颗粒外排与Fas/Fas配体途径在人yδT细胞的肿瘤细胞毒活性中的作用

目的探讨结核杆菌抗原(Mtb-Ag)特异性活化的γδT细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒活性机制.方法用Mtb-Ag刺激正常人PBMC以诱导γδT细胞扩增并用磁珠阳性分选法获得高纯度γδT细胞;用RT-PCR法检测γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA的表达;用流式细胞仪检测γδT细胞表面Fas配体(FasL)分子以及几种肿瘤细胞表面Fas分子的表达;用MTT法测定γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性,观察穿孔素/颗粒酶途径的阻断剂concanamycin A(CMA)和Fas/FasL途径的抑制剂brefeldin A(BFA)对γδT细胞细胞毒活性的影响.结果经Mtb-Ag激活和扩增的γδT细胞高表达穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA;Mtb-Ag活化的γδT细胞中22.4%表达FasL分子;CMA能明显抑制YδT细胞对肿瘤细胞(尤其对Fas低表达的K562和PG)的杀伤,BFA能强烈抑制γδT细胞杀伤Fas高表达的Raji和A375.结论Mtb-Ag活化的γδT细胞杀伤Fas低表达的靶细胞时主要通过颗粒外排途径,杀伤Fas高表达的靶细胞时,颗粒外排和FasL均起作用.     

人外周血Vα24 NKT细胞抗肿瘤免疫机制的初步研究

目的：进一步认识Vα24NKT细胞在抗肿瘤免疫中的作用。方法：从正常人外周血中扩增并纯化得到Vα24NKT细胞，通过流式细胞术检测其表型、活化后的细胞因子、细胞坏死相关因子的表达情况，采用DIOC18染色及流式细胞术测定Vα24NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤率，并利用不同的阻断剂进行阻断实验。结果：Vα24NKT细胞分泌高水平的IFN-γ和IL-4，并表达TNF-α、穿孔素（perforin）、FasL、TRAIL等细胞坏死相关因子。Vα24NKT细胞对表面表达CD1d分子的肿瘤细胞株的杀伤率高于不表达CD1d分子的肿瘤细胞株，同时在α—GalCer存在时，Vα24NKT细胞的杀伤活性增强。对Perforin、FasL、TNF-α、TRAIL进行阻断后，ConA对Vα24NKT细胞的杀伤作用的阻断效果最为明显。结论：Va24NKT对肿瘤的杀伤作用是CD1d分子限制性和抗原特异性的。Vα24NKT通过穿孔素途径和TNF家族成员发挥其细胞毒作用，而穿孔素途径是其肿瘤杀伤的最主要途径。     

γδT细胞的细胞毒活性研究

目的 探讨选择性扩增人γδT细胞的方法及其细胞毒活性。方法 用耐热性结核杆菌分子多肽抗原（Mtb)刺激正常人PBMC，并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδT细胞，通过MTT试验观察γδ细胞对人红白细胞白血病细胞K562的细胞毒活性。结果 Mtb刺激及磁珠分选后的γδT细胞可达73％和98．05％，效靶细胞比例为10：1时其对K562细胞的杀伤率分别为59％和78．5％。结论 Mtb刺激及磁珠分选所获得的高纯度γδT细胞可介导对K562细胞的高效细胞毒活性。     

