRT1基因的shRNA慢病毒质粒pTRC-shSIRT1并进行鉴定。将RMC分为高糖组（用高糖培养液培养）、白藜芦醇（SIRT1激活剂）+高糖组（用含1 μmol/L白藜芦醇的低糖培养液培养24 h后,换用高糖培养液培养）、SIRT1 RNAi组（添加干扰病毒pTRC-shSIRT1感染4 h后,换用低糖培养液培养）、SIRT1 RNAi+高糖组（添加干扰病毒pTRC-shSIRT1感染4 h后,换用高糖培养液培养）,同时设正常对照组和甘露醇高渗对照组。以实时荧光定量PCR检测SIRT1、MCP-1的mRNA表达,蛋白质印迹法检测SIRT1和NF-κB p65乙酰化蛋白的表达,ELISA技术检测MCP-1蛋白含量。 结果 质粒测序证实干扰SIRT1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,且能抑制RMC中SIRT1基因表达（P<0.01）。高糖刺激使RMC SIRT1基因表达降低,NF-κB p65蛋白乙酰化增强,MCP-1 mRNA和蛋白水平增高;SIRT1激活剂白藜芦醇可逆转高糖引起的变化;而沉默SIRT1可促进高糖诱导的RMC NF-κB p56乙酰化及MCP-1 mRNA和蛋白表达（P<0.05或0.01）。 结论 SIRT1可抑制高糖诱导的RMC MCP-1表达,其机制可能与NF-κB p56去乙酰化有关。     

NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中作用的探讨

【立论依据】 呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关。建立感染RSV的支气管上皮细胞(NHBE)模型,检测NHBE的增值、凋亡情况及NF-κB的转位,阐明NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中的作用,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法和思路。 【设计思路】 建立感染RSV的NHBE模型,检测细胞增值、凋亡情况以及NF-κB是否转位,定性定量地探讨呼吸道合胞病毒(RSV)是否通过诱导NF-κB激活介导人支气管上皮细胞(NHBE)凋亡。 【实验内容】 培养人支气管上皮细胞(NHBE),建立并鉴定RSV感染NHBE的体外细胞模型(用定量RT-PCR法鉴定细胞模型是否成功;设正常组、水相处理组、RSV感染组,MTT比色法检测RSV对NHBE增殖的抑制作用,感染组以不同滴度分为1 000、500、100、50、10 TCID50 5个组,感染12、48、72、96、120 h);用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测RSV诱导体外培养的NHBE的凋亡;以免疫荧光法和蛋白质印迹法检测经RSV处理的人支气管上皮细胞NF-κB的激活和对细胞凋亡的影响。 【材料】 人支气管上皮细胞(NHBE)细胞;RSV A亚型原型株Long株;细胞胞浆胞核蛋白提取试剂盒;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒;兔抗NF-κB抗体;电泳仪。 【可行性】 (1)呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关,感染RSV的人支气管上皮细胞模型容易建立成功。(2)本组成员长期跟随老师进行呼吸合胞病毒、流感病毒的研究,具有一定的科研基础和实验能力。(3)所需试剂、仪器、材料,医学基础实验中心基本都有配备,学校同时具备SPF级实验中心。 【创新性】 (1)首次从NF-κB角度探讨感染RSV的NHBE模型,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法思路。(2)分别使用免疫荧光法和蛋白质印迹法定性与定量检测RSV是否通过诱导NF-κB激活介导NHBE凋亡。     

人去乙酰化酶SIRT1底物位点预测

【目的】 本研究相关的SIRT1去乙酰化酶属于NAD+依赖的非经典型组蛋白去乙酰基酶,和酵母中Sir2高度同源,其在生物进化进程中的高度保守性提示它们参与基本的生物学过程。研究表明,人SIRT1可催化p53蛋白去乙酰化从而抑制由DNA损伤引发的细胞凋亡,同时还可下调FOXO蛋白的转录活性来减少FOXO蛋白依赖的细胞凋亡;酵母中Sir2已经证实可阐释热量限制与长寿的联系。SIRT1的重要性引起研究者持续关注,因此希望能有快速简便的方法预测其底物位点来简化实验流程,这就促使我们试图建立一个有效的分类器,对于任意给定的一段含赖氨酸残基的短肽序列,判断其是人SIRT1底物位点的可能。 【方法】 我们从以往文献中查找到96个实验证实的SIRT1底物位点,通过分析去乙酰化修饰位点附近氨基酸序列的特征来建立分类器,但发现位点序列不具有明显的共性,仅利用序列信息建立的分类器对测试位点判断准确率最高只有56.77%。可见,位点序列信息并不能充分反映去乙酰化状态,所以我们在Gene Ontology数据库收集了更多的生物学信息:Biological Process(有相似生物通路的蛋白质更可能有相同的转录后修饰)、Cellular Component(亚细胞定位)、Molecular Function以及蛋白质之间相互作用等特征信息,然后整合生物学共性和序列信息并将所有位点聚类成组,每次用一组来训练或测试分类器,如果待测位点的这些信息与分类器重合度高就有可能是SIRT1底物位点,最后判断准确率显著上升至79.03%。之前有实验利用SIRT1敲除模型做质谱分析,筛选出乙酰化水平增高的位点作为SIRT1候选底物位点,我们的分类器预测的结果与此实验结果重合度很高,证实我们的分类器确实有效。 【结果】 整合功能信息后单个分类器准确率达79.03%;99个分类器准确率为93.57%;预测结果和实验结果高度重合。 【结论】 经验证我们的分类器效果显著,对预测SIRT1底物位点有较高的实用价值。     

