乙型肝炎病毒载量与抗原抗体模式的关系

目的探讨乙型肝炎病毒载量与抗原抗体模式的关系,为乙型肝炎的诊治、预防提供科学依据. 方法用实时荧光定量聚合酶链反应和ELISA检测HBV DNA和抗原抗体,统计分析不同抗原抗体模式的HBV DNA量. 结果在HBsAg和HBeAg阳性模式中,HBV DNA拷贝数＞103/ml者占87.3%,其中＞107/ml者占66.7%;在HBsAg阳性,抗-HBe阳性模式中,HBV DNA拷贝数＜103/ml者占74.5%,＞107/ml者占8.3%;在HBsAg阳性,抗-HBc阳性模式中,HBV DNA拷贝数＞103/ml者占48.0%,＞107/ml者占29.1%.HBeAg阳性模式HBV 载量显著高于HBeAg阴性模式(P＜0.01).抗-HBe阴性模式HBV载量显著高于抗-HBe阳性模式(P＜0.01).在HBsAg阴性模式中,HBV DNA拷贝数＞103/ml占7.9%,1例拷贝数高达1.59×109/ml. 结论 HBeAg阳性模式HBV 载量显著高于HBeAg阴性模式,抗-HBe 阴性模式病毒载量显著高于抗-HBe阳性模式,HBeAg阳性模式中的少数人HBV载量很低,HBeAg阴性模式中少数人HBV载量很高,HBsAg阴性模式中少数人存在病毒复制,因此,对于一具体患者来说,根据抗原抗体模式,难以准确地判断病毒复制程度及其传染性的强弱.     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞HBV DNA载量与其功能的关系

目的:探讨乙型肝炎患者外周血DCs HBV DNA载量与DCs功能的关系.方法:采集20例慢性乙型肝炎患者和10例健康人的抗凝外周静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMCs),IL-4和GM-CSF的作用下培养使DCs增殖、成熟,以流式细胞技术分别检测DCs表面HLA-DR、CD-1α、CD80及CD86的表达:ELISA检测DCs培养上清液IL-12的水平,实时荧光定量PCR法检测DCs HBV DNA的载量,同种异体混合淋巴细胞反应检测DCs刺激同种异体T细胞增殖能力.结果:慢性乙型肝炎患者外周血DCs内亦可检测至HBv DNA,患者DCs表面HLA-DR、CD-1α、CD80及CD86的表达水平、DCs分泌IL-12水平及DCs刺激同种异体T细胞增殖能力均显著低于健康对照组,其中DCs HBV DNA阳性组较DCs HBV DNA阴性组下降更为明显(39.17±6.02 VS 60.11±7.92,46.03±5.52 VS 58.77±4.12,20.95±6.32 VS 35.24±7.41,25.16±6.05 VS 45.30±8.01,19.67±7.32VS 30.74±8.39,0.32±0.08 VS 0.59±0.11,均P＜0.01或0.05);HLA-DR、CD-1α、CD80及CD86的表达、IL-12水平及DCs刺激同种异体T细胞增殖能力与DCs HBV DNA载量呈显著负相关(r=0.713,-0.713,-0.623,-0.702,-0.525,-0.841,均P＜0.001).结论:慢性乙型肝炎患者外周血DCs可被HBV DNA感染,患者DCs HBV DNA载量与DCs功能有密切关系,病毒栽量低者DCs功能好,病毒栽量高者DCs功能差.     