人外周血γδT细胞CD107a的表达变化与细胞毒活性的关系

目的:探讨人外周血γδT细胞体外诱导过程中CD107a的表达变化及其与γδT细胞细胞毒活性的关系。方法:分离健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),加入含有IL-2和异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyro-phosphate,IPP)的培养基,体外诱导γδT细胞。分别在第7、10、14天以流式细胞仪对培养的γδT细胞进行鉴定,并同时检测其CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达。CCK-8试剂盒检测γδT细胞对胰腺癌细胞SW-1990的杀伤效应。采用SPSS13.0软件进行spearman相关分析。结果:在培养的第7、10、14天,γδTCR阳性细胞分别为(60.31±3.84)%、(66.45±4.25)%、(70.99±4.66)%。CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达在γδT细胞培养第7~10天达到峰值后呈下降趋势,第7天与第0天相比差异有统计学意义[(80.66±4.42)%、(70.11±3.34)%、(94.26±4.25)%vs(69.02±5.04)%、(62.31±4.66)%、(53.62±3.69)%,P<0.05]。培养第7天、第10天的γδT细胞对SW-1990细胞杀伤率显著高于第14天的γδT细胞[(58.86±5.12)%、(61.53±4.69)%vs(40.31±4.83)%,P<0.05]。γδT细胞CD107a表达与穿孔素、颗粒酶B、其对SW-1990细胞杀伤效应显著相关(r=0.853,r=0.785,r=0.839,均P<0.01)。结论:人外周血γδT细胞CD107a的表达与其抗肿瘤能力正相关,可能是γδT细胞细胞毒活性的一个标志。     

Fas/FasL与肿瘤关系研究的进展

Fas抗原(APO-1／CD95)与Fas配体(FasL)组成的Fas系统，在将凋亡信号转导入细胞内发挥重要作用。效应细胞FasL结合靶细胞Fas抗原后，在数小时内通过细胞凋亡途径使靶细胞死亡。近年来很多研究发现Fas在多种细胞表面均有表达，而FasL表达只限于少量细胞类型，诸如淋巴细胞、免     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对大肠癌细胞株LOVO体外杀伤作用的研究

目的研究树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对大肠癌细胞株LOVO的杀伤及诱导凋亡作用。方法 从健康供者外周血中提取出单个核细胞, 用不同的细胞因子诱导出DC及CIK细胞, 待DC成熟后将DC与CIK混合培养。细胞计数法测定细胞的增殖、MTT法测定细胞杀伤活性、透射电镜观察肿瘤细胞的凋亡、Western Blot法检测效应细胞表面FasL表达。结果 DC细胞对CIK细胞具有很强的促增殖作用, 且DC-CIK细胞共培养组在各效靶比的杀伤活性均明显高于单独CIK细胞培养组(P＜0.01)。DC可以促进CIK诱导肿瘤细胞发生凋亡, 且DC-CIK、CIK细胞均大量表达FasL。结论 DC细胞可以显著提高CIK细胞的增殖活性和细胞毒活性, 其共培养的作用机制之一可能是通过Fas/FasL途径而实现。     

抗人P185 erbB2 scFv-Fc-IL-2调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞

将抗人P185erbB2scFvFcIL2融合蛋白（HFI）作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞（PBMC）,通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制,为HFI临床应用提供实验依据。〖HT5W〗方法： 〖HT5"SS〗MTT法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术观察细胞表面分子的表达水平;生物活性法检测细胞膜相关TNF杀伤活性;RTPCR检测细胞穿孔素表达水平。〖HT5W〗结果： 〖HT5"SS〗HFI处理后,未观察到对SKOV3细胞增殖活性的直接抑制作用;SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM1、Fas表达率分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%（P<0.01);人PBMC的增殖活性增强,CD3+CD8+T细胞和CD3CD16+CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%（P<0.01);CD25、LFA1、FasL表达水平分别由399%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06% 16.19%（P<0.01);穿孔素基因、膜相关TNF均表达增强,LAK样、NK样杀伤活性在各效靶比时均明显增高（P<0.01)。〖HT5W〗结论： 〖HT5"SS〗HFI提高SKOV3细胞杀伤相关分子ICAM1、Fas表达水平,并且对人PBMC有明显的增殖活化作用,通过激活LFA1/ICAM1、Fas/FasL途径提高杀伤介质穿孔素和膜相关TNF的释放,增强LAK样、NK样杀伤活性。     