抑制SIRT2介导的心肌程序性坏死改善衰老心肌的缺血耐受

【立论依据】 衰老心肌对缺血/再灌注(I/R)损伤的耐受力显著降低。并且,坏死是I/R心肌死亡最主要的病理途径,但以往认为心肌坏死不可调控。最新发现SIRT2介导的RIP1去乙酰化是触发程序性坏死(Necroptosis)这一可调控性细胞坏死的关键机制。 【设计思路】 本研究以成年和老年组为对比,结合基因和药理学干预,从整体,器官,细胞,分子四个水平进行功能验证, 旨在探讨衰老状态下SIRT2介导的心肌Necroptosis是否是老年心肌缺血损伤加重的新机制。 【实验内容】 采用成/老年C57小鼠建立整体心肌I/R(30 min/4 h)模型。分别于基础状态和I/R后检测各组心肌SIRT2表达水平及其活性;RIP1的乙酰化水平。采用免疫共沉淀方法检测RIP1-RIP3复合物(necrosome)水平;免疫组化方法检测下游分子MLKL的质-膜转位;再灌注后测定心肌梗死面积。采用成年SIRT2 KO和RIP3 KO小鼠建立心肌I/R平行实验,分析SIRT2介导的促坏死在心肌缺血易损中的关键作用。进而,采用心肌点注射腺病毒或siRNA 上调/下调成年和老年心肌SIRT2的表达,在整体水平明确衰老状态下心肌SIRT2对I/R心肌Necroptosis以及心肌损伤的影响。运用离体心脏灌流结合SIRT2特异阻断剂AGK2和Necroptosis抑制剂nec-1,建立成/老年小鼠离体心脏I/R模型。在器官水平探讨干预SIRT2介导的Necroptosis能否抑制衰老心肌死亡。再则,建立体外心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型,使用AGK2或nec-1处理细胞;采用细胞动缘探测系统观察单心肌细胞收缩舒张功能;流式细胞仪检测PI和Annexin V双阳性细胞定量检测心肌Necroptosis程度与细胞存活率。在细胞水平阐明干预SIRT2介导的Necroptosis促进衰老心肌存活的分子机制。 【材料】 成年(4个月龄)及老年(22个月龄)C57小鼠。 【可行性】 老年组I/R心肌SIRT2活性显著增高,RIP1乙酰化水平随之降低,necrosome水平升高,MLKL细胞质-膜转位增加(均P<0.05)。离体灌流实验发现,AGK2可有效抑制老年I/R心肌SIRT2活性,减小老年组心肌损伤。心肌细胞实验显示,抑制SIRT2介导的Necroptosis可提高H/R后心肌存活率(均P<0.05)。现有的实验结果表明本设计切实可行。 【创新性】 我们有望首次证实:SIRT2介导的Necroptosis加重是老年心肌缺血易损性增加的重要原因;针对性的抑制心肌SIRT2可显著改善衰老心肌抗I/R损伤能力。本研究将为降低老年缺血性心脏病患者的心肌损伤提出新的干预靶点。     