乙型肝炎患者血清HBeAg和抗-HBe与HBV DNA定量的关系

目的分析比较HBV血清标志物HBe Ag与抗-HBe同时阳性、同时阴性及单独阳性患者的病毒复制情况。方法采用电化学发光法检测HBV血清标志物,从中筛选出HBe Ag与抗-HBe同时阳性或均为阴性以及HBe Ag单独阳性或抗-HBe单独阳性的标本,检测该类标本HBV DNA定量值。计数资料组间比较采用χ2检验。结果检测447例患者HBV血清标志物,所有患者HBs Ag均为阳性。HBe Ag与抗-HBe同时阳性患者32例,阳性率为7.16%,其中HBV DNA5×102拷贝/ml占84.38%,5×102拷贝/mlHBV DNA1×104拷贝/ml占12.50%,1×104拷贝/mlHBV DNA1×107拷贝/ml占3.13%;HBe Ag与抗-HBe同时阳性组的HBV DNA含量分布低于HBe Ag单独阳性组,差异有统计学意义(χ2=13.21,P0.01);抗-HBe阳性组的HBV DNA含量分布低于抗-HBe阴性组(χ2=74.12,P0.01);HBe Ag阴性的患者218例,HBV DNA1×104拷贝/ml共9例(4.13%)。结论HBe Ag与抗-HBe同时阳性过去认为是不常见模式,但临床上并不少见,且病毒复制处于较高水平的仍占一定比例;当抗-HBe出现后,病毒复制减弱。血清HBe Ag阴性情况下,部分患者病毒仍存在较高水平复制。因此,HBe Ag存在与否不能作为抗病毒、疗效评价、传染性强弱的依据。     

HBeAg状态及乙型肝炎病毒载量对慢性重型乙型肝炎预后的影响

目的 探讨HBeAg状态及HBV DNA载量对慢性重型乙型肝炎预后的影响.方法 回顾分析2002年1月至2007年12月在南方医科大学南方医院住院的慢性重型乙型肝炎患者406例,研究HBeAg状态、HBV DNA载量对疾病预后的影响.计量资料采用t检验,率的比较采用X2检验.结果 406例重型肝炎患者中,HBeAg阳性208例,占51.2%,HBeAg阴性198例,占48.8%.HBeAg阳性组与HBeAg阴性组比较,两组间男女构成比、TBil峰值及平均凝血酶原活动度谷值差异均无统计学意义;HBeAg阴性组平均年龄(46.7±12.8)岁,显著高于HBeAg阳性组(38.3±13.5)岁(t=6.43,P＜0.01);HBeAg阴性组肝硬化患者占67.7%,亦显著高于HBeAg阳性组的45.7%(X2=19.97,P＜0.01);HBeAg阴性组好转率为32.3%,显著低于HBeAg阳性组的44.7%(X2=6.56,P＜0.05).在208例HBeAg阳性与198例HBeAg阴性患者中,均显示随着HBV DNA载量的升高,其好转率下降,呈显著负相关(X2=22.98,X2=26.04;均P＜0.01).结论 HBeAg阴性重型乙型肝炎较HBeAg阳性者预后差;无论HBeAg状态如何,HBV DNA载量越高,其预后越差.     

血清乙型肝炎病毒载量与抗病毒药物疗效

为了提高α-干扰素(IFN)及拉米夫定(LAM)两种抗病毒药物的抗病毒治疗应答率,我们对乙型肝炎病毒(HBV)不同血清含量的病人分组治疗,发现各组疗效有明显差异。     

乙型肝炎患者HBV—DNA载量与肝功能以及乙型肝炎病毒表面抗原定量的关系

目的研究外周血中HBV—DNA载量与反映肝脏损伤的相关肝功能指标以及乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）定量的关系。方法采用荧光定量PCR（FQ—PCR）检测HBV—DNA载量，用全自动生化仪检测肝功能，时间分辨法（TRFIA）测表面抗原，然后做统计分析。结果丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平与HBV—DNA含量以及表面抗原经相关分析无统计学意义，肝细胞损伤程度与HBV—DNA复制水平以及血清感染标志物HBsAg水平并无明显的关系。结论乙肝患者血清中HBV—DNA水平是评定HBV复制状态的一个重要指标，乙型肝炎患者HBV—DNA载量与肝功能以及表面抗原定量无关。     