Fas/FasL系统对肿瘤细胞凋亡失效的研究进展

Fas是一种重要的诱导细胞凋亡的死亡受体,在靶细胞表面相应配体Fas L的激活下介导细胞凋亡。肿瘤细胞通过Fas基因突变、下调Fas的表达、以及表面产生诱骗受体DcR3竞争结合Fas L抑制凋亡,或者通过产生可溶性Fas及FasL(sFas/sFasL)逃避凋亡;Fas/FasL的表达异常与肿瘤的浸润、转移也具有密切的关系。     

血清sFas检测在肺腺癌诊治中的临床意义

Fas及其配体FasL与肿瘤发生发展的关系近年来受到关注。Fas为Ⅰ型跨膜糖蛋白，属肿瘤坏死因子受体家族（TNFR）及神经生长因子受体家族（NGFR），表达于人记忆T细胞、NK细胞及成熟T、B细胞上。FasL是Ⅱ型跨膜糖蛋白，与TNFR家族有同源性，表达于活化的T细胞、NK细胞及多种肿瘤细胞表面。FasL与Fas结合后，传导凋亡信号，诱导Fas阳性细胞发生凋亡。Fas有两种形式：细胞表面的膜型Fas（mFas）和血清可溶性Fas（sFas）。mFas可与FasL结合激发Fas阳性细胞凋亡，sFas可与FasL竞争结合而抑制Fas途径介导的凋亡，因此可认为sFas是一种新的免疫抑制因子。     

γδT细胞对血液肿瘤细胞的体外杀伤活性

目的:建立γδT细胞培养体系,探讨γδT细胞对不同血液肿瘤细胞的杀伤活性.方法:选取2016年1月至2016年4月在解放军第307医院造血于细胞移植科收治的4例B细胞淋巴瘤患者和该院5例体检健康志愿者,分别分离其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用唑来磷酸(zoledronate,Zol)和IL-2体外扩增γδT细胞,采用流式细胞术检测γδT细胞对血液肿瘤细胞Jurkat、THP-1、HL-60、K562、Raji、U-937和RPMI-8226的杀伤活性,比较CIK、NK和γδT三种细胞对K562细胞的杀伤作用,检测γδT细胞IFN-γ、TNF-α的分泌水平及CD107a分子的表达水平.结果:成功在体外扩增外周血γδT细胞;γδT细胞对Jurkat、THP-1、HL-60、K562、U-937和RPMI-8226细胞均有明显的杀伤活性(P＜0.05);γδT细胞对K562细胞的杀伤活性与NK细胞无统计学差异,但明显强于CIK细胞(P＜0.01);随着与K562细胞共孵育时间的延长,γδT细胞分泌IFN-γ的水平呈现出时间依赖性增加,TNF-α在8h后逐渐增加;与K562细胞或HL-60细胞共孵育后,γδT细胞CD107a分子的表达水平均显著增加(P＜0.01).结论:体外扩增的γδT细胞对血液肿瘤细胞具有较高的杀伤活性,为血液肿瘤的细胞免疫治疗提供实验依据.     

放射治疗对可溶性Fas配体在肺癌和食管癌中表达影响的初步分析

肿瘤的发生、发展及转归过程中机体的免疫防御起着至关重要的作用.Fas/Apol-1,又名CD95分子,是属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)及神经生长因子(NGFR)家族成员,是一种I型细胞膜蛋白.Fas配体(FasL)是TNF相关的Ⅱ型跨膜蛋白,主要表达于活性T淋巴细胞.Fas是细胞表面的一种凋亡信号受体,具有诱导凋亡的能力.分别表达Fas和FasL的细胞相结合时,可导致表达Fas的细胞凋亡.T淋巴细胞表达的FasL可使表达Fas的肿瘤细胞凋亡.而Fas和FasL均可以产生可溶性分子,即可溶性Fas和FasL(sFas,sFasL).它们在细胞凋亡中发挥调节作用.本文通过肺癌和食管癌患者进行放射治疗前后的sFasL的变化,观察放射治疗导致细胞凋亡的现象,探讨放射治疗的作用和机制.     