探究DATS通过调节ERK/NF-κB凋亡通路和诱导自噬而抑制宫颈癌的作用机制

【立题依据】 宫颈癌在发展中国家女性癌症中的死亡率居第二位,主要化疗药物顺铂存在耐药问题,使化疗遇到瓶颈,故需寻找新的有效化疗方案改善现状。研究发现大蒜素(allicin)及其代谢产物二烯丙基三硫化物(DATS)均对肿瘤生长有抑制作用,但DATS在宫颈癌中的作用未见报道。研究表明 DATS在诱导乳腺癌细胞凋亡中抑制了ERK表达,而ERK下调可减少NF-κB活化,且ERK和NF-κB在宫颈癌发生发展中起重要作用,故推测DATS可能通过ERK/NF-κB通路诱导宫颈癌细胞凋亡。Allicin在肝癌中可诱导自噬抗癌,但DATS能否通过自噬抗癌尚无报道。综上,课题探究DATS是否通过调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【设计思路】 通过体外实验明确DATS对宫颈癌细胞的抑制作用并探究其是否调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌;体内实验验证DATS调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【实验内容】 明确DATS对宫颈癌细胞的抑制作用,筛出敏感细胞系和最佳作用浓度及时间点;上下调ERK、NF-κB的表达,探究DATS是否通过调节ERK及NF-κB通路促进宫颈癌细胞凋亡;检测自噬小体形成率及自噬相关蛋白BAD,Beclin1的表达,并通过上下调其表达水平,探究DATS是否诱导宫颈癌细胞自噬;构建裸鼠移植瘤模型,验证DATS通过ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【材料】 HeLa、SiHa、CaSki细胞系,DATS,ERK、NF-κB、Bcl2及 GFP-LC3表达质粒,ROS、NF-κB及BAD抑制剂,3-MA,裸鼠。 【可行性】 理论可行:文献报道Allicin可抗癌,其代谢产物DATS也能抑制肿瘤生长。目前DATS在宫颈癌中的作用虽无报道,但发现DATS在乳腺癌细胞中抑制ERK表达,而ERK表达与NF-κB活化正相关,且ERK/NF-κB在宫颈癌中起重要作用。文献报道Allicin可诱导肝癌细胞自噬,但其代谢产物DATS是否通过自噬抗癌尚无报道。技术可行:课题所用实验技术,在本科室有扎实的技术支持,研究者已掌握大部分技术。 【创新性】 DATS对宫颈癌的作用及诱导ERK/NF-κB凋亡通路和自噬通路无报道,具有理论创新性;完善DATS的抑癌机制,为研发新抗癌药物提供理论基础,具有实践创新性。     

基于microRNA-92a-3p靶向SIRT1调控氧糖剥夺再灌注诱导脑微血管内皮细胞炎症反应的作用机制研究

目的 探讨基于microRNA-92a-3p（miR-92a-3p）靶向调控SIRT1氧糖剥夺再灌注（OGD/R）诱导小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）炎症反应的作用机制。方法 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定miR-92a-3p、SIRT1、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）mRNA的表达；Western blotting明确SIRT1、核转录因子-κB（NF-κB）p65、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）p65、TNF-α和IL-1β蛋白的表达；双荧光素酶报告基因验证miR-92a-3p与SIRT1靶向关系；划痕实验检测bEnd.3细胞的迁移能力。结果 OGD/R组miR-92a-3p相对表达量较对照组升高（P <0.05）。M_SIRT1 WT+mimics+TK组荧光素酶活性较M_SIRT1 WT+mimics NC+TK组低（P <0.05）。OGD/R组SIRT1蛋白和mRNA相对表达量较对照组降低（P <0.05），OGD+92a抑制剂组较OGD+92a抑制剂内参组升高（P <0.05）。miR-92a-3p模拟物组NF-κBp65/p-NF-κBp65蛋白较模拟物内参组高，SIRT1蛋白和mRNA表达较模拟物内参组低（P <0.05）。miR-92a-3p模拟物组IL-1β、TNF-α蛋白和mRNA相对表达量较模拟物内参组高（P <0.05）。miR-92a-3p模拟物组伤口愈合率较模拟物内参组低（P <0.05）。结论 miR-92a-3p通过靶向抑制SIRT1表达，促进OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞炎症反应。     

去乙酰化修饰调控瘦素诱导乳腺癌细胞增殖的分子机制

【目的】 研究去乙酰化修饰在瘦素(Leptin)诱导的乳腺癌细胞增殖过程中的调控作用。 【方法】 应用MTT法测定Leptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的诱导作用,并测定乳腺癌细胞活力、侵袭力及细胞周期的变化情况;实时定量PCR、蛋白质印迹法测定Leptin诱导后MDA-MB-231细胞周期关键因子及相关酶的表达情况;染色质沉淀法(ChIP)检测Leptin作用MDA-MB-231细胞后核心组蛋白H3、H4乙酰化水平变化情况。 【结果】 Leptin诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖呈现时间和剂量依赖性,1.25 nm (20 mg/mL)、24 h为Leptin最佳作用浓度和孵育时间;经Leptin处理后,乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡明显减少、活力增强,同时由G₁进入S期的细胞显著增多;荧光显微镜观察发现Leptin诱导后BrdU荧光染色增强,且主要集中在MDA-MB-231细胞核内;Transwell小室侵袭实验也显示细胞侵袭力增强;实时定量PCR及蛋白质印迹法检测 发现Leptin处理后的 MDA-MB-231细胞中与G₁/S 期限制点调控相关的细胞周期调控因子CDK2、cyclin E1以及与抑制细胞凋亡有关的Bcl-2均显著增加,细胞中HDAC酶活性增强,且与细胞周期G₁/S 期调控密切相关的HDAC1 mRNA及蛋白表达水平也明显增强;ChIP 实验发现Leptin处理后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中GAPDH 启动子区域核心组蛋白乙酰化水平显著降低,而经HDAC抑制剂SAHA阻断后MDA-MB-231细胞p21WAF 1/CIP 表达水平显著提高。 【结论】 Leptin通过HDAC1的去乙酰化修饰抑制p21WAF 1/CIP的表达,激活细胞周期关键因子CDK 2、cyclin E1的表达,从而加速乳腺癌细胞周期G₁/S 期的进程。     

