p16基因突变及甲基化在砷致癌中的作用

目的了解抑癌基因p16在燃煤型砷中毒患者中突变及甲基化的情况和意义。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析和PCR产物克隆测序技术对60例砷中毒患者外周血中p16基因第2外显子突变情况进行检测,同时采用甲基化敏感的限制性内切酶方法对p16基因第1外显子甲基化情况进行分析。结果燃煤型砷中毒患者p16基因第2外显子未发现突变存在;第1外显子SmaⅠ位点甲基化分析显示:癌变组10例患者中有4例出现了甲基化,癌前组12例、一般病变组38例,均未发现甲基化存在。结论p16基因高度甲基化可能是导致砷性肿瘤中p16基因失活的主要方式,并可能在砷致癌过程中起着重要作用。     

饮水型砷暴露人群p16基因甲基化的研究

目的研究砷暴露人群p16基因甲基化发生情况。方法分别在饮水型砷中毒病区选取40例典型确诊地砷病患者、40名病区非患者及40名非病区的正常人（2个对照组），并进行年龄、性别匹配，采用甲基化特异性PCR技术测定人群血标本p16基因甲基化水平。结果地砷病患者及对照人群p16基因的甲基化率分别为65．0％、47，5％和20．0％；随着饮水砷浓度的增高，p16基因甲基化率也是逐渐增高。结论饮水砷暴露可引起人群p16基因甲基化发生率升高。     

p16基因甲基化与地方性砷中毒发病关系的条件logistic回归分析

目的探索p16基因甲基化与地方性砷中毒(地砷病)发病的关系。方法以病区对照和非病区对照进行两项1：1配对病例对照观察，病例组选自病区确诊地砷病患者共40例，对照组分别选自病区与非病区的非患者和正常人，进行年龄、性别匹配。采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术，测定病区人群血标本p16基因甲基化水平，并用条件logistic回归分析方法处理资料。结果病例与病区对照分析结果表明：p16甲基化(P=0．1343)对地砷病发病的影响无显著意义；而饮水砷(P=0．0039)和饮水年限(P=0．0154)对地砷病发病的影响有显著意义。病例与非病区对照分析结果表明：p16甲基化(P=0．0019)对地砷病发病的影响有极显著意义。结论p16基因甲基化与地砷病发病可能存在病因联系。     

非小细胞肺癌hTERT与p16基因甲基化的表达

目的 探讨端粒酶逆转录酶(hTERT)和p16基因甲基化在非小细胞肺癌(NSCLC)发病中的作用.方法 应用实时荧光定量RT-PCR法和甲基化特异性PCR法检测45例NSCLC组织、21例肺正常组织hTERT和p16基因甲基化的表达.结果 NSCLC、正常肺组织hTERT mRNA的表达分别为2.854±0.728、2.042±0.378,组间比较差异有统计学意义(P<0.01);NSCLC组织、肺正常组织p16基因甲基化阳性率分别为57.8%、14.3%(P<0.01).hTERT mRNA与NSCLC病理类型相关,p16基因甲基化与NSCLC细胞分化程度及淋巴结转移相关(P均<0. 05).结论 hTERT与p16基因甲基化存在相关性,hTERT和p16基因甲基化的表达与NSCLC的发生、发展有关.     

食管鳞癌组织p16基因调控区甲基化及其蛋白表达研究

目的探讨p16基因在食管癌变过程中表达缺失与其启动子区甲基化的关系。方法采用MSP免疫组化方法,检测环太行山地区45例食管鳞癌患者癌组织p16基因启动子区甲基化状态及蛋白表达情况。结果p16基因在癌组织中表达异常41例（91．1％）,间变组织中表达异常38例（84．4％）,发生纯合型甲基化的组织分别为33例（73．3％）（癌组织）和32例（71．1％）（间变组织）,而其周围正常组织26例（57．8％）均发生了p16启动子区的杂合型甲基化。p16基因纯合型甲基化与癌组织、间变组织、p16蛋白表达缺失相关（P〈0．05）。结论该地区食管癌组织p16基因在癌前病变中p16启动子区即发生了纯合型甲基化、食管癌变的早期事件。p16基因启动子区甲基化可单独影响p16蛋白的正常表达。     

