泰山蛹虫草菌产胞外多糖发酵工艺的研究

目的研究蛹虫草菌产胞外多糖的最佳发酵培养基和发酵条件。方法采用干重法测定菌丝生物量。采用硫酸-苯酚法测定多糖含量。结果蛹虫草产胞外多糖最佳发酵培养基组成为:蔗糖6%,硝酸钾0.2%,酵母膏2%,MgSO4.7H2O 0.02%,K2HPO40.04%,FeSO4.7H2O 0.002%;优化发酵培养条件为:接种量6%,初始pH7.0,温度24℃。结论在优化的培养基组成和发酵条件下,蛹虫草胞外多糖产量为4.84 g/L,菌丝体干重为21.12g/L。     

里氏木霉产胞外多糖发酵条件的优选研究

目的：建立简便有效的里氏木霉胞外多糖提取发酵工艺,为木霉胞外多糖的进一步开发利用奠定基础。方法以粗胞外多糖产量为指标,采用单因素试验优化发酵培养基配方,利用正交试验对摇瓶培养过程中的发酵液初始 pH、孢子接种量、发酵温度及发酵时间进行优选。结果里氏木霉发酵最佳控制参数为：培养基配方为蔗糖50 g/L、酵母粉20 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、MgSO40.5 g/L;发酵条件为发酵液初始 pH5.0、孢子接种量10%、发酵温度28℃、发酵时间190 h。优选发酵条件下里氏木霉粗胞外多糖产量达到21.6 g/L（RSD=2.54%, n=3）。结论优化的里氏木霉胞外多糖发酵提取工艺是一种简便、合理、可行和产量较高的提取工艺。     

灵芝真菌发酵胞外多糖反馈抑制的初步研究

探讨了灵芝胞外多糖自身反馈抑制作用。在摇瓶中考察了灵芝真菌发酵菌丝体生长、胞外多糖(EPS)和胞内多糖(IPS)合成的动态过程。在培养168h时，生物量达到最大值3．18g／L(干重)，培养216h时，胞外多糖达到最高浓度1．24g／L，EPS和生物量的变化趋势大致呈正相关。在摇瓶培养基中添加同源胞外多糖，以浓度梯度实验法考察培养基中的同源胞外多糖浓度对灵芝真菌发酵胞外多糖产量的影响，结果表明：培养基中添加的同源胞外多糖浓度高于0．59g/L时，EPS的产生受到明显抑制，其趋势是随着培养基中同源灵芝胞外多糖浓度的增加，反馈抑制作用逐渐增强，当培养基中添加的同源胞外多糖浓度高于2．34g/L时，菌丝的生长和胞外多糖的产生完全受到抑制。     

胞外蛋白酶对外源基因表达的影响

根据Ａ蛋白基因产物－Ａ蛋白特异与许多动物的免疫蛋白的Ｆｃ段结合这一特性，应用ＥＬＩＳＡ检测方法，测定Ａ蛋白基因地衣芽胞杆菌ＮＭ１０５中的表达情况，进而研究外蛋白酶对外源基因表达的影响。     

桦褐孔菌胞外多糖合成的深层发酵条件研究

目的探索桦褐孔菌深层发酵体系中胞外多糖积累的最佳碳、氮源和pH值。方法采用深层发酵法培养桦褐孔菌,通过添加不同的碳、氮源和改变pH值观察胞外多糖的积累。发酵液中的总糖用硫酸-蒽酮法测定,还原糖以DNS法测定,总糖减去还原糖即为胞外多糖的量。结果桦褐孔菌深层发酵体系中有利于胞外多糖合成的最佳碳源为2%的麦芽糖,氮源为0.4%的蛋白胨,最适pH值为5.5。结论最佳单因子组合对桦褐孔菌胞外多糖积累有协同效应,组合后的发酵体系中胞外多糖的量达7.8g/L。     

地衣芽胞杆菌产β—甘露聚糖酶摇瓶发酵条件的研究

目的：确定地衣芽胞杆菌NK-27-51产β-甘露聚糖酶摇瓶发酵的最佳工艺条件。方法：以正交设计的试验方法,选取L27（3^13)正交表,考查发酵时间、装液量、接种量,pH等工艺参数对酶活力的影响。结果：经方差分析后表明,发酵时间,装液量,对该菌株产酶有显著影响,发酵时间和接种量有显著交互作用。结论：得出了最佳工艺组合。可为酶制剂制取低聚糖的工业生产提供依据。     

