超声微泡介导绿色荧光蛋白基因在视网膜神经节细胞表达的实验研究

目的探讨超声微泡介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中的转染效率、优化转染的条件及毒性。方法体外培养RGCs,以GFP基因为报告基因,微泡造影剂(声诺维)为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染RGCs。实验组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成亚组;对照组为空白对照。荧光显微镜和流式细胞仪测定GFP的表达,MTT法检测RGCs的活性。结果与超声+质粒组相比,超声+微泡+质粒组RGCs转染率增加约5倍。优化转染条件后,频率300kHz,声强1.25W/cm2,连续波,辐照时间60s,微泡浓度45μg/ml,质粒浓度50μg/ml时,24孔板培养的RGCs转染率为(26.87±3.12)%。毒性实验证明超声微泡在该条件下进行基因转染对RGCs无毒副作用。结论在一定条件下,超声破裂微泡能增强基因的转染与表达,有望成为一种安全、有效的基因载体。     

超声辐照和SonoVue微泡在介导hAng-1基因体外转染时的作用和量效关系探讨

目的 探讨超声辐照和SonoVue微泡分别使用和联用在介导hAng-1基因体外转染过程中的作用以及辐照强度和微泡浓度对转染效率和细胞活性的影响.方法 实验分四组A组:单纯超声辐照+质粒组;B组:微泡+质粒组;C组:超声辐照+微泡+质粒组和空白对照组D组. C组内转染参数分别设置为超声照射强度0.5、1.0 、1.5和2.0 W/cm~2,微泡浓度5%、10%、20%、30%和40%.将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡对293T细胞进行转染,48 h后检测各组基因转染效率和细胞存活率. 结果转染48 h后C组转染效率最高,荧光阳性细胞数最多,强度最大;A组转染效率很低,见少量荧光表达;B、D组无明显基因转染发生.随着超声照射强度和微泡浓度的增加,基因转染效率会逐步升高,具有统计学意义.微泡浓度大于20%、超声照射强度超过1.5 W/cm~2后基因转染效率不再升高甚至降低,细胞死亡率显著增高(P<0.01).结论 SonoVue微泡介导外源基因转染必须联合超声辐照才能获得较好的转染效率.对于hAng-1基因和SonoVue微泡,选择声强1.5 W/cm~2,微泡浓度20%是相对最佳转染条件.     

超声微泡介导pEGFP-N1质粒转染人牙周膜成纤维细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下,介导质粒pEGFP-N1转染人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的效率及安全性.方法 体外原代培养HPDLFs,以EGFP基因为报告基因,脂质微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染HPDLFs.实验组超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成不同亚组,对照组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和脂质体+质粒组.转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP表达.同时用MTT法检测HPDLFs的活力.结果 超声微泡介导的质粒对HPDLFs的转染效率与脂质体介导的质粒转染效率相似,明显高于其他对照组.超声+微泡+质粒组中HPDLFs的活力明显高于脂质体+质粒组.结论 在一定条件下,超声微泡能安全、有效地介导外源基因的转染与表达.     

脉冲超声辐照微泡增强脂质体介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨脉冲超声辐照微泡超声造影剂提高脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒在肝癌,细胞(HepG2)中转染率的可行性.方法 将HepG2接种在24孔板中,随机分为以下6组:①空白对照组;②质粒+脂质体组;③超声+质粒组;④超声+质粒+微泡组;⑤超声+质粒+脂质体组;⑥超声+质粒+脂质体+微泡组.荧光显微镜及流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白表达及转染效率;MTT法检测此转染方法对HepG2生长活性的影响.结果 超声+质粒+脂质体组的转染效率最高,并对细胞活性无明显影响;而超声+质粒+脂质体+微泡组转染效率与超声+质粒+脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但细胞活性与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脉冲超声辐照可介导基因转染,并能提高脂质体基因转染效率.同时,在一定条件下,超声微泡造影剂可提高超声介导基因转染效率,此方法可为基因转染提供新的思路.     

超声辐照联合微泡造影剂介导人血管生成素-1基因体外转染293T细胞的研究

目的 探讨超声辐照联合微泡造影剂的基因转染系统介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的转染效率.方法 将六孔板中的293T细胞悬液分为4组:A组,超声+质粒组,每孔加入10 μg目的 基因质粒;B组,超声+微泡+质粒组,每孔加入微泡和质粒混合液,终浓度分别为质粒10 μg/孔,微泡200 μl/孔;C组,脂质体+质粒组,每孔加入4 μl脂质体和5 μg质粒;D组,对照组,每孔仅加入10 μg目的 基因质粒.A组和B组均接受超声辐照,照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,作用时间为30 s.转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量观察基因的转染效率.结果 48 h后,荧光显微镜下观察到转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组、D组的基因转染效率分别为(3.5±0.4)%、(20.8±1.2)%、(18.0±0.9)%和(0.2±0.1)%.结论 超声本身即有促进基因转染的作用,超声辐照联合微泡造影剂后则增强了这种作用,明显增加了基因的转染效率.     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N1转染小鼠角膜的实验研究