地方性砷中毒发病危险因素的病例对照研究

目的探讨地方性砷中毒（地砷病）的发病危险因素，评估p16甲基化在地砷病发病中的作用。方法采用两项1：1配对病例对照研究方法，40例病例选自病区确诊的地砷病患者，对照分别选自病区和非病区各40例健康人；采用标准化问卷进行调查，获取病例和对照组的有关暴露因素：采用甲基化特异性PCR（MS—PCR）技术，测定血样p16基因甲基化水平；并用条件logistic回归分析方法处理资料。结果病例与病区对照组分析结果表明，饮水含砷量（OR=4．2，P〈0．01）和饮水年限（OR=1．192．P〈0．05）对地砷病发病的影响有统计学意义。p16甲基化测定结果表明，病例组与非病区对照组比较，对地砷病发病的影响有非常显著的统计学意义（OR=10．0，P〈0．01）。结论饮水含砷量、饮水年限和p16基因甲基化可能都是地砷病发病的危险因素；但是，p16基因甲基化可能是地砷病发病的重要危险因素之一，这对阐明地砷病的病因和发病机制有着重要的理论意义。     

p16基因高甲基化在胃癌发展中的作用

目的:通过检测胃癌、癌前病变和正常对照组中p16基因启动子区CpG岛甲基化水平及其表达,并结合临床病理资料,分析他们在胃癌发生、发展中的作用.方法:用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)检测41例胃癌组织、40例癌前病变组织和38例正常对照组织中p16基因启动子5′CpG岛甲基化;应用免疫组化检测基因的蛋白表达.结果:胃癌组织中p16基因甲基化阳性率为56.1%(23/41),癌前病变组织中为17.5%(7/40),而正常对照组织中为2.6%(1/38),前组与后两组之间的差异有显著性(P<0.05).胃癌组织中p16基因表达阳性率为51.2%,癌前病变组织中为90.0%,正常对照组织中为100.0%,前组与后两组之间的差异有显著性(P<0.05).低分化型胃癌组织中的p16基因甲基化阳性率明显高于高分化型(81.3%vs 40.0%,P<0.05).有淋巴结转移的胃癌组织中,p16基因甲基化阳性率与无转移组的差异有显著性(81.0%vs 30.0%,P<0.05).浸润深达浆膜层的胃癌组织中,甲基化阳性率与未达浆膜层组无统计学差异(60.0%vs 52.4%,P>0.05).胃癌组织中p16基因甲基化阳性组的蛋白表达阳性率显著低于甲基化阴性组(26.1%vs 83.3%,P<0.01).结论:胃癌组织中存在有p16基因启动子5′CpG岛高甲基化,并导致其基因表达率显著低于正常对照及癌前病变组织.p16基因的高甲基化与胃癌分化程度、淋巴结转移相关.p16基因甲基化的发生,从正常、癌前病变到胃癌有逐渐增加的趋势,提示其基因CpG岛高甲基化有可能作为诊断早期胃癌的一项较为敏感的指标.     

原发胃癌中p16基因及其甲基化状态、表达异常的研究

目的：检测胃癌组织中p16基因及启动了甲基化状态和p16蛋白表达情况。方法：选择p16基因及启动子区域,用PCR－SSCP、MSP（甲基化特异的PCR）法、测序和免疫组化等方法对100例胃癌患者的癌组织和癌旁组织进行检测。结果：71％的病例p16表达阴性,54％的病例具有p16基因启动子区的高甲基化,50％的病例同时有p16表达阴性和p16基因启动子区的高甲基化,无突变和纯合缺失检出。结论：提示p16基因启动子区域高甲基化是胃癌中p16基因失活的主要原因。     