去甲斑蝥素抗骨髓瘤作用及其机制研究

目的 探讨去甲斑蝥素（norcantharidin,NCTD）抗骨髓瘤作用及其相关机制。方法 MTT法检测NCTD对人骨髓瘤细胞株RPMI 8226增殖的抑制作用,并观察其对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测核因子-κB（NF-κB）p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制因子IkBα、磷酸化IkBα（p-IkBα）、IkB激酶α（IKKα）以及Survivin、Bcl-2、Bax蛋白表达水平,分光光度法检测Caspase-3活性,RT-PCR检测NF-κB mRNA表达。结果 NCTD抑制RPMI 8226细胞增殖,促进其凋亡;其剂量为20、40 mg/kg时对荷瘤小鼠的抑瘤率分别为29.8%、53.5%。NCTD抑制胞核NF-κB p65、p-NF-κB p65以及胞浆p-IkBα、IKKα的表达,增加胞浆IkBα的表达,对胞浆NF-κB p65的表达无显著影响。NCTD还抑制Survivin、Bcl-2蛋白的表达,促进Bax的表达和RPMI 8226细胞Caspase-3的活化,Caspase-3抑制剂能部分拮抗NCTD引起的RPMI 8226细胞凋亡（P＜0.05）。结论 NCTD对RPMI 8226细胞有抗增殖和促凋亡作用,其机制可能与NF-κB信号通路有关。     

白细胞介素-33对肿瘤组织中髓系抑制性细胞功能的调控及机制

【目的】 CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有强大的抑制T细胞的功能,是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸和促进肿瘤发展的重要细胞亚群,但其功能调控的分子机制尚不清楚。本研究目的是揭示肿瘤组织中白细胞介素-33(interleukin 33,IL-33)对MDSC功能的调控作用及其机制。 【方法】 给BALB/c小鼠接种4T1细胞,构建小鼠乳腺癌模型;用免疫荧光、定量PCR、免疫组化和ELISA等方法检测小鼠4T1和人乳腺癌组织中IL-33的表达水平;流式细胞术检测野生型和IL-33受体ST2敲除小鼠(ST2^-/-)肿瘤组织中CD11b⁺Gr-1⁺MDSC的比例,以及MDSC增殖和凋亡的水平;检测IL-33处理前后MDSC存活水平,以及精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)在mRNA水平以及酶活性上的变化;蛋白质印迹法检测IL-33处理后MDSC相关信号通路分子的改变,并用转录因子抑制剂进行验证,以揭示IL-33调控MDSC功能的关键转录因子。 【结果】 小鼠4T1和人乳腺癌组织中存在大量IL-33表达的现象;小鼠和人乳腺癌组织上清液中检测到高水平的IL-33。在小鼠肿瘤组织中,MDSC高表达ST2,其中45%的ST2⁺细胞为MDSC;ST2^-/-小鼠肿瘤组织中MDSC的数量比野生型显著减少(P<0.001);ST2^-/-小鼠肿瘤组织中的MDSC增殖显著减少,凋亡显著增多(P<0.05); 体外IL-33刺激能诱导MDSC增殖,减少凋亡;IL-33处理24 h后,Arg-1的mRNA表达及酶活性均显著增高(P<0.01)。IL-33处理后,MDSC的NF-κB和ERK的磷酸化水平明显增加,而加入转录因子抑制剂后,IL-33诱导MDSC上调Arg-1表达的效应显著降低(P<0.01),表明NF-κB和ERK对于IL-33调控MDSC的功能极其重要。 【结论】 证实肿瘤组织中高水平IL-33分泌可诱导MDSC增殖,促进其在肿瘤组织中的聚集,并上调MDSC表达Arg-1而增强其免疫抑制功能,NF-κB和ERK是IL-33作用于MDSC通路中至关重要的转录因子。研究结果为揭示肿瘤细胞免疫逃逸的机制提供了新的观点,并可能为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。     

乙酰化酶抑制剂Garcinol对雌激素促乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用与机制

目的 研究乙酰化酶抑制剂Garcinol对雌激素促乳腺癌细胞MCF-7增殖、细胞周期转化及凋亡抑制的影响及机制。 方法 应用CCK-8法检测Garcinol 对17β-雌二醇（17β-E₂）促MCF-7细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况;细胞免疫荧光检测NF-κB/p65核转运情况;RT-PCR检测cyclin D1、Bcl-2、Bcl-x_L mRNA水平;蛋白质印迹分析检测乙酰化（ac）-H3、ac-H4、NF-κB/ac-p65、cyclin D1、Bcl-2、Bcl-x_L 蛋白的表达水平。 结果 Garcinol能抑制17β-E₂促细胞增殖作用,使细胞周期阻滞于G₀/G₁期,细胞凋亡率增加（P<0.01）;17β-E₂促进MCF-7细胞ac-H3、ac-H4、NF-κB/ac-p65表达水平（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,Garcinol能抑制17β-E₂对ac-H3、NF-κB/ac-p65的表达促进作用（P<0.01）,对ac-H4影响无统计学意义;17β-E₂促进NF-κB/p65核转运相应受到Garcinol抑制（P<0.01）;17β-E₂促进cyclin D1、Bcl-2、Bcl-x_L的 mRNA转录和蛋白表达水平的作用受到Garcinol抑制（P<0.05）。 结论 17β-E₂促MCF-7细胞增殖和凋亡抑制作用与组蛋白和非组蛋白NF-κB/p65乙酰化水平增高有关,乙酰化酶抑制剂Garcinol 通过降低乙酰化水平对雌激素促乳腺癌细胞增殖具有明显抑制作用,降低NF-κB通路的ac-p65蛋白水平,从而下调cyclin D1、Bcl-2、Bcl-x_L可能是其重要机制。     