一种简单γδT细胞扩增培养方法及其抗肿瘤生物学功能研究

目的 :建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法 ,并比较了γδT细胞 ,NK和LAK细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法 :收集用不同单抗分别包被粘附的细胞 ,然后通过MACS细胞分选仪的分选 ,获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以及单抗阻断效应的分析。结果 :经MACS分离得到的γδT细胞 ,培养 2周后细胞数扩增 6 0 0～ 80 0倍 ,CD3,CD8和γδ细胞表达阳性率分别是 72 .2 9% ,5 8.0 2 %和 6 5 .98%。γδT细胞对NK敏感细胞K5 6 2以及NK不敏感细胞Raji和XG 7这 3种不同靶细胞均有较高的杀伤率 ,分别为 35 .98% ,5 2 .2 7%和 6 9.0 8% ;NK细胞对此 3种细胞的杀伤率分别是 45 2 1% ,12 .34%和 11.94% ;LAK细胞的杀伤率分别为 44 .0 1% ,2 9.2 7%和 2 5 .6 8%。γδT细胞对经MHC Ⅰ类单抗阻断前后的K5 6 2 ,Raji和XG 73种靶细胞的杀伤率无明显改变。结论 :γδT细胞、NK细胞和LAK细胞都具有一定的非特异性杀伤肿瘤细胞的作用 ;γδT细胞对MHC Ⅰ类单抗阻断后的肿瘤细胞的杀伤无明显变化。提示γδT细胞较NK细胞和LAK细胞有更广泛的抗瘤谱     

T细胞的扩增及其信号转导分子ZAP-70的检测

目的检测γδT细胞信号转导分子ζ链相关蛋白-70（ζ-chainassociated protein70,ZAP．70）。方法分离获取健康人PBMC,用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb．Ag）刺激PBMC,通过流式细胞仪检测总T细胞和丫6T细胞CD69分子的动态表达;Mtb-Ag活化俩T细胞增殖培养,10d后收集细胞,用免疫磁珠阳性分选法分离获取高纯度的γδT细胞;westernblot方法检测γδT细胞内的ZAP．70分子。结果总T细胞和γδT细胞均在活化刺激24h时表达CD69分子达高峰,但总T细胞仅为16％,γδT细胞可达75．2％;新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为4．9％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为69．2％,免疫磁珠阳性分选后达99-3％;检测到Y6T细胞内的ZAP-70分子。结论Mtb-Ag可特异性激活俩T细胞,用Mtb-Ag刺激γδT细胞活化增殖培养,可获得大量的γδT细胞;成功地检测到细胞内ZAP-70分子,这为Y6T细胞内其它分子的检测分析奠定方法学基础,也为进一步检测γδT细胞活化信号转导过程中ZAP-70分子的激活及作用奠定基础。     

肝癌细胞通过Fas/FasL途径触发T淋巴细胞凋亡的双重阻断研究

目的通过阻断Fas/FasL介导的T细胞凋亡,建立快速制备大量激活的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法。方法选择FasL表达阳性的肝癌标本,分离肝癌细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),然后在体外将两者混合,并在CD28单抗共刺激下,激活制备特异性CTL。应用可溶性Fas受体阻断肝癌细胞通过Fas/FasL途径触发激活T细胞凋亡,与对照组比较用流式细胞仪和DNA ladder Test同时检测阻断凋亡作用,通过3H掺入法和51Cr释放法了解T细胞增殖力及杀伤活性。结果流式细胞术仪检测未阻断组较阻断组和未阻断对照组凋亡率明显升高,未阻断组凋亡率达47．82％±0．13％,对照组静息性T淋巴细胞组为3．76%±0．25％,阻断组为8．22％±0．26％(P<0．01),DNA ladder显示未阻断组T淋巴细胞出现明显梯状条带,阻断组为阴性。51Cr释放法表明阻断后T淋巴细胞杀伤活性增加,较未阻断组及未阻断对照组差异有显著性(P<0．01)。3H掺入法检测证实可溶性Fas受体阻断激活T细胞凋亡后,细胞增殖明显升高,较未阻断组差异有显著性(P<0．01)。结论体外实验可获得大量激活T细胞,并可杀伤肿瘤细胞。     

