小鼠PDL1-Red2融合蛋白真核表达载体的构建、表达及其效应

目的:小鼠跨膜型PD-L1与红色荧光蛋白(RFP)融合基因真核表达载体的构建、表达与鉴定, 及其效应初步研究.方法:应用基因工程技术构建重组载体, 脂质体转染NIT细胞株, 以流式细胞术(FCM)和倒置相差荧光显微镜检测融合蛋白的表达;采用混合淋巴细胞培养, 以FCM测定脾细胞的增殖反应.结果:融合基因在转染的真核细胞中获得表达, 并呈膜分布, 转染PD-L1/pDsRed2-N1的细胞对淋巴细胞增殖反应有一定的抑制作用, 表明PD-L1/pDsRed2-N1融合蛋白中分子标签未影响PD-L1的结构及其生物学活性.结论:PD-L1与DsRed2融合基因载体构建成功, 表达的融合蛋白具有生物学活性.     

抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区VL与GFP融合蛋白的表达及生物活性测定

目的 :在大肠杆菌中表达抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区基因 (VL)与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合蛋白 ,并测定其生物学活性。方法 :应用基因工程技术 ,将EGFP基因克隆到载体pTO T7中构建原核表达载体。然后将MA18/7的VL基因按照读码框插入到无终止密码子TAA的EGFP基因的 5′末端 ,构建融合蛋白表达载体。通过ELISA和相对荧光强度测定在大肠杆菌中表达的融合蛋白的活性。结果 :构建了EGFP MA18/7 VL 表达载体。SDS PAGE表明 ,融合蛋白主要以包涵体的形式存在。荧光测定显示 ,融合蛋白保持了GFP的荧光性质。ELISA的结果表明 ,融合蛋白与重链可变区 (VH)片段结合成的Fv ,能特异性地识别HBVpre S1抗原。结论 :成功地获得具有良好生物学活性的融合蛋白 ,可用于进一步的研究。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

葡萄球菌蛋白A"ZZ"与EGFP的融合表达及活性测定

目的 将EGFP基因与葡萄球菌蛋白A（SPA）基因的龙结构域重组，尝试以融合标记的方式构建一种新型免疫亲和试剂。方法 利用基因工程技术将EGFP基因重组至pEZZ18质粒，构建原核分泌表达载体pEZZ-EGFP，通过竞争ELISA和荧光光谱测定其在大肠杆菌中表达产物ProZZEGFP的生物学活性。结果 pEZZ-EGFP在E．coli HB101中正确表达，所表达融合蛋白具有与哺乳动物IgG抗体结合的生物学活性和EGFP的荧光活性。结论 ProZZ—EGFP融合蛋白有忽结构域（SPA）和EGFP二者生物学特性，在免疫荧光测定中可作为一种通用亲和试剂。     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

IDO-EGFP表达载体的构建及其在人软骨细胞中的表达

目的 克隆人吲哚胺双加氧酶(IDO)基因并构建IDO与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白哺乳动物细胞表达载体。方法 利用RT-PCR方法从人白细胞克隆IDO基因并构建IDO-EGFP融合蛋白表达载体。通过细胞核转染仪将表达载体转人人软骨细胞进行瞬时表达，以共聚焦显微镜对表达的绿色荧光进行分析。结果 从活化的人白细胞中克隆到IDO基因编码区全长，并构建了IDO-EFFP融合蛋白表达载体。以该表达载体转染原代人软骨细胞，表达的融合蛋白较均匀地分布于整个细胞。结论 成功构建了IDO-EGFP哺乳动物细胞表达载体，为进一步研究IDO奠定了基础。     

CTLA4-EGFP融合蛋白在K562细胞中的表达及其亚细胞定位研究

目的 :构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)与CTLA4融合蛋白真核表达载体 ,分析其在K562细胞中的表达和亚细胞定位。方法 :以RT PCR方法克隆人CTLA4基因 ,构建CTLA4 EGFP融合蛋白的表达载体。以其转染K562细胞后 ,以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果 :从人外周血细胞中克隆到CTLA4基因的cDNA。通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并删除终止密码 ,成功地构建CTLA4 EGFP融合蛋白表达载体。以该质粒转染K562细胞 2 4h后 ,CTLA4和EGFP双阳性细胞的百分率为 16%。表达的融合蛋白主要分布于胞内 ,细胞膜上分布较少。相反 ,转染空载体的细胞仅表达EGFP ,且其在细胞内呈弥散样分布。以佛波醇酯加离子霉素刺激后 ,CTLA4 EGFP融合蛋白在细胞表面表达水平升高到 2 9% ,且分布于胞内的融合蛋白向细胞膜靠近并与质膜融合 ;而转染空载体的细胞内EGFP的分布无明显改变。结论 :成功地构建CTLA4 EGFP融合蛋白表达载体 ,并在K562细胞中得到表达。表达的融合蛋白与天然CTLA4在活化T细胞中的定位和转运特点相似     

增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与轮状病毒（RV）VP6基因融合表达载体,研究融合蛋白表达及在细胞中的分布。方法提取A组人RVTB-Chen株VP6基因,用PCR扩增VP6编码cDNA片段。将此基因片段与真核表达载体pEGFP-C1携带的EGFP融合;运用脂质体的方法,将获得的重组质粒转染到MA104细胞中,在荧光显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的分布情况。结果成功构建了融合表达质粒;转染细胞后,融合蛋白可在MA104细胞中表达且主要分布在胞质中。结论RVVP6可与EGFP融合表达,融合蛋白在细胞质中呈均匀的分布,与RV感染细胞中合成的VP6蛋白的分布有较大的差别。     