乙型肝炎病毒e抗原阳性孕妇所生婴儿联合免疫接种后乙型肝炎病毒血清学标志物的动态变化

目的 观察HBeAg阳性且HBV DNA高载量孕妇所生婴儿用乙型肝炎疫苗联合免疫接种后的母婴阻断效果及HBV血清学标志物的动态变化.方法 回顾性分析HBeAg阳性且HBVDNA≥106拷贝/ml孕妇127例,婴儿出生后即刻及第15天于臀大肌注射高效价乙型肝炎免疫球蛋白200 IU,出生时与第1、6个月于右上臂肌肉注射乙型肝炎疫苗20μg,随访其婴儿至12个月龄.用酶联免疫吸附法及荧光定量PcR检测婴儿出生时及第1、7、12个月时的HBV血清学标志物和HBV DNA载量,观察婴儿出生时HBV血清学标志物模式、母婴传播率、疫苗接种后的HBV宫内感染率、抗-HBs阳性保护率及HBV血清学标志物动态变化.结果 127例孕妇分娩婴儿均为单胎,出生时29例婴儿HBsAg为阳性,其中11例合并HBV DNA阳性,母婴垂直传播率为22.83％.随访至1个月,10例婴儿合并HBV DNA阳性从而发生HBV宫内感染,表现为HBsAg、HBeAg及抗-HBc均为阳性.2例婴儿HBsAg弱阳性,伴有抗-HBs滴度的产生,后续随访中均转阴,乙型肝炎宫内感染率为7.87％.非宫内感染婴儿出生时HBeAg及抗-HBc阳性率分别为96.58％和98.29％,免疫接种后婴儿HBeAg及抗-HBc逐步转阴,均未产生抗-Hbe.非宫内感染婴儿均产生有效乙型肝炎保护性抗体,乙型肝炎疫苗及高效价乙型肝炎免疫球蛋白联合免疫接种后,婴儿抗-HBs滴度从出生至12个月龄逐步上升,母源性HBeAg滴度逐步下降以至转阴.结论 乙型肝炎疫苗联合高效价乙型肝炎免疫球蛋白免疫接种能明显降低HBV母婴传播,增强婴儿乙型肝炎表面抗原保护性抗体,体内母源性HBeAg及抗-HBc亦随之降低甚至转阴.     

HBeAg阴性慢性乙型肝炎急性发作缓解过程MELD评分变化与HBV DNA载量的关系

目的弄清HBeAg阴性慢性乙型肝炎不同程度肝病急性发作的极期及缓解期HBV DNA载量的变化及其差别。方法观察并比较62例乙型肝炎慢加急性肝衰竭和48例慢性乙型肝炎重度肝病急性发作极期和缓解期的MELD评分和HBV DNA载量。结果乙型肝炎慢加急性肝衰竭组和慢性乙型肝炎重度组极期和缓解期的MELD评分及HBV DNA载量均存在差别。乙型肝炎慢加急性肝衰竭组缓解期HBV DNA载量水平低于慢性乙型肝炎重度组。结论无论乙型肝炎慢加急性肝衰竭还是慢性乙型肝炎重度,随着肝病急性发作极期至缓解期MELD评分的减少,HBV DNA载量发生自发性下降,而且,慢加急性肝衰竭下降水平大于慢性乙型肝炎重度。     

脑组织乙型肝炎病毒感染与病毒载量的关系

乙型肝炎病毒(HBV)具有泛嗜性,可在肝外组织器官中感染并复制。我们曾报道[1] 乙型肝炎肝硬化患者脑组织中存在HBV感染。为进一步了解脑组织中HBV抗原表达与血清尤其肝组织中HBV复制水平的关系,我们应用免疫组织化学技术、荧光定量聚合酶链反应(FQ PCR)技术对33例乙型肝炎肝硬化死亡患者脑组织HBsAg、HBcAg及血清、肝组织中HBVDNA含量进行了检测,并进行比较分析,现报道如下。材料与方法一、研究对象33例乙型肝炎肝硬化患者均为近年来收治的住院患者,其中男2 3例,女10例,平均年龄4 7.3岁。16例患者合并肝性脑病,死于肝功能衰竭,1…     

慢性乙型肝炎患者HBV血清标志物与HBV DNA的相关性分析

目的探讨慢性乙型肝炎患者HBV血清标志物(HBV serum markers,HBV-M)HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb和HBcAb IgM含量与HBV DNA水平的相关性,为临床诊断和治疗提供依据。方法采用化学发光微粒子免疫测定法和荧光定量聚合酶链反应分别检测446例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者血清HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb含量和HBV DNA水平,同时检测54例HBcAb IgM阳性患者的血清HBV DNA水平,统计分析HBV-M含量与HBV DNA水平的相关性。结果①CHB患者血清中,HBsAg和HBeAg含量与HBV DNA水平呈正相关(P<0.05),HBeAb和HBcAb含量与HBV DNA水平未见相关性(P>0.05);②HBcAb IgM阳性患者中HBcAb IgM含量与HBV DNA水平亦未见相关性(P>0.05)。结论 CHB患者血清HBsAg和HBeAg含量与HBV DNA水平呈正相关。定量检测HBV-M和HBV DNA能更好地了解HBV的动态变化,对诊断和治疗有重要指导意义。     