齐墩果酸对糖尿病小鼠胰岛损伤的保护作用

目的 观察齐墩果酸对糖尿病小鼠胰岛损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法 建立链脲佐菌素 (STZ) 诱导的糖尿病小鼠模型,ig 给予齐墩果酸3周。实验期间监测小鼠体质量、血糖的变化,实验结束后检测小鼠血清胰岛素浓度以及血清和胰腺中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 的活性以及丙二醛 (MDA) 的量。通过胰腺 HE 染色和胰岛素免疫组化分析胰岛的病理变化,应用 Western blotting 法检测胰腺组织中 NF-κB p65 和 IκBα 蛋白表达量的变化。结果 齐墩果酸能增加糖尿病小鼠的体质量,降低糖尿病小鼠的空腹血糖,升高血清中的胰岛素浓度,显著提高血清和胰腺中 SOD 和 CAT 的活性,MDA 水平显著降低。HE 染色等形态学检测显示齐墩果酸能减轻小鼠胰岛萎缩,增加胰岛β细胞的数目。Western blotting 结果显示齐墩果酸增加胰腺组织内 IκBα 的表达,降低 NF-κB p65 蛋白表达。结论 齐墩果酸能减轻 STZ 诱导的胰岛损伤,可能是通过减轻氧化应激水平,减弱胰岛内 NF-κB 信号通路的过度激活而发挥保护作用。     

MAPK和PI3K信号通路在胃癌中的作用及意义

【目的】 已有研究表明MAPK和PI3K信号途径是两条重要的抑制凋亡和促进增殖的转导通路,与癌症的发生发展关系密切,本实验通过检测在Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB在胃癌及癌旁组织的表达,探讨MAPK和PI3K信号通路在胃癌发展过程中的作用及意义。 【方法】 收集50对胃癌组织及其相应的癌旁组织,应用免疫组织化学技术检测胃癌及癌旁组织中Akt、Erk、Bcl-2和NF-κB蛋白的表达情况并进行分析。 【结果】 胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。 【结论】 胃癌的发生发展是一个多步骤、多基因突变的累积过程。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路是细胞内两条重要的促增殖和抗凋亡通路。PI3K-Akt信号通路在细胞内影响细胞生长、增殖、凋亡,丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)处于中心环节,活化的Akt可激活下游信号分子,包括抑制凋亡的Bcl-2蛋白和转录因子NF-κB。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与基因表达调控,细胞功能活动以及个各种生理病理过程。胞外信号调节激酶(ERK1/2)是哺乳动物中5条并行的MAPK信号通路之一,通过激活下游靶位,包括重要的转录因子NF-κB和细胞存活调节器Bcl-2,调控基因表达,从而发挥抑制凋亡的作用。本研究结果显示人胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,说明上调PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的活性与胃癌的发生发展过程密切相关。     

虾青素通过SIRT1/FOXO3a信号通路预防低渗性对比剂诱导的急性肾损伤的实验研究

目的 探讨虾青素（astaxanthin,AST）通过沉默信息调节因子（Sir2）家族成员之一的SIRT1/叉头框蛋白（FOXO3a）对碘海醇诱导的人肾小管上皮（HK-2）细胞氧化损伤的作用。方法 HK-2细胞株培养贴壁后随机分为对照组、二甲基亚砜（DMSO）对照组、碘海醇组、碘海醇+SIRT1抑制剂尼克酰胺（niacinamide,NA）组、碘海醇+FOXO3a siRNA组、碘海醇+低、高剂量虾青素（1.0、10.0μmol/L）组,继续培养然后应用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）的水平,蛋白免疫印迹法检测细胞中SIRT1及FOXO3a的蛋白水平。结果 与对照组相比,碘海醇组、碘海醇+低、高剂量虾青素组细胞存活率降低,并且随着碘海醇剂量的增加,抑制作用增强;虾青素组（在一定浓度范围内）可改善碘海醇对HK-2细胞增殖的抑制作用,一定范围内剂量增加,改善能力越强。加入碘海醇后,细胞内ROS水平明显增加,虾青素预处理后,ROS水平下调。碘海醇使SIRT1蛋白的表达上调,同时降低了叉头框蛋白（FOXO3a）的表达,虾青素可以拮抗这一作用,在一定浓度范围内,随着浓度增加,拮抗作用增强。碘海醇作用下,SIRT1抑制剂NA可以降低SIRT1的表达,增加叉头框蛋白的表达,FOXO3a siRNA使FOXO3a的表达下降,但对SIRT1的表达无明显影响。结论 虾青素可以对抗碘海醇诱导的HK-2的氧化损伤,其可能的机制与降低内皮细胞SIRT1的表达有关,且在FOXO3a的上游发挥对抗碘海醇诱导的氧化损伤作用。     