谷胱甘肽硫转移酶P1基因DNA甲基化、mRNA和蛋白表达与燃煤污染型地方性砷中毒关系探讨

目的 探讨谷胱甘肽硫转移酶P1 (GSTP1)基因启动子区DNA甲基化、mRNA和蛋白表达与砷中毒的关系.方法 123例砷中毒患者来自贵州省兴仁县交乐村燃煤污染型地方性砷中毒病区,按地方性砷中毒诊断标准(WS/T 211-2001),其中轻度42例、中度41例,重度40例.在距病区约13 km的非砷暴露村,选择47例正常健康人作为对照.根据知情同意的原则,采集被调查者的外周血,用PCR法检测外周血GSTP1基因启动子区DNA甲基化,用荧光实时定量PCR法检测GSTP1 mRNA表达.取自愿手术治疗的53例砷中毒患者的皮肤病理标本,其中一般病变28例、癌前病变20例、癌变5例,以病理学诊断无异常的15例非肿瘤手术患者的皮肤组织为对照组.采用免疫组织化学(IHC)法检测皮肤组织中GSTP1蛋白的表达.结果 在按病情分组中,外周血GSTP1基因DNA甲基化阳性率轻(28.57％,12/42)、中(57.10％,23/41)、重度(65.00％,26/40)砷中毒组与对照组(6.38％,3/47)比较差异有统计学意义(x2值分别为7.792、26.000、33.412,P均＜0.01);在按皮肤病理诊断分组中,GSTP1基因DNA甲基化阳性率一般病变(21.43％,6/28)、癌前病变(50.00％,10/20)、癌变组(80.00％,4/5)与对照组(6.67％,1/15)比较差异有统计学意义(x2值分别为3.562、7.468、10.756,P均＜0.05).GSTP1基因DNA甲基化阳性率随砷中毒患者病情及皮肤病理损害程度加重而升高(趋势x2=38.239、x2=13.659,P均＜0.01).与对照组(0.184 26)比较,中(0.087 77)、重度(0.05693)砷中毒组外周血GSTP1mRNA表达显著降低(P均＜0.01),其中重度砷中毒组低于中度砷中毒组(P＜0.01);与对照组(0.33845)、一般病变组(0.276 74)比较,癌前病变组(0.10481)、癌变组(0.043 70)GSTP1 mRNA表达显著降低(P均＜0.01),其中癌变组显著低于癌前病变组(P＜0.01).皮肤组织中GSTP1蛋白阳性表达率组间比较差异有统计学意义(x2=20.948,P＜ 0.05),其中癌前病变组(65.00％,13/20)、癌变组(40.00％,2/5)与对照组(100.00％,15/15)比较差异有统计学意义(x2=12.183、11.778,P均＜0.01).皮肤病损程度与GSTP1蛋白表达强度经Spearman等级相关分析,呈负相关关系(r=-0.520,P＜ 0.05).按GSTP1基因DNA甲基化分组,GSTP1 mRNA和蛋白表达阳性率与非甲基化组(0.187 07、95.74％)比较,甲基化组(0.03840、57.14％)显著降低(Z=9.032,P＜ 0.01;x2=23.134,P＜ 0.01).结论 砷中毒可通过导致人体GSTP1基因启动子区DNA甲基化,进而抑制其mRNA和蛋白表达,GSTP1基因在砷致病或致癌过程中起重要作用.     

原发性肝细胞癌中p16基因甲基化及其蛋白表达分析

目的探讨p16基因的甲基化改变和p16蛋白表达在肝癌的发生发展过程中的作用。材料和方法收集原发性肝细胞癌(HCC)手术切除的新鲜标本10例,石蜡包埋标本3 3例,Ⅰ级8例,Ⅱ级2 1例,Ⅲ级14例(Edmonson分级) ,p16蛋白检测用免疫组化法(ABC) ,p16基因甲基化检测用甲基化特异PCR(MS_PCR)法。结果HCCp16蛋白缺失率65 1% ( 2 8/4 3 ) ,而癌旁组织缺失率11 5 % ( 3 /2 6) ,两者相比有显著差异(P <0 0 1)。Ⅰ～Ⅱ级HCCp16蛋白的缺失率与Ⅲ级相比明显较低(P <0 0 5 )。p16蛋白阳性的15例HCC标本,均未检出基因甲基化,p16蛋白缺失的2 8例标本,有19例检出基因甲基化,甲基化率44 2 %。10例癌旁肝组织有1例基因甲基化,HCC和癌旁组织相比甲基化率有明显差异(P <0 0 5 ) ,基因甲基化与p16蛋白缺失明显相关(P <0 0 1)。各级HCCp16基因启动子区甲基化率有明显差异(P <0 0 5 )。结论p16蛋白缺失与HCC的发生有密切关系,低分化的HCC和p16蛋白缺失有关,p16蛋白在判断其恶性程度方面有一定的价值。基因的甲基化可能是p16基因在HCC中的主要失活方式,HCC分化程度和p16基因甲基化之间有密切关系。     