妊娠晚期孕妇注射乙型肝炎免疫球蛋白对其血清HBV DNA及新生儿抗-HBs的影响

目的探讨慢性携带HBV孕妇妊娠晚期注射乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）对阻断母婴传播的效果。方法对10例慢性携带HBV未怀孕的育龄妇女和23例妊娠晚期妇女于注射3针HBIG前后,应用定量PCR（FQ-PCR）检测其血清HBV DNA;对28例妊娠晚期注射3针HBIG母亲所生新生儿,应用ELISA检测血清抗-HBs。结果10例慢性携带HBV育龄妇女和23例孕妇于注射3针HBIG前后血清HBV DNA水平分别为（8．18±0．50）lg拷贝／ml比（7．64±0．41）lg拷贝／ml和（6．83±1．51）lg拷贝／ml比（6．83±1．29）lg拷贝／ml,差异无统计学意义（t=5．705,P〉0．05和t=0．048,P〉0．05）。28例妊娠晚期注射3针HBIG母亲所生新生儿无一例抗-HBs阳性。结论于孕晚期注射3针HBIG不能降低孕妇的血清HBV DNA,也不能使新生儿获得抗-HBs,因此,用此法阻断HBV母婴传播缺乏充分的科学依据。     

胎盘滋养层细胞的乙型肝炎病毒感染与宫内感染机制

目的：检测HBV对胎盘、胎肝和滋养层细胞的感染情况，探讨HBV的宫内感染机制。方法：研究对象包括20例孕妇胎盘组织、6例引产胎儿胎肝组织及体外培养的胎盘滋养层细胞。ELISA法检测孕妇外周血、胎儿脐血和6个月婴儿外周血HBV标志物；荧光定量PCR法检测血清和滋养层细胞中的HBV DNA；免疫组织化学法和免疫荧光法检测胎盘、胎肝组织及滋养层细胞中HBV标志物的表达；末端脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口标记法（TUNEL）检测胎盘和滋养层细胞凋亡情况。结果：孕妇血清HBV DNA水平与胎儿脐血HBV DNA水平相关，脐血HBV DNA阳性者其母血HBV DNA〉1.0×10^7拷贝／mL；6例胎盘组织和3例引产胎儿胎肝组织中可见HBsAg免疫组织化学染色阳性细胞，其中1例胎肝组织中发现HBcAg阳性细胞；体外培养滋养层细胞与HBV DNA阳性血清共孵育后，可检测到HBsAg的表达，亦可检测到HBV DNA。体内和体外实验均检测到HBV感染后滋养层细胞凋亡呈增加趋势，且胎盘细胞的凋亡与脐血HBV DNA水平相关。体外实验结果显示，随感染时间的延长，滋养层细胞凋亡呈增加趋势。6个月后，12例新生儿有1例血清HBsAg、HBeAg和抗-HBc阳性，6例抗-HBs阳性。结论：HBV宫内感染的机制可能是通过HBV感染胎盘屏障而使胎儿发生HBV宫内感染。HBV在胎儿组织器官内的定位和复制可能是新生儿发生慢性HBV感染的重要因素。滋养层细胞凋亡可能是胎盘屏障阻断HBV宫内传播的一种保护性机制。     

HepG2.2.15细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测

目的　建立一种细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测方法。方法　消化收集处于对数生长期的HepG2.2.15细胞,取1×106 个细胞用小量质粒抽提试剂盒抽提细胞内的cccDNA,抽提产物用绿豆核酸酶酶切纯化,所得酶切产物用特异的引物和探针进行选择性荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测。用对数生长期前的细胞培养上清液、4 份HBV DNA阳性和2 份HBV DNA阴性的慢性乙型肝炎(轻度)患者血清验证荧光定量PCR法的特异性,并用不同浓度的质粒标准品检测该方法的敏感性。结果　证实HepG2.2.15细胞内存在cccDNA,其含量约为每个细胞18 拷贝。对数生长期前培养上清液和慢性乙型肝炎(轻度)患者血清均未检测到荧光信号,本实验条件下用该方法可检测低至103 拷贝/ml的cccDNA分子。结论　该方法操作方便,特异性高,敏感性较好,可用于定量检测细胞内的cccDNA及抗病毒药物的筛选和评价等。     