急性髓系白血病患者T淋巴细胞FasL表达及其诱导白血病细胞凋亡功能

Fas配体(FasL)是T细胞介导细胞毒效应的主要效应分子之一,与靶细胞Fas受体结合启动细胞凋亡程序.抗原特异性或非抗原待异性刺激可激活T淋巴细胞表达FasL.Fas-FasL凋亡途径已成为白血病发生、发展和生物学冶疗研究的热点课题.本研究在体外用包被CD3单克隆抗体通过TCRCD3信号复合体激活T淋巴细胞(6小时),采用间接免疫荧光染色技术、GAPDH内标记RT-PCR定量分析、细胞凋亡形态学检测,比较分析了AML(M2)患者T淋巴细胞FasL表达及其诱导白血病细胞凋亡功能.结果显示:1.M2患者T淋巴细胞FasL荧光阳性率为15.9±8.65%,健康人为47.1±8.53%(P<0.01);健康人T淋巴细胞FasL mRNA为M2患者的10～100倍,2.M2患者T淋巴细胞FasL表达有明显的个     

Fas／FasL系统介导的免疫细胞凋亡

一些肿瘤细胞可以表达FasL,并能够同T淋巴细胞上的Fas分子结合,通过Fas途径介导T淋巴细胞凋亡。本文拟就此现象及其可能机制作一综述。     

Fas/FasL系统介导的免疫细胞凋亡

一些肿瘤细胞可以表达FasL,并能够同T淋巴细胞上的Fas分子结合,通过Fas途径介导T淋巴细胞凋亡.本文拟就此现象及其可能机制作一综述.     

卵巢癌患者γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性

目的：研究从卵巢上皮性癌（ＯＥＣ）患者肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）、肿瘤相关淋巴细胞（ＴＡＬ）及外周血淋巴细胞中分离扩增的γδＴ细胞对同种异体和自体肿瘤细胞的体外细胞毒作用,同时对αβΤ细胞的细胞毒活性也作了比较。方法：用抗体固相法扩增γδ／αβＴＩＬ,γδ／αβＴＡＬ及外周血γδ／αβＴ细胞;用密度梯度离心法或组织块培养法扩增原代ＯＥＣ细胞,并进行鉴定;用ＭＴＴ法测定γδ／αβＴ及外周血γδ／αβＴ细胞对同种异体／自体ＯＥＣ细胞的细胞毒活性。结果：体外扩增出的γδ／αβＴＩＬ,γδ／αβＴＡＬ及外周血γδ／αβＴ细胞对同种异体／自体ＯＥＣ细胞均具有较强且水平相近的细胞毒活性;扩增到７０％细胞纯度所需时间为：外用血γδΤ细胞（１４ｄ）,γδＴＡＬ（２１ｄ）和γδＴＩＬ（２８ｄ）。结论：γδＴＡＬ有望成为ＯＥＣ过继细胞治疗的简便获得而有效的候选细胞。关     

乳腺癌HIFU后腋窝淋巴结内淋巴细胞杀伤活性的变化

目的:探讨高强度聚焦超声(HIFU)治疗乳腺癌原发灶后同侧腋窝淋巴结中淋巴细胞的Fas配体(FasL)、颗粒酶B(GzB)、穿孔素(Pf)等细胞毒性分子表达的变化.方法:用SP免疫组化方法检测HIFU组23例和对照组25例患者腋窝淋巴结中淋巴细胞的FasL、GzB和Pf的表达.结果:HIFU组腋窝癌转移阴性和阳性淋巴结内Fasl、GzB、Pf阳性细胞数明显高于对照组(P＜0.01).结论:HIFU治疗乳腺癌原发灶后肿瘤引流淋巴结(TDLN)内具有杀伤活性的淋巴细胞增多,细胞免疫增强.