p16基因启动子区甲基化在人嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中的变化

目的 检测嗜铬细胞瘤(PHEO)和副神经节瘤(PGL)中p16基因突变和启动子区DNA甲基化改变,分析其与患者临床特征之间的关系.方法收集34例(PHEO 20例、PGL14例)组织标本及患者临床资料,通过甲基化特异性PCR(MSP)测定p16基因启动子区甲基化状态,DNA测序检测基因序列以及RT-PCR方法测定其mRNA表达.结果 (1)34例肿瘤组织中未发现p16基因纯合缺失及点突变;(2)35.3%(12/34)的患者存在p16基因高甲基化,p16基因甲基化阳性标本中,PHEO和PGL分别占25%和75%,两者差异有统计学意义(P=0.005);p16基因甲基化在恶性、单发肿瘤、发病年龄早的亚组中有增高趋势(P＞0.05);(3)甲基化与非甲基化肿瘤组织之间p16 mRNA表达无统计学差异;不同特点的肿瘤中其mRNA表达亦无统计学差异,但恶性肿瘤p16 mRNA表达与良性肿瘤相比有下降的趋势(0.83±0.65对1.12±0.81,P=0.278).结论人PHEO和PGL中,p16基因纯合缺失和突变并不常见,但p16基因启动子区甲基化是其失活的主要形式.     

hMLH1基因高甲基化在胃癌发生、发展中的作用

基因启动子区CpG岛甲基化使许多基因失活，从而导致恶性肿瘤的发生和发展。目的：检测hMLHl基因启动子区CpG岛甲基化水平，探讨其胃癌发生、发展中的作用。方法：以甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测41例胃癌、40例癌前病变和38例对照组织中hMLHl基因启动子区CpG岛甲基化状态，并分析其与胃癌患者临床病理特征的关系。结果：胃癌组织中hMLHl基因启动子区CpG岛甲基化阳性率为34．1％，显著高于癌前病变组的5．0％和对照组的0％（P〈0．05）。hMLHl基因甲基化阳性率与胃癌患者的年龄和肿瘤浸润深度有关（阳性率分别为46．4％对7．7％和55．0％对14.3％，P〈0．05），与性别、肿瘤分化程度和淋巴结转移无关（阳性率分别为34．8％对33．3％、28．0％对43．8％和38．1％对30．0％）。结论：胃癌组织中存在hMLHl基因启动子区CpG岛高甲基化，可能与胃癌的发生、发展有关．且可能在老年胃癌患者的肿瘤发生过程中起重要作用。     