五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较

目的 比较5种国内外HBV DNA定量检测试剂盒的灵敏度、特异度和符合率.方法 分别应用A、B、C、D 4种国产和德国Roche公司生产的荧光定量试剂盒检测国家HBV DNA标准品、7份灵敏度稀释血浆(15.6～1 000 IU/mL)、15份健康献血者和45份慢性乙型肝炎患者血浆.统计学分析采用平行性检验.结果 5种试剂盒对9份阳性和8份阴性国家标准品均能正确检出,并能准确定量标准品中的灵敏度样本;对灵敏度稀释血浆,Roche试剂盒和国产试剂盒C、D均能检出最高稀释度样本(15.6 IU/mL),而试剂盒A和B检测限分别为125 IU/mL和500 IU/mL,Roche试剂盒及C试剂盒的定量检测结果与理论值的符合率高,两者检测结果经平行性检验存在线性相关(r>0.98);检测15份健康献血者血浆,试剂盒D有2份假阳性;检测慢性乙型肝炎患者血浆,Roche试剂盒对1×102～1×108 IU/mL范围的样本检测的变异系数均<15%,而国产试剂盒变异系数较大.4种国产试剂盒与Roche试剂盒的符合率为50%～96 %,其中A为61%,B为50%,C为96%,D为83%,试剂盒C符合率显著高于试剂盒D、A和B(X2=5.62,P<0.05;X2=28.93,P<0.01;X2=44.31,P<0.01).各种试剂盒符合率最高的区段均在1×104～1×108 IU/mL.结论 国产HBV DNA定量试剂盒质量差异较大,试剂盒c与Roche试剂盒定量检测HBV DNA的符合率最高,国产试剂盒质量有待进一步提高.     

乙型肝炎病毒基因型与血清HBV DNA水平的关系

目的　探讨乙型肝炎病毒 (HBV)基因型与血清HBVDNA水平的关系。方法　采用PCR、核酸杂交和酶联显色技术以及荧光定量PCR技术 ,分别对 12 3例慢性乙型肝炎 (CHB)患者进行HBVDNA基因分型和血清HBVDNA水平的测定。结果　泉州地区CHB患者的HBV基因型以B型为主 ,其次为C型 ,部分以D型和混合型存在 ,分别占 74 80 %、17 0 7%、3 2 5 %和 5 69% ,无A、E、F型。C基因型的HBVDNA水平 (log值 )为 7 0 5± 1 3 5 ,显著高于B基因型的 6 3 2± 1 0 6,P <0 0 1;而C基因型的HBeAg含量为5 3 62± 2 5 3 2 ,亦显著高于B基因型的 40 1l± 15 17,P <0 0 1。C基因型患者的TBIL、ALT、AST均显著高于B基因型 ,而白蛋白水平则显著低于B基因型 ,P <0 0 1。结论　泉州地区CHB患者以B基因型为主 ,部分以C型、D型和混合型存在。C基因型的血清HBVDNA水平显著高于B型 ,其肝损伤程度亦显著高于B型     

乙型肝炎病毒S基因变异、基因型与宫内感染免疫失败的关系

目的 探讨HBV S基因变异、基因型与宫内感染免疫失败的关系.方法选择东南大学附属南京第二医院出生的35例宫内感染免疫失败的幼儿及其母亲,实时荧光定量PCR法检测血清HBV DNA含量;并扩增其HBV S基因序列,测序并通过DNASTAR软件与基因库标准序列比对.结果幼儿及其母亲HBV DNA定量检测结果均＞1×106拷贝/mL;幼儿及母亲HBV S基因核苷酸变异率分别为11.4%和17.1%;母婴序列同源性＞99.3%;35对母婴中,23对HBV基因型为C型,血清型为adr亚型,12对为B型,血清型为adw亚型,母婴基因型相同.结论 HBV S基因是否变异可能不是高病毒血症患者宫内感染免疫失败的主要因素;基因分型并不能预测和评价新生儿是否发生宫内感染和免疫失败.     