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法　采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果　从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论　成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。     

人源载体介导的minidystrophin-EGFP融合基因在Cos-7细胞中的表达

目的 构建微小肌营养不良蛋白（minidystrophin）和增强绿色荧光蛋白（enhaneed green fluorese protein，EGFP）融合基因的人源载体，观察该载体在Cos-7细胞中的表达。方法 以正常人肌营养不良基因cDNA（GenBank NM_004006）为模板，通过PCR克隆的方法构建minidystrophin基因，融合EGFP基因后连接到人源载体pHmeo，大量提取荸组质粒，转染Cos-7细胞，通过逆转录聚合酶链反应、荧光显微镜观察等方法检测该载体在细胞内的表达。结果 成功构建pHmDysG载体，转染Cos-7后，逆转录聚合酶链反应可扩增出735bp特异条带，荧光显微镜观察可见表达蛋白分布于细胞膜上。结论 prim载体介导的minidystrophin基因可以在真核细胞表达，并被有效地转运至细胞膜，可望用于杜氏肌营养不良基因治疗的研究。     

HLA-A*0201与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在K562细胞的表达和定位

目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与HLA-A^*0201(A^*0201)融合蛋白哺乳动物细胞表达载体,分析其在K562细胞中的表达和亚细胞定位。方法:以RT-PCR方法克隆A^*0201cDNA,构建A^*0201-EGFP融合蛋白表达载体,转染K562细胞,以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果:从两个HLA-A2阳性供者外周血细胞中克隆到A^*0201cDNA编码区全长序列。通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并删除终止密码,成功构建A^*0201-EGFP融合蛋白表达载体。以该质粒转染K562细胞,5h后A^*0201和EGFP的表达百分率分别为25.12±2.26、27.37±3.59,24h后表达水平无明显提高。表达的融合蛋白主要分布于细胞膜上,胞内分布较少。相反,转染空载体的细胞不表达A^*0201分子,仅表达EGFP,且其在细胞内呈弥散样分布。结论:成功构建A^*0201-EGFP融合蛋白表达载体,并在K562细胞中得到表达,表达产物主要分布于细胞膜表面,提示表达该融合蛋白的K562细胞是潜在的人工抗原提呈细胞。     

AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位

构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem104-pEGFP-N1，利用脂质体转染体外培养的COS-1细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem104-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位，用RT-PCR和Western blot方法验证其mRNA和蛋白的表达。结果表明在空载体pEGFP-N1转染组中，COS-1细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒AngRem104-pEGFP-N1转染组中，绿色荧光集中在细胞核中，随着表达量的增高，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状，颗粒状，RT-PCR的结果表明AngRem104在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组。Western blot的结果也确证了AngRem104-EGFP融合蛋白的表达。提示新基因AngRem104/pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS-1中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有An-gRem104和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位，为基因功能研究提供了线索。     

结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备

目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP- C1中, 构建pEGHsp65融合基因。以其转染Hela细胞, 在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观测不同时间荧光表达的强弱, 并用RT- PCR检测Hsp65mRNA的表达。以pEGHsp65融合基因转染小鼠骨髓细胞经GM- CSF和IL -4诱导分化的DC, 用MTT比色法检测DC疫苗刺激未致敏脾细胞的增殖。结果: 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定证实, H37Rv株Hsp65DNA已插入重组表达载体pEG -FP- C1中。将融合基因转染入Hela细胞, 48h转染率最高;用RT- PCR在mRNA水平上可检测到Hsp65mRNA的表达。用MTT比色法检测表明, 融合基因转染的DC能激活并引起未致敏的脾细胞增殖。结论: 成功地构建pEGHsp65融合基因和以其制备的DC疫苗, 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。     

IL-13及其变异体真核表达载体的构建表达与亚细胞定位

目的：体外构建野生型人白细胞介素-13（whIL-13）及变异型人白细胞介素-13（mhIL-13）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融和蛋白真核表达载体，分析其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位。方法：以RT-PCR方法扩增whIL-13、mhIL-13全长编码基因，构建EGFP-whIL-13、EGFP-mhIL-13融和蛋白真核表达载体，转染COS-7细胞，以激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及其在细胞内的分布情况。结果：两种融和蛋白表达载体均构建正确，将其转染COS-7细胞后，在阳性克隆胞浆内均可见明亮的绿色荧光，胞核空虚。结论：成功构建EGFP-whIL-13、EGFP-mhIL-13融和蛋白表达载体，并在COS-7细胞中得到表达，表达的两种融和蛋白细胞内分布特征没有区别，均位于胞浆内。     

EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:构建早期B细胞因子3(EBF3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 使EBF3-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达.方法:采用RT-PCR技术, 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因, 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2, 使EBF3-EGFP融合蛋白得到表达.结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实, EBF3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游, 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3.将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后, 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内, 转染pEGFP/EBF3和pEGFP-N1后48 h的转染效率分别为52%和59%.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白, 转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组和未转染细胞组, 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展, 从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3, 并在HepG2细胞中进行了表达, 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础.     

小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1(Ipr1)基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA, 以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列, 克隆至pEGFP-C1载体中, 筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7, 以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照.采用RT-PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位.结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列, 经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达, Ipr1基因表达产物定位于细胞核内.结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因, 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达.Ipr1编码蛋白定位于细胞核内, 提示其是一种调节蛋白.