目的 探讨微泡造影剂声诺维联合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染小鼠角膜的转染效率和安全性.方法 小鼠眼前房分别注射生理盐水、质粒+生理盐水、质粒+造影剂、脂质体+质粒等,以50 Hz,2 W/cm2的脉冲波超声辐照质粒+生理盐水和质粒+造影剂眼10 min.术后第1 d、第3 d、第7 d、第14 d和第21 d荧光体视镜观察眼表EGFP表达出现情况,冰冻切片荧光显微镜观察阳性细胞的分布,病理切片观察组织有无损伤.结果 造影剂联合超声辐照组小鼠眼表出现绿色荧光蛋白的弥漫性表达,明显高于单纯超声辐照组和脂质体转染组,其余对照各组眼表均未见绿色荧光.第3 d时的病理切片各组均无异常.结论 声诺维联合超声辐照在体能安全、有效地介导基因转染眼组织.     

纳米微泡介导GFP转染小鼠骨骼肌细胞的实验研究

目的 探讨两种纳米微泡(白蛋白外膜和磷脂外膜)增强基因转染小鼠骨骼肌的作用.方法 以正常C57B10小鼠胫前肌为研究对象,目的基因GFP与微泡混合注入小鼠胫前肌,一侧胫前肌经超声(1MHz脉冲波,脉冲重复频率为100 Hz,20％工作周期,空间峰值时间峰值声强为2 W/cm2,辐照作用时间30 s),另一侧胫前肌不经超声辐照.观察白蛋白纳米微泡及磷脂纳米微泡增强骨骼肌细胞GFP转染水平的作用.1周后处死小鼠,荧光显微镜观察发出绿色荧光者为GFP阳性肌纤维细胞,计数最大GFP阳性肌纤维细胞数,作为GFP基因转染效率指标.结果 ①白蛋白纳米微泡组和白蛋白纳米微泡+超声组最大GFP阳性肌纤维数显著高于阴性对照组(P＜0.05),显著低于阳性对照组(P＜0.05).②磷脂纳米微泡组与阴性对照组及阳性对照组比较,最大GFP阳性肌纤维数差异均无统计学意义(P＞0.05).磷脂纳米微泡+超声组最大GFP阳性肌纤维数较阴性对照组显著增高(P＜0.05);磷脂纳米微泡+超声组与阳性对照组最大GFP阳性肌纤维数差异无统计学意义(P＞0.05).结论 纳米微泡可增强基因转染骨骼肌细胞效率,白蛋白含氟化气体纳米微泡具有发展潜力.     

超声联合微泡增强脂质体介导基因转染RPE细胞的实验研究

目的 比较声诺维联合超声与脂质体法介导基因转染RPE细胞的转染率和安全性,探讨超声联合微泡增强脂质体转染率的可行性.方法 RPE细胞培养在24孔板,质粒用量2 μg/孔,分为对照组、超声辐照组、超声联合微泡组(包括2 W/cm2和3 W/cm2两个亚组)、脂质体组、脂质体+超声+微泡组5组,每组10孔细胞.荧光显微镜观察基因转染情况,流式细胞仪检测基因转染率,Annexin Ⅴ-FITC和PI双染流式细胞法检测凋亡率.结果 单纯超声辐照组基因转染率为(1.06±0.13)%,超声联合微泡组分别为(15.81±1.70)%和(20.86±2.63)%,脂质体组为(30.06±3.49)%,明显高于超声联合微泡组(P<0.05).脂质体+超声+微泡组为(44.51±1.28)%,明显高于脂质体组(P<0.05).结论 脂质体介导EGFP转染RPE细胞的效率高于超声联合微泡的转染率.超声联合微泡能明显提高脂质体的转染率.     

超声靶向微泡破裂联合聚乙烯亚胺介导大鼠心肌母细胞Bax基因沉默

目的 探讨超声靶向微泡破裂(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)联合聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的方法转染大鼠心肌母细胞(H9c2细胞)以达到沉默Bax基因的效果.方法 构建靶向Bax基因的shRNA表达质粒,将其与微泡及PEI共同处理后加入H9e2细胞并予以超声辐照,实验分组为:①单纯质粒组;②Lipofectamine2000+质粒组;③UTMD+质粒组;④PEI+ UTMD+质粒组;⑤PEI+ SonoVue+质粒组(无超声辐照).采用荧光显微镜和FCM法评估基因转染效率,应用RT-PCR检测Bax mRNA水平的变化,Western Blot检测蛋白表达情况.结果 超声辐照对所构建的BaxshRNA表达质粒无破坏.H9c2细胞采用UTMD+ PEI处理后,转染率显著高于其他各组(P＜0.05).PT-PCR及Western Blot检测结果显示,PEI+UTMD+质粒组Bax mRNA及Bax蛋白表达抑制率分别为(71.41±4.91)％及(64.09±2.38)％,显著高于其余各组(P＜0.05).结论 超声靶向微泡破裂联合聚乙烯亚胺的方法能有效地沉默H9c2细胞Bax基因的表达.     

脂质体微泡对超声介导基因转染的增效作用研究

目的 探讨超声介导基因转染时,脂质体微泡(LM)对体内、外红色荧光蛋白基因(RFP)转染的增效作用及其安全性.方法将RFP和LM加入培养的Hela细胞后行超声辐照(US),对微泡浓度、超声强度、辐照时间进行优化研究,运用荧光显微镜、流式细胞术评估基因转染率,并对细胞损伤进行分析.在裸鼠移植瘤的体内实验中,将LM和RFP质粒(P)经尾静脉注入后予以超声辐照(P+LM+US),以单纯质粒注射(P)、P+US、P+LM作为对照,行冰冻切片,组织学检查,RFP表达检测.结果培养的Hela细胞经LM和超声辐照联合处理后,RFP基因转染率显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01),在超声强度为1.0 W/cm2、微泡浓度为6%、辐照3 min的条件下最显著,且未发现显著的细胞损伤.P+LM+US组的裸鼠移植瘤内RFP表达显著高于P组、P+US组或P+LM组,差异均有统计学意义(P＜0.01),且未观察到明显的组织损伤.结论 LM对超声介导基因转染的体内、外转染效率有显著的增效作用,而无明显的细胞或组织损伤,为临床基因治疗提供一种新颖、高效、安全的非病毒基因转染方法.     

Ultrasound-mediated microbubble destruction enhances gene transfection in pancreatic cancer cells

INTRODUCTION: The purpose of this study was to determine whether ultrasound exposure combined with microbubble destruction could be used to enhance non-viral gene delivery in human pancreatic carcinoma cells (PANC-1). METHODS: The study was performed with four experimental groups: Group P, plasmid alone; Group P+M, plasmid and microbubbles; Group P+U, plasmid and ultrasound; Group P+U+M, plasmid with ultrasound and microbubbles. Plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pEGFP) was gently mixed with commercially available ultrasound microbubble contrast agents (SonoVue(R); Bracco Diagnostics Inc, Milan, Italy) in Group P+M and Group P+U+M. The different combinations of DNA and DNA plus microbubbles were added to cultured PANC-1 cells under different conditions. Transfection efficiency and cell viability were assessed by FACS analysis (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), confocal laser scanning microscopy, and trypan blue staining. RESULTS: The results demonstrated that microbubbles with ultrasound exposure could significantly enhance the reporter gene expression as compared with other groups (Group P+U+M, 21.4%+/-3.16%; Group P, 2.9%+/-0.45%; Group P+M, 3.1%+/-0.51%; Group P+U, 6.1%+/-1.27%; P<0.01). No statistically significant difference was observed in the PANC-1 cell viability between Group P+U+M and other groups (P>0.05). CONCLUSION: Our in-vitro findings suggest that ultrasound-mediated microbubble destruction has the potential to promote efficient gene transfer into PANC-1 cells without significant cell death. This non-invasive gene transfer method may be a useful tool for safe clinical gene therapy of pancreatic cancer in the future.     

超声微泡转染前列腺癌细胞的参数筛选

目的观察不同辐照参数下超声微泡对前列腺癌细胞生长及基因转染效率的影响。方法采用噻唑兰比色法检测单纯超声、单纯微泡、超声辐照微泡对前列腺癌细胞生存率的影响。荧光显微镜观察超声微泡介导的质粒为EGFP基因与HSV l-TK基因共表达载体。观察它对前列腺癌细胞PC-3转染后荧光表达情况,Westernblot检测EGFP蛋白的表达情况。结果 MTT显示超声强度为1.0W/cm2,频率为1MHz,辐照时间30s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;采用不同浓度的微泡对前列腺癌细胞PC-3作用24h后,各实验组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);当采用最适的超声辐照时间辐照微泡浓度为10、20、40、80μL时,超声+微泡(80μL)组细胞存活率低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),而10、20、40μL组中细胞生长良好;转染EGFP后48h,在荧光显微镜观察对照组未见荧光表达,其他各组中均有荧光表达,并随着微泡剂量的增加,荧光表达量增多;Western blot检测显示各处理组中均有EGFP蛋白的表达,超声+微泡(20μL)+TK(1μg)组、超声+微泡(40μL)+TK(1μg)组的EGFP蛋白表达明显高于其他各组。结论在最适辐照参数下,超声微泡造影剂能够有效地促进TK基因的转染。     

不同浓度超声微泡结合共聚物P85对人肝癌细胞HepG2基因转染的影响

目的 不同浓度超声微泡造影剂(MB)结合共聚物P85后联合一定强度超声(US)辐照,初步摸索最适人肝癌细胞HepG2质粒转染及表达的MB浓度。 方法 以人肝癌细胞HepG2为研究对象,以绿色荧光蛋白(