Long-term clinical impact of occult hepatitis B virus infection in chronic hepatitis B patients

BACKGROUND/AIMS: Long-term clinical outcomes of occult hepatitis B virus (HBV) infection were studied. METHODS: Fifteen chronic hepatitis B patients were monitored for a median of 4.4 years (range 0.9-15.3) after hepatitis B surface antigen (HBsAg) seroclearance. Serum HBV DNA was measured by real-time detection polymerase chain reaction. Thirteen patients underwent liver biopsies at the end of follow-up and liver histology was evaluated by Ishak score. Liver HBV DNA was also measured for 12 patients. RESULTS: At the end of follow-up, HBV viremia was absent in 13 (87%) patients, and antibody titers to hepatitis B core antigen showed an inverse correlation with time from HBsAg seroclearance (r=-0.554; P=0.0040). However, all patients retained liver HBV DNA and tested positive for the covalently closed circular HBV DNA replicative intermediate. The hepatic HBV DNA loads had no relation to liver histology. Paired biopsies from 11 patients disclosed that each necroinflammatory score significantly improved after HBsAg seroclearance. Amelioration of liver fibrosis was also evident in eight (73%) patients (P=0.0391 by signed rank test). CONCLUSIONS: A long-standing but strongly suppressed HBV infection may confer histological amelioration after HBsAg seroclearance.     

乙型肝炎病毒总DNA、共价闭合环状DNA和HBsAg在各种慢性乙型肝炎病毒感染者中的定量检测

目的 定量检测慢性乙型肝炎(CHB)、乙型肝炎肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)患者HBV总DNA(tDNA)、HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)和HBsAg,并探讨其特点.方法 荧光定量PCR检测21例CHB、23例LC和25例HCC患者外周血和肝组织标本HBV tDNA、HBVcccDNA,化学发光法定量检测外周血HBsAg.正态数据采用ANOVA分析和t检验,相关性分析采用Pearson检验,非正态数据采用秩和检验.结果 在CHB、LC和HCC患者中,外周血HBVtDNA分别为(5.38±2.08)、(4.96±1.65)和(4.18±0.91)lg拷贝/mL,肝组织HBV tDNA分别为(7.18±1.91)、(6.51±1.87)和(5.87±1.47)lg拷贝/μg,肝组织HBV cccDNA分别为(3.53±2.03)、(2.63±2.13)和(0.58±1.40)lg拷贝/μg,外周血H BsAg分别为(3.30±0.65)、(3.12±0.52)和(2.60±1.03)lg IU/mL,CHB与HCC患者比较,差异均有统计学意义(t=2.446,P=0.013;t=2.562,P=0.014;t=5.799,P＜0.01;t=2.709,P=0.003),LC与HCC患者肝组织HBVcccDNA及HBsAg定量比较,差异有统计学意义(t=-3.894,P＜0.01;t=-2.237,P=0.023).外周血均未检出HBV cccDNA.HBsAg定量与外周血HBV tDNA(r=-0.290,P=0.016)、肝组织HBV tDNA(r=0.372,P=0.002)及肝组织HBV cccDNA(r=0.378,P=0.001)均有关.结论 HBV tDNA、HBV cccDNA、HBsAg在CHB、LC、HCC患者呈逐渐降低趋势,HBsAg定量与外周血HBV tDNA、肝组织HBV tDNA及肝组织HBV cccDNA有关.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA套式-实时荧光定量聚合酶链反应的建立

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的套式一实时荧光定量PCR法.方法 根据HBV cccDNA与松环DNA(rcDNA)结构上的差异,设计2对跨缺口的特异引物及1条位于负链缺口下游的特异TaqMan荧光探针.根据Plasmid-SafeTM ATP-Dependent Dnasc(PSAD)对rcDNA与cccDNA作用的不同,对模板DNA进行酶切纯化,降解reDNA,再进行套式PCR扩增,先用外引物和模板进行第一轮常规PCR,再用内引物、荧光探针和第一轮PCR产物进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照标准品,得出待检标本定量值.结果 检测阳性参照标准品.得出该方法灵敏度可达2 lg拷贝/mL.用上述方法检测34份乙型肝炎患者血清HBV DNA阳性标本,25份血清HBVcccDNA阳性,28份外周血单个核细胞HBV cccDNA阳性.27份健康对照者血清HBV DNA阴性标本,6份HBV cccDNA阳性.对5份HBV cccDNA阳性标本扩增产物进行克隆测序,无碱基缺失、突变.与HBV不同基因型序列(A～G)比较,同源性为90.6%～99.1%,其中,与B、C基因型同源性为95.3%～99.1%,验证了方法的特异度.结论 套式-实时定量PCR法可检测乙型肝炎患者血清、PBMC中的HBV CCCDNA,且具有敏感、特异性.     