番茄红素对脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应的作用及其分子机制

 【目的】 探讨番茄红素对脂多糖(LPS)所诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子生成的影响及其作用的分子机制。【方法】 分别用1、5、10 μmol/L 的番茄红素孵育细胞1 h,再用1 μg/mL LPS 处理细胞不同时间,分别用Griess法和ELISA法检测RAW264.7巨噬细胞培养基中NO及IL-6的含量,用Western-blot检测核因子-κB(NF-κB) p65、磷酸化和非磷酸化I-κBα、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的蛋白表达量。【结果】 番茄红素能有效地降低炎性因子NO和IL-6分泌,进一步研究显示番茄红素能够抑制LPS诱导I-κBα磷酸化和降解、NF-κB核转移,阻断ERK1/2和p38 MAPK激活,而对JNK活化没有影响。【结论】 番茄红素能够通过抑制ERK1/2 和p38 MAPK信号通路的激活而抑制巨噬细胞NF-κB依赖的炎症因子NO和IL-6生成,这可能是番茄红素防治一些炎症相关性疾病的作用机制之一。     

p66Shc-线粒体信号通路在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡中的作用

【立论依据】 氧化低密度脂蛋白(oxLDL)可经线粒体途径诱导巨噬细胞凋亡并影响动脉粥样硬化斑块稳定性,但具体的分子机制尚未阐明。近有研究显示:在人内皮细胞,oxLDL可通过激活蛋白激酶C-β(PKCβ)与c—Jun氨基末端激酶(JNK)从而使衔接蛋白p66^Shc发生磷酸化;另有文献报道:磷酸化的p66^Shc可转位到线粒体引起线粒体损伤。本实验旨在探讨p66^Shc-线粒体信号通路在oxLDL诱导的人巨噬细胞凋亡中的作用。 【设计思路】 本实验分两部分:第一部分拟证明oxLDL可促进巨噬细胞中p66^Shc的磷酸化及线粒体转位;第二部分拟证明p66^Shc磷酸化及转位在oxLDL诱导的线粒体损伤、线粒体凋亡途径中起重要作用。 【实验内容】 采用序列超速离心法分离健康人新鲜血浆LDL,继而用CuSO4氧化制备oxLDL;体外培养THP-1细胞(人外周血单核细胞)并用佛波酯诱导为巨噬细胞,蛋白质印迹法检测oxLDL对p66^Shc及胞浆和线粒体中磷酸化p66^Shc(Ser36)蛋白表达的影响;而后将细胞分为对照组、oxLDL组及oxLDL+SiRNAp66^Shc组,用流式细胞仪及荧光显微镜检测线粒体膜电位、线粒体内超氧阴离子及细胞凋亡的变化,蛋白质印迹法检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达。 【材料】 采用含10%FBS的高糖1640培养液培养细胞;采用Rhodamine 123染色检测线粒体膜电位,MitoSOX Red试剂盒染色检测线粒体内超氧阴离子,AnnexinV FITC 试剂盒双染检测细胞凋亡;采用p66^Shc、phospho-p66^Shc( Ser36)、细胞色素C、caspase-9等抗体检测相关蛋白的表达。 【可行性】 我们前期预实验结果显示oxLDL可加速p66^Shc磷酸化和线粒体损伤,且两者呈正相关,这为该假说的成立提供了有力证据;实验负责人跟随导师进行科研工作两年,已熟练掌握相关实验技术;本实验承担单位泰山医学院动脉粥样硬化研究所具备实验所需全部仪器设备,实验条件完善。 【创新性】 本实验首次研究p66^Shc在oxLDL诱导的人巨噬细胞线粒体凋亡中的作用,可进一步阐明p66^Shc与AS发生发展的关系,从而为AS的防治锁定新靶点。     