Two distinct pathways of p16 gene inactivation in gallbladder cancer

AIM： TO examine the mechanism of inactivation of the p16 gene in gallbladder cancer, and to investigate p16 alterations and their correlation with clinicopathological features.
METHODS： Specimens were collected surgically from 51 patients with gallbladder cancer. We evaluated the status of protein expression, loss of heterozygosity（LOH）, homozygous deletion and promoter hypermethylation using immunohistochemistry, microsatellite analysis, quantitative real-time polymerase chain reaction （PCR） and methylation-specific PCR, respectively. In addition, mutations were examined by direct DNA sequencing.
RESULTS： Homozygous deletions of the p16 gene exon2, LOH at 9p21-22, p16 promoter hypermethylation, and loss of p16 protein expression were detected in 26.0% （13/50）, 56.9% （29/51）, 72.5% （37/51） and 62.7% （32/51）, respectively. No mutations were found. LOH at 9p21 correlated with the loss of p16 protein expression （P 〈 0.05）. Homozygous deletion of the p16 gene, a combination LOH and promoter hypermethylation, and multiple LOH at 9p21 were significantly correlated with the loss of p16 protein expression （P 〈 0.05）. LOH at 9p21 and promoter hypermethylation of the p16 gene were detected in 15.4% （2/13） and 92.3% （12/13） of the tumors with homozygous deletion of the p16 gene, respectively. P16 alterations were not associated with clinicopathological features.
CONCLUSION： Our results suggest that LOH and homozygous deletion may be two distinct pathways in the inactivation of the p16 gene. Homozygous deletion, a combination of LOH and promoter hypermethylation, and multiple LOH are major mechanisms of p16 inactivation in gallbladder cancer.     

EMs患者在位子宫内膜hMLH1蛋白表达变化及其基因启动子CpG岛甲基化观察

目的观察子宫内膜异位症（EM s）患者在位子宫内膜组织中hMLH1蛋白的表达变化及hMLH1基因启动子CpG岛甲基化情况。方法采用免疫组化法分别检测52例（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为9、16、12、15例）EM s患者及30例健康志原者（对照组）在位子宫内膜中的hMLH1,采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）法检测两组在位子宫内膜hMLH1启动子CpG岛甲基化情况。分离hMLH1启动子CpG岛甲基化异常者在位内膜中的腺细胞和间质细胞,采用MSP志愿分别检测两种细胞hMLH1启动子CpG岛甲基化情况。结果 EM s组中hMLH1蛋白表达减弱共6例,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为0、0、1、5例,其余样本hMLH1蛋白表达均呈阳性;对照组30例无hMLH1蛋白表达减弱者,hMLH1蛋白表达均表现为阳性。EM s组中hMLH1启动子CpG岛部分甲基化3例,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为0、0、0、3例,余均表现为非甲基化;对照组30例均表现为hMLH1启动子CpG岛非甲基化。EM s组Ⅳ期患者与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者及对照组相比,P均〈0.05。3例hMLH1启动子CpG岛表现为部分甲基化者子宫内膜组织中hMLH1蛋白表达均减弱,其腺细胞中hMLH1启动子区表现为半甲基化,间质细胞hMLH1启动子区未见明显甲基化条带。结论 EM s患者在位子宫内膜组织中存在hMLH1表达减弱及hMLH1启动子CpG岛部分甲基化,主要集中在腺细胞,hMLH1异常与严重EM s的发病有关。     

胃癌TIMP3基因启动子甲基化及其蛋白表达的研究

目的:探讨组织金属蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3,TIMP3)基因启动子甲基化与其蛋白表达的相关性,并分析 TIMP3基因CpG岛异常甲基化与胃腺癌及其临床病理特征的关联性．方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)技术和免疫组织化学方法分别检测78例患者的胃正常黏膜组织、胃癌组织及转移淋巴结中,TIMP3 基因启动子甲基化和蛋白表达情况．结果:胃正常黏膜组织、早期、进展期胃癌组织和转移淋巴结中TIMP3基因启动子均有甲基化修饰,其阳性率分别为35．9％(28／78); 85．0％(17／20),89．7％(52／58);转移淋巴结 100％(78／78)．胃癌组TIMP3基因启动子甲基化率明显高于胃正常黏膜组(尸<0．05)．胃正常黏膜组织TIMP3蛋白表达全部为阳性(100％), 20例早期胃癌中,6例阳性(30％),58例进展期胃癌中,2例阳性(3．4％),在转移淋巴结中全部不表达(0％)．胃癌70例蛋白表达阴性的标本中,64例TIMP3基因启动子甲基化阳性 (91．4％),TIMP3蛋白表达与启动子甲基化呈明显负相关(P<0．01)．结论:启动子区CpG岛高甲基化是胃癌组织中TIMP3基因表达失活的主要机制,可能成为胃癌分子诊断与病期评估的标志之一．     

