Tudor-SN蛋白TSN结构域亚结构片段重组质粒的构建与表达

目的:研究人类Tudor-SN蛋白TSN结构域4个亚片段的功能,构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增出目的基因,将双酶切后带有粘性末端的目的片段和pEGFP-C2载体连接,从而构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。将构建成功的重组质粒用脂质体法转染HeLa细胞,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:对重组质粒进行双酶切鉴定可见Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)的cDNA片段;脂质体转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。结论:真核pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)重组质粒构建及表达成功。     

重组真核质粒pERFP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)的构建和表达

目的:将人类Tudor-SN蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pERFP-C1质粒,使Tudor-SN蛋白SN各功能片段与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pERFP-C1载体上,再将构建成功的pERFP-C1-Tudor-SN-SN(1～4)重组质粒转染入HeLa细胞内,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜下观察到红色融合蛋白的表达。结论:重组pERFP-C1-h Tudor-SN-SN(1～4)质粒构建及表达成功。     

重组组蛋白去乙酰化酶2-pEGFP-C2质粒的构建及表达

目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和BamH I双酶切,用T4连接酶将该cDNA连接pEGFP-C2质粒,将构建成功的pEGFP-C2-HDAC2质粒经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后转染非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot鉴定HDAC2的表达。结果双酶切鉴定可见HDAC2质粒片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,PCR结果可检测到HDAC2 mRNA表达,同时Western blot可检测HDAC2蛋白和GFP蛋白的表达。结论成功构建了重组pEGFP-C2-HDAC2表达质粒,HDAC2蛋白可与绿色荧光蛋白在COS-7细胞中融合表达。     

针对人SND1基因两个AUG的细胞应激分析

【摘要】目的 针对人SND1基因2个蛋白翻译起始密码子AUG构建真核表达质粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/ 2,并分析2个AUG在SND1应激颗粒形成中的作用。方法 以SND1全长转录本为模板,PCR法扩增含BamHⅠ和 EcoRⅠ酶切位点的目的基因SND1-No1/2,双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pCMV-N-Flag,以T4-DNA连接酶将两者连接成pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重组质粒,然后将构建的重组质粒转染入HeLa细胞内,以Western印迹法检测Flag标签（DYKDDDDK）与SND1-No1/2的融合表达,最后以细胞免疫荧光实验检测在氧化应激状态下Flag SND1-No1/2融合蛋白与内源性SND1应激颗粒的胞内共定位情况。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,Western印迹结果检测到融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表达;细胞免疫荧光结果显示Flag-SND1-No1/2 均可与内源性SND1应激颗粒共定位。结论重组pCMV-N-Flag-SND1-No1/2质粒构建成功,SND1基因第1个 AUG的缺失并不影响SND1应激颗粒的形成。     

HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（Core）真核表达载体,并研究其对人宫颈癌 HeLa细胞自噬功能的影响。方法 以 HCV复制子质粒 pJFH1为模板,PCR法扩增 HCV Core 基因片段,经纯化回收后与 PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌 HeLa细胞,并设 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证 HCV Core蛋白在 HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光（IF）和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）的表达水平。结果 获得 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCV Core重组蛋白可在 HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCV Core过表达细胞 LC3焦点和 LC3 Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞 LC3 Ⅱ水平（1.069±0.049）高于 PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建了 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core 重组质粒,HCV Core 蛋白过表达可诱导 HeLa 细胞自噬。     

cyclin G2荧光蛋白重组质粒的构建及其对宫颈癌HeLa细胞的作用

目的 构建包含人cyclin G2基因的荧光蛋白重组质粒,探讨cyclin G2对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响.方法 运用RT-PCR和基因克隆技术构建pDsRed2-Cyclin G2重组质拉;脂质体法转染重组质粒至HeLa细胞中,荧光显微镜下观察其蛋白的表达和定位;流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率.结果 成功地构...     

增强型绿色荧光蛋白基因与hTIMP 1基因融合表达载体的构建及鉴定

目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因与人组织型金属蛋白酶抑制剂1(hTIMP1)基因融合表达载体.方法:Trizol法提取总RNA,经逆转录合成cDNA.通过套式PCR获得hTIMP1开放读码框(ORF),将扩增产物与pEASY-Blunt Simple载体连接,进行序列分析.继而将该重组质粒和载体经XhoⅠ和HindⅢ双酶切,回收hTIMP1 ORF目的片段和pEGFP-C1载体大片段,将两者相连、扩增,筛选重组子进行PCR、双酶切鉴定及接头部分序列分析.结果:扩增得到hTIMP1 ORF约为624 bp,与预期长度相符.hTIMP1 ORF与pEASY-Blunt Simple载体相连,测序结果与GenBank相应序列比较,核苷酸序列无改变.hTIMP1 ORF与pEGFP-C1连接所得融合表达载体经PCR及双酶切鉴定(XhoⅠ和HindⅢ),证实hTIMP1 ORF插入pEGFP-C1.结论:成功构建EGFP基因与hTIMP1基因融合表达载体,为进一步研究hTIMP1蛋白的生物学功能和开展以hTIMP1为靶点的急性冠脉综合征的基因治疗奠定了基础.     