NF-κB在氯胺酮致发育期大鼠皮质神经毒性中的作用

【目的】 文献表明NF-κB活化可上调Cyclin D1,异常启动细胞周期诱导神经细胞凋亡。课题组前期研究发现氯胺酮能上调未成熟神经细胞Cyclin D1的表达,且呈时间剂量依赖性,提示NF-κB在氯胺酮诱导未成熟神经毒性方面起重要作用。本研究通过体内和体外模型观察氯胺酮诱导的未成熟神经细胞凋亡过程中NF-κB活性的变化,探讨NF-κB在其过程中的作用。 【方法】 体内模型: P7SD幼鼠每90分钟经腹腔注射不同剂量的氯胺酮 (0、5、10、20 mg/kg)共5次,7.5 h后提取大脑皮质细胞浆蛋白及核蛋白。体外模型: E18胎鼠皮质神经细胞培养24 h,加入不同浓度的氯胺酮(0、1、10、100、1 000 μmol/L),作用不同时间(6、12、24、48 h)提取大脑皮质细胞浆蛋白及核蛋白。MTT法检测氯胺酮对E18胎鼠皮质神经细胞体外存活率的影响;蛋白质印迹法检测P7幼鼠皮质及E18胎鼠皮质神经细胞中核蛋白P65、P50和浆蛋白I-κB的表达水平。 【结果】 MTT法显示在体外模型中氯胺酮作用6 h后实验组神经细胞存活率与对照组无明显差异,作用12 h后100、1 000 μmol/L实验组神经细胞存活率低于对照组,作用24 h后10、100以及1 000 μmol/L实验组神经细胞存活率明显低于对照组,作用48 h后实验组神经细胞存活率均明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白质印迹结果显示在体内模型中10、20 mg/kg实验组细胞核中P65蛋白水平明显高于对照组,20 mg/kg实验组细胞核中P50蛋白水平高于对照组,10、20 mg/kg细胞浆中I-κB蛋白表达水平明显低于对照组。 体外模型中氯胺酮处理6、12、24、48 h的100、1 000 μmol/L实验组以及48 h后10 μmol/L实验组细胞核中P65水平高于对照组, 12、24、48 h的100、1 000 μmol/L实验组以及48 h的10 μmol/L实验组细胞核中的P50水平高于对照组,12 h的100、1 000 μmol/L实验组以及24、48 h的10、100、1 000 μmol/L实验组细胞浆中的I-κB表达水平低于对照组,以上实验组与对照组的差异都具有统计学意义(P<0.05)。 【结论】 在一定的剂量作用一定的时间情况下氯胺酮可以诱导未成熟神经细胞凋亡,其可能的机制之一是氯胺酮激活NF-κB,活化NF-κB迅速转移到细胞核内促进Cyclin D1表达,导致细胞周期异常启动从而导致神经细胞凋亡。     

胃癌细胞中VD3对NF-κB通路的影响机制及与萜类化合物协同作用探究

【立论依据】 NF-κB信号转导途径在调节细胞增殖、分化、凋亡中起到重要作用; IκB-α是调节NF-κB信号转导途径的核心蛋白;VD₃可以通过影响IκB-α、转录因子等方式抑制NF-κB信号转导途径的激活;萜类化合物是目前医药研究中很有前景的化疗药物,NF-κB的抑制可以增强其抗肿瘤效应。 【设计思路】 选取低分化、中分化胃癌细胞与正常胃组织细胞,给予其不同VD₃作用环境(时间、浓度),从mRNA、蛋白水平上测定NF-κB途径的表达活性。通过阻断VD₃和IKKβ的相互作用,研究VD₃调控IκB-α含量的主导因素。协同施用二萜类化合物--紫杉醇与VD₃,探究两者的协同作用与最佳浓度。 【实验内容】 (1)将人胃癌中、低分化的细胞株系与正常胃组织细胞(空白对照),并分别用10^-9、10^-8、10^-7mol/L培养0、4、16、24 h后用RT-PCR检测IΚB-α的mRNA含量变化,用western blot检测IΚB-α蛋白的含量变化,以ChIP检测NF-κB转录因子与DNA结合活性。(2)降低IKKβ与VD₃的结合活性,阻断VD3对IκB-α降解的抑制,定量检测IκB-α的蛋白质和mRNA含量。(3)以不同浓度比例、作用时间方式的紫杉醇与VD₃刺激胃癌胃癌,检测其存活率与细胞周期分布。 【可行性】 预实验中已证实VD₃可以使胃癌细胞中IκB-α含量上升,且刺激时间为4h的组中最为显著。 【创新性】 (1)VD₃的部分作用机制仍不明确。我们猜想VD3可能通过抑制NF-κB通路上某些具体的信号分子而发挥作用,并期望在胃癌细胞中得以验证。(2)VD₃可以通过促进IκB-α的生成以及抑制IκB-α的降解来提高其在细胞中的含量,从而抑制细胞周期。但是哪种因素占主导作用却鲜有研究。我们设计IKKβ抑制实验来探究影响IκB-α含量的主导因素,从而为更有效地调节NF-κB信号通路提供实验依据。(3)选用萜类化合物中的紫杉醇,利用NF-κB通路为其与VD₃作用机制的交叉点,进行探究。如果确认VD₃对紫杉醇杀伤癌细胞产生增敏作用,将对胃癌的临床化疗提供一种有效的治疗方案。     