新生隐球菌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶活性检测

目的:测定不同孵育条件、来源和血清型的新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性.方法:30℃和37℃下用含有偶氮白蛋白的琼脂培养板培养不同来源及血清型的36株新生隐球菌菌株,测量其产生的廓清晕环的大小,计算CH值[菌落半径/(菌落半径 廓清晕环半径)]来比较其胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性强弱;用丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂观察两种酶活性改变;酶谱法观察菌株浓缩上清液中胞外蛋白水解酶活性和相对分子质量.结果:36株菌株在30℃和37℃培养条件下它们的平均CH值分别为0.558±0.170和0.575±0.169,两者间无显著差异;血清A(n=13)、B(n=13)、D/AD(n=6)型菌株各自的平均CH值分别为0.564±0.144、0.515±0.078和0.482±0.072,各组间无显著差异;临床分离株(n=23)、环境分离株(n=9)和荚膜缺陷株(n=4)各自的平均CH值分别为0.570±0.177、0.513±0.069和0.942±0.075(P＜0.05).对照组(不含抑肽酶)和抑肽酶不同浓度组(1.2、1.6 mU)的平均CH值分别为0.459±0.188, 0.975±0.287、0.733±0.252(P＜0.01).菌株浓缩液中含有复杂的胞外蛋白酶类成分.结论:新生隐球菌胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性在30℃、37℃下无显著差异;在临床分离株中比环境分离株和荚膜缺陷株强;在不同血清型菌株间无显著差别;可被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制.     

灵芝菌发酵培养基的优化及灵芝胞外多糖的分离纯化

用正交法研究了不同条件对灵芝菌生长影响,从中选出了灵芝 菌液体深层发酵的优化 培养基：葡萄糖 3.6%,蛋白胨 0.4%,pH 6.0,酵母膏 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO 4· 7H2O 0.05%,Vit B1 0.005%,每升发酵液产干菌丝体 15.6 g,粗多糖 0.72 g。 经葡 聚糖凝胶层析对灵芝胞外多糖进行了分离纯化,共有 5 个组分,并用红外光谱、紫外光谱 ,气相色谱等手段进一步分析了灵芝胞外多糖的组成,结果表明灵芝胞外多糖系由甘露糖、 果糖、葡萄糖通过糖 β-D 糖苷键构成。     

运动性气单胞菌胞外溶血毒素和蛋白酶产生的研究

从患败血症的鲫鱼体中分离的几株病原菌被证明为运动性气单胞菌。在需氧培养条件下，产生大量的溶血毒素和蛋白酶。在LB培养基中32℃培养时，6h后开始产生毒素，12h后达到高峰。培养基的起始pH为5．0时，培养基上清的溶血毒素和蛋白酶活性分别为对照组(pH8．0)的20％和50％。D-阿拉伯糖可抑制溶血毒素和蛋白酶的活性，使其分别为对照组(LB培养基)的10％和50％。而L-山梨糖仅抑制溶血毒素的活性，效果为对照组的10％。SDS—PAGE显示起始pH5．0时，细菌胞外蛋白中至少有两条带被抑制。结果表明，酸性起始条件可抑制CRI4菌株的溶血毒素和蛋白酶的表达，不同的糖对溶血毒素和蛋白酶的产生有不同的作用。而且，铁离子对蛋白酶的产生也很重要。总之，溶血毒素和蛋白酶的调节系统各不相同。     

粘液放线菌生物膜结构中细菌和胞外多糖关系的初步研究

目的探讨粘液放线菌形成的单菌种生物膜的结构以及胞外多糖在生物膜中的分布。方法采用微生物厌氧培养技术将粘液放线菌在玻璃片上形成24h单菌种生物膜,用荧光染料Fluorescein、BODIPY和Calcofluor进行荧光染色,激光共聚焦扫描显微镜观察其形成的生物膜结构和其中胞外多糖的分布。结果玻璃表面粘液放线菌粘附形成致密的生物膜,大量微菌落和沟壑间隙是其所形成生物膜的特征。临近粘附表面的生物膜基底部位细菌密度较低,而中部则较致密。生物膜中胞外多糖分布与菌落中的细菌分布一致。结论粘液放线菌依靠其合成的胞外多糖聚集形成了生物膜。     

长双歧杆菌液态发酵条件的优化及生长曲线的测定

目的优化长双歧杆菌的液态发酵条件。方法通过单因素试验方法,考察长双歧杆菌液态培养基的最佳初始pH、培养温度、接种量和培养时间。结果长双歧杆菌的最佳发酵条件为:发酵液初始pH 7.0、发酵培养温度39℃、发酵接种量6%、最佳培养时间8～10 h。结论本课题研究确定的发酵工艺有效地提高了长双歧杆菌的培养效率。     

丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用

目的 应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3 - 4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型.方法 将质粒pMAL-c2/NS3 - 4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3 - 4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性.结果 建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量.在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%.蛋白酶的Km值为4.74 μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L.结论 建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选.     