慢性乙型肝炎抗病毒疗效与外周血单个核细胞内乙型肝炎病毒DNA水平的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒疗效与达到停药标准时外周血单个核细胞(PBMC)内HBV DNA水平的关系.方法 入选90例经抗病毒治疗达到停药标准的CHB患者,其中应用IFN 44例,应用核苷类药物46例.所有患者均于停药时检测PBMC内HBV DNA,比较阴性组和阳性组治疗前血清HBV DNA水平与达到停药标准时PBMC内HBV DNA的关系,观察停药时PBMC内HBV DNA水平与复发的关系.计量资料采用t检验,计数资料采用X2检验.结果 90例CHB患者停药时,PBMC内HBV DNA阴性组67例,阳性组23例.CHB患者血清HBV DNA阳转率在PBMC内HBV DNA阴性组为13.4%(9/67例),显著低于阳性组的73.9%(17/23例),差异有统计学意义(X2=30.4873,P<0.01).PBMC内HBV DNA阴性组与阳性组在肝病复发ALT升高幅度(t=0.8729,P=0.3913)、停药后复发时间(t=1.9222,P=0.0665)均差异无统计学意义,而在血清HBV DNA反弹幅度则差异有统计学意义(t=2.7493,P=0.0112).5例患者获得HBsAg血清学转换,且均未检测到PBMC内HBV DNA,随访6～12个月无一例复发.PBMC内HBV DNA阳性组治疗前血清HBV DNA水平为(7.2±1.1)lg拷贝/mL,显著高于阴性组的(5.2±2.1)lg拷贝/mL(t=4.3557,P<0.01).结论 经抗病毒治疗达到停药标准的CHB患者,其停药时的PBMC内HBV DNA水平可能是预测抗病毒疗效持久性的重要因素之一.

Abstract：

Objective To explore the relationship between the antiviral effect and peripheral blood mononuclear cell (PBMC) hepatitis B virus (HBV) DNA when the patients reach the standard of withdrawal of antiviral therapy in chronic hepatitis B (CHB).Methods Ninety CHB patients treated with interferon(n=44) or nucleot (s) ide(n=46) who reached the standard of withdrawal of antiviral therapy were recruited.HBV DNA levels in PBMCs were tested at the end of treatment,and its relationship with serum HBV DNA level before treatment in PBMC HBV DNA positive group and negative group were compared.The correlation between HBV DNA in PBMCs at the end of treatment and relapse were explored.Measurement data were analyzed by student t test and enumeration data were analyzed by X2 test.Results Among 90 patients,67(74.4%) were PBMC HBV DNA negative at the end of treatment,and 23(25.6%) were positive.The serum HBV DNA positive conversion rate in PBMC HBV DNA negative patients was 13.4%,which were significantly lower than that in positive group (73.9%) (X2=30. 4873, P<0.01 ). There were no significant differences of alanine aminotransferase (ALT) levels when hepatitis flare (t=0. 8729, P=0. 3913) and relapse time (t=1. 9222, P=0. 0665) between PBMC HBV DNA negative group and positive group after withdrawal of therapy, while the serum HBV DNA rebound was greater in positive group than that in negative group (t=2. 7493, P=0. 0112). There were five patients who achieved hepatitis B surface antigen (HBsAg) seroconversion, whose PBMC HBV DNA were all undetectable, and none relapsed during follow-up for 6-12 months. The pretreatment HBV DNA as level in PBMC HBV DNA positive was (7.2±1.1) lg copy/mL, which was much higher than that in negative group[(5.2±2.1) lg copy/mL] (t=4. 3557, P<0.01). Conclusions In patients who reach the standard of drug withdrawal,PBMC HBV DNA at the end of treatment is an important predictor for durability of antiviral therapy in CHB.