氧化苦参碱对感染性休克大鼠心肌组织细胞因子的影响

目的 探讨氧化苦参碱对感染性休克大鼠心肌组织核因子-κB（NF-κB）等细胞因子的影响。方法 采用大鼠盲肠结扎穿孔法制备大鼠感染性休克模型。造模后56只SD大鼠随机分为假手术组,氧化苦参碱对照组,模型组,氧化苦参碱高、中、低剂量（52、26、13 mg/kg）组、地塞米松阳性对照（10 mg/kg）组,各组给药1次。采用RT-PCR法测定心肌组织NF-κB（p65）mRNA的表达;Western blotting法测定心肌组织NF-κB（p65）及IκB-α的表达;放射免疫分析法测定心肌组织匀浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-1β（IL-1β）量的改变。结果 氧化苦参碱能显著抑制大鼠心肌组织NF-κB（p65）mRNA的表达及NF-κB（p65）和IkB-α的活性（P＜0.05）,降低心肌组织匀浆中TNF-α及IL-1β的量（P＜0.05）。结论 氧化苦参碱能通过抑制NF-κB（p65）mRNA的表达及诱导NF-κB激酶（NF-κB-inducing kinase,NIK）的活化,抑制细菌、病毒等对NF-κB的激活作用,减少TNF-α、IL-1β等促炎因子的表达,进而对感染性休克大鼠心肌损伤性病变发挥治疗作用。     

SIRT1通过抑制NF-κB信号通路而抑制oxLDL诱导的VSMC源性泡沫细胞形成

目的探讨激活去乙酰化酶1(SIRT1)是否可以抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs向泡沫细胞转化,并且探讨NF-κB炎性信号通路在其中的调节作用。方法利用小鼠主动脉组织贴块法培养原代VSMCs;免疫荧光双标染色鉴定原代VSMCs;油红O染色定性检测细胞内脂质沉积; Western blot检测VSMCs中SIRT1、p-IκBα和NF-κB p65蛋白的表达情况。结果氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox LDL)刺激原代培养的VSMCs 48小时后,细胞内油红O染色阳性脂滴显著增加,差异有统计学意义(P<0. 05); ox LDL刺激VSMCs不同时间(6、12、24、48、72小时)后p-IκBα和NF-κB p65蛋白的表达呈上升趋势(P<0. 05); SRT1720(SRT)激活SIRT1可以呈浓度梯度减少ox LDL诱导的VSMC中红色脂滴的数量; SRT呈浓度梯度地上调SIRT1蛋白的表达,以及呈浓度梯度地下调p-IκBα和NF-κB p65蛋白蛋白的表达; BAY 11-7082(BAY)抑制p-IκBα和核内NF-κB p65蛋白的表达,也显著降低了oxLDL诱导的VSMC中红色脂滴的数量。结论本研究证实激活SIRT1可以抑制ox LDL诱导的VSMC源性泡沫细胞形成,且与NF-κB信号通路的抑制有关。     

布地奈德雾化吸入对慢性哮喘所致小鼠脑内神经炎症的影响及作用机制

【立论依据】 慢性哮喘是一类呼吸系统慢性炎症性疾病,糖皮质激素雾化吸入是目前治疗慢性哮喘的首选药物。来自临床的零星研究提示,哮喘引起的间歇性缺氧和气道炎症可能会对脑组织产生不利影响。因而推测哮喘引起的外周炎症可能导致中枢神经系统的病理改变。因此,本文工作拟通过建立慢性哮喘小鼠模型,研究慢性哮喘和布地奈德雾化吸入对小鼠脑内炎症的影响并探讨其作用机制。 【设计思路】 建立慢性恶化性哮喘模型、予以布地奈德雾化吸入治疗,观察哮喘及激素治疗对成年小鼠脑内的神经炎症的影响,并探讨其作用机制。 【实验内容】 成年小鼠第0天和第14天两次腹腔注射卵白蛋白(ovalbumin, ova)致敏剂溶液(10 g ova和1 mg氢氧化铝粉末溶于0.2 mL生理盐水中)。第21天开始在雾化吸入箱(30 cm×18 cm×13 cm)内予以1% ova激发刺激,隔天1次,每次激发30分钟。每隔8次普通激发,用10% ova恶化激发一次(共三次),共激发29次。治疗组小鼠激发后用0.5 mg/mL的布地奈德雾化吸入治疗。检测肺部病理变化和动物肺泡灌洗液中TNFα、IL-1β,以验证慢性哮喘模型是否造型成功;应用免疫组织化学法检测小鼠海马和皮层神经元中神经元数目来研究慢性哮喘及布地奈德雾化吸入治疗对脑损伤的影响;观察脑内小胶质细胞的增殖活化、检测脑内皮层和海马组织中TNFα、IL-1β、TGFβ、IL-10等炎症因子水平,研究小鼠脑内炎症反应;应用蛋白质印迹方法检测脑内NF-κB/p65及TLR4的表达等探讨相关机制。 【材料】 2个月龄雌性BALB/c小鼠,雾化吸入箱,免疫组化及分子生物学实验等相关试剂。 【可行性】 立论依据充分,且有较好的前期研究基础。 【创新性】 揭示慢性哮喘导致成年小鼠脑内的神经炎症;阐明布地奈德雾化吸入通过抑制TLR4-p65/NFκB信号通路改善哮喘所致的神经损伤。