pEGFP-CI-G3BP转染Hela细胞及其在细胞中的表达

目的:了解G3BP蛋白在细胞中的表达及定位。方法:利用脂质体lipofectamine2000将提取的质粒pEGFP-CI-G3BP转染进入Hela细胞,培养24h后荧光倒置显微镜观察绿色荧光的表达情况及其在细胞中的定位。结果:pEGFP-CI-G3BP质粒被成功转入Hela细胞内,转染后绿色荧光可高效表达,分布在细胞胞浆中。结论:脂质体法是一种高效的转染pEGFP-CI-G3BP的方法,表达的G3BP蛋白定位于细胞的胞浆部分。     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

c-myc靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：设计构建重组体为转染肿瘤细胞，观察癌基因的沉默效果，为探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法：以c-myc为靶基因，以pEGFP-C1／U6质粒为载体，设计构建重组体，根据c-myc癌基因cDNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列，克隆到空载体pEGFP-C1／U6中，转化DHSa菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。结果：经酶切鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建小干扰RNA重组体。     

人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人雌激素受体β(ERβ)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,并稳定转染乳腺癌MCF-7细胞。方法通过双酶切将pCMV5-hERβ中的人ERβcDNA克隆到pEGFP-C3中,构建并鉴定重组质粒pEGFP-hERβ,然后转染乳腺癌MCF-7细胞,采用G418(500μg/mL)筛选出稳定转染的细胞系,在荧光显微镜下观察融合蛋白质在真核细胞内的表达分布,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ERβ的mRNA转录水平。结果成功构建重组表达载体pEGFP-hERβ,有效转染并筛选出稳定转染ERβ基因的MCF-7细胞系,外源性ERβ基因在MCF-7细胞中获得了有效转录,并在细胞质和细胞核中均广泛分布。结论建立了稳定表达ERβ的MCF-7细胞系,为筛选ERβ调节剂和进一步研究ERβ在乳腺癌中的作用及其机制奠定基础。     

建立NF-κB核转位的转基因细胞模型

目的建立NF-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)转基因细胞模型。方法 RT-PCR方法扩增p65基因片段;分子克隆技术构建哺乳动物细胞表达载体;脂质体法转染不同细胞;Western blot验证蛋白表达;利用荧光可视化技术观察p65核转位的情况。结果成功获得与绿色荧光蛋白(GFP)融合的载体;并建立p65转基因细胞模型;转基因组中p65蛋白表达量明显高于对照组,给予LPS刺激BV-2后能够促进p65向细胞核转位;而转染后的PC12细胞,p65的核定位现象则呈现不均一性。结论成功建立p65转基因细胞模型,针对不同细胞建立的模型,可用于相关化合物的筛选。     

呼吸道合胞病毒反向遗传系统中辅助质粒的构建

目的  构建可用于表达呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）反向遗传操作中所需的4个功能性结构蛋白的辅助质粒。方法  利用RT-PCR扩增RSV Long株的核蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）及转录延长/终止抑制因子M2-1基因。将N、P、M2-1基因PCR产物双酶切后连接表达载体pCI;L基因分两段扩增并分别与pMD 19-T simple载体连接,再先后切下与pCI连接。将构建得到的4个辅助质粒测序并转染Vero细胞,通过间接免疫荧光法检测相应蛋白的表达。结果  扩增得到N、P、M2-1和L 4个结构蛋白基因,相应构建的辅助质粒经序列测定,与GenBank公布的RSV Long株序列完全一致;间接免疫荧光法检测表明, N、P、M2-1能在Vero细胞中表达。结论  在分子水平构建了RSV反向遗传学研究中所需的4个辅助质粒,并成功表达出3个结构蛋白。     

构建干扰RhoA的短发夹RNA真核表达载体

目的利用pGenesil-1质粒构建针对RhoA的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法设计2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,胶回收酶切pGenesil-1大片段,T4DNALigase连接酶切大片段和DNA序列,得到质粒pGenesil-1-RhoA1和pGenesil-1-RhoA2.转化感受态细胞DH5a,扩增,提取重组质粒进行酶切鉴定。结果成功构建靶向RhoA的shRNA重组质粒载体.酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。结论表达靶向RhoA的shRNA表达框成功构建在重组质粒载体上。     

Establishment of HEK293 cell line expressing GFPAQP1 to determine water osmotic permeability

AIM: To develop an osmotic water permeability assay.METHODS: We subcloned the rat AQP1 cDNA into pEGFPC3 vector. HEK293 cells were transfected with pEGFP-C3/AQP 1 or pEGFP-C3 and selected by G418. The expression of AQP1was detected by RT-PCR and Western blot. Confocal laser fluorescence microscopy was used to record the change of fluorescent density corresponding to the volume change of the cells     

UNC5B基因靶向shRNA表达质粒的构建及体外RNA干扰

目的：探讨人UNC5B基因的双链RNA在体外对UNC5B表达的干扰作用及其规律。方法：构建两个能产生UNC5B的发夹状RNA（shRNA）的质粒载体Pgenesil—UNC581及Pgenesil—UNC582作为实验组，并构建无关序列shRNA表达质粒Pgenesil—NC作为阴性对照，将3种质粒分别转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）。转染24h后，荧光倒置显微镜下观察质粒转染效率，用G418筛选得到稳定转染的细胞，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测UNC5B在HUVECs中的表达情况。结果：转染24h后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，转染效率约为40％～50％。实验组经G418筛选后稳定转染的细胞UNC5BmRNA均受到抑制。两种UNC5B基因靶向shRNA表达质粒对HUVECs中UNC5B抑制率分别为88％和52％。结论：本研究所构建的UNC5BshRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制UNC5B的表达，为进一步实验奠定了基础。