Expression, deleton and mutation of p16 gene in human gastric cancer

AIM To investigate the relationship between the expression of p16 gene and the gastric carcinogenesis,depth of invasion and lymph node metastases, and to evaluate the deletion and mutation of exon 2 in p16 gene in gastric carcinoma. METHODS The expression of P16 protein was examined by streptavidin-peroxidase conjugated method (S-P); the deletion and mutation of p16 gene were respectively examined by polymerase chain reaction (PCR) and polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism analysis (PCR-SSCP) in gastric carcinoma. RESULTS Expression of P16 protein was detected in 96.25% (77/80) of the normal gastric mucosa, in 92.00% (45/50) of the dysplastic gastric mucosa and in 47.54% (58/122) of the gastric carcinoma. The positive rate of P16 protein expression in gastric carcinoma was significantly lower than that in normal gastric mucosa and dysplastic gastric mucosa (P＜0.05). The positive rate of P16 protein expression in mucoid carcinoma 10.00% (1/ 10) was significantly lower than that in poorly differentiated carcinoma 51.22% ( 21/ 41 ),undifferentiated carcinoma 57.69% (15/26) and signet ring cell carcinoma 62.50% (10/ 16) (P＜0.05). The positive rate of p16 protein in 30 cases paired primary and lymph node metastatic gastric carcinoma: There was 46.67% (14/30) in primary gastric carcinoma, 16.67% (5/30) in lymph node metastatic gastric carcinoma. The positive rate of lymph node metastatic carcinoma was significantly lower than that of primary carcinoma (P＜0.05). There was of p16 gene mutation in exon 2, but 5 cases displayed deletion of p16 gene in exon 2 in the 25 primary gastric carcinomas. CONCLUSIONS The expression loss of P16 protein related to the gastric carcinogenesis, gastric carcinoma histopathological subtypes and lymph metastasis. The mutation of p16 gene in exon 2 may not be involved in gastric carcinogenesis. But the deletion of p16 gene in exon 2 may be involved in gastric carcinogenesis.     

Expression, deletion [was deleton] and mutation of p16 gene in human gastric cancer

AIM: To investigate the relationship between the expression of p16 gene and the gastric carcinogenesis, depth of invasion and lymph node metastases, and to evaluate the deletion and mutation of exon 2 in p16 gene in gastric carcinoma. METHODS: The expression of p16 protein was examined by streptavidin-peroxidase conjugated method (S-P);the deletion and mutation of p16 gene were respectively examined by polymerase chain reaction (PCR) and polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism analysis (PCR-SSCP) in gastric carcinoma. RESULTS: Expression of p16 protein was detected in 96.25% (77/80) of the normal gastric mucosa, in 92.00% (45/50) of the dysplastic gastric mucosa and in 47.54% (58/122) of the gastric carcinoma. The positive rate of p16 protein expression in gastric carcinoma was significantly lower than that in normal gastric mucosa and dysplastic gastric mucosa (P < 0.05). The positive rate of p16 protein expression in mucoid carcinoma 10.00% (1/10) was significantly lower than that in poorly differentiated carcinoma 51.22% (21/41), undifferentiated carcinoma 57.69% (15/26) and signet ring cell carcinoma 62.50% (10/16) (P < 0.05). The positive rate of p16 protein in 30 cases paired primary and lymph node metastatic gastric carcinoma: There was 46.67% (14/30) in primary gastric carcinoma, 16.67% (5/30) in lymph node metastatic gastric carcinoma. The positive rate of lymph node metastatic carcinoma was significantly lower than that of primary carcinoma (P < 0.05). There was of p16 gene mutation in exon 2, but 5 cases displayed deletion of p16 gene in exon 2 in the 25 primary gastric carcinomas. CONCLUSIONS: The expression loss of p16 protein related to the gastric carcinogenesis, gastric carcinoma histopathological subtypes and lymph metastasis. The mutation of p16 gene in exon 2 may not be involved in gastric carcinogenesis. But the deletion of p16 gene in exon 2 may be involved in gastric carcinogenesis.