重组复合干扰素基因工程菌发酵培养条件的研究

目的:研究表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coliDH5α(pBV220/con-IFN)的发酵条件。方法:在摇瓶实验中,采用正交设计法和均匀设计法确定较佳培养基组分;使用20 L发酵罐进行补料分批发酵实验,研究影响菌体生长和con-IFN表达的因素(如溶氧、补料、温度和诱导时间)。结果:发酵培养基配方为蛋白胨10 g/L,酵母膏7.5 g/L,甘油0.5%,Na2HPO4.12H2O 20.13 g/L,KH2PO410.37 g/L,NaCl 9.31 g/L。确定了高密度发酵工艺,即优化的发酵培养基,初始pH7.2,接种量5%,溶氧15%,先经35℃培养4 h,后降温至30℃培养2 h,再以42℃诱导7 h,诱导的同时补料酵母膏0.5%。在此条件下,发酵液可得15.2 g/L湿菌体,con-IFN的表达量占菌体总蛋白的49.60%,每毫升发酵液的抗病毒活性为9.69×108IU。结论:获得了较满意的优化培养基配方和发酵条件,为下游纯化和进一步大规模生产奠定了基础。     

改良菌落PCR快速鉴定TRIM28基因阳性重组子的方法研究

目的:建立简便、可靠基因克隆菌落阳性重组子的筛选方法。方法:应用普通菌落PCR和改良的菌落PCR方法对TRIM28基因的阳性重组体进行阳性重组子的分析比较,同时探讨了PCR反应体系中模板浓度和DMSO对于扩增效率的影响。并对鉴定结果为阳性的克隆进行了进一步酶切和蛋白诱导表达分析。结果:运用改良的菌落PCR法简单快捷,结果可靠,反应体系中DMSO的浓度为4%左右可以很好地促进GC富集DNA模板的PCR扩增。其方法的可靠性得到了酶切验证和重组蛋白表达证实。结论:应用改良方法可以用于快速有效地筛选阳性重组菌落。     

入免疫缺陷病毒1型蛋白酶抑制剂的微生物筛选模型的建立

目的采用基因工程方法,建立人免疫缺陷病毒１型蛋白酶（ＨＩＶ－１ＰＲ）的微生物检测法,用以筛选抗ＨＩＶＰＲ抑制剂。方法合成编码ＨＩＶ－１ＰＲ识别序列２４ｂｐ低聚核苷酸片段,并将其插入质粒ｐＢＲ３２２四环素耐药基因ｔｅｔｒ,经亚克隆构建含突变之四环素耐药基因ｍｔｅｔｒ的ｐＡＣＹＣ１８４Ｍ。以后者转染含ＨＩＶ－１ＰＲ表达载体（ｐＰＯＬＯ）的大肠杆菌,构建能同时表达四环素耐药蛋白及ＨＩＶ－１ＰＲ之工程菌（ＴＬＶ３３１）。结果在选择培养基内,ＴＬＶ３３１生长受ＨＩＶ－１ＰＲ控制,ＨＩＶ－１ＰＲ表达时可破坏ＴＬＶ３３１四环素抗性;ＨＩＶ－１ＰＲ活性受到抑制时,其四环素抗性则恢复。此特性经ＨＩＶ－１ＰＲ的已知抑制剂验证并以该法对３１个化学合成样品进行筛选。结论通过基因工程方法建立了ＨＩＶ－１ＰＲ的微生物检测法,该法可作为抗ＨＩＶＰＲ抑制剂之初筛模型。     

正交试验优化六神曲中淀粉酶和蛋白酶的提取工艺

目的采用正交设计法确定六神曲中淀粉酶和蛋白酶的最佳提取工艺。方法以淀粉酶和蛋白酶的活力为检测指标,采用L9(33)正交试验,考察提取温度(A),提取时间(B),料液比(C)三个影响因素对六神曲中淀粉酶和蛋白酶活性的影响,并利用碘量法及紫外可见分光光度法分别对六神曲中淀粉酶及蛋白酶进行酶活力测定。结果六神曲的最佳提取工艺为A3B1C3,即20倍的蒸馏水40℃下浸提0.5 h。结论优选得到的六神曲中淀粉酶和蛋白酶的提取工艺稳定可行。     

临床常见腹泻致病菌的快速鉴定方法研究进展

腹泻是一种高发病率的胃肠道传染病,常见的腹泻致病菌有很多种,不同的致病菌对抗生素的敏感性不同,因此快速、准确的诊断和鉴定临床常见腹泻致病菌尤为重要。分子生物学和蛋白质组学技术具有快速、准确、敏感性高的优点,有着较好的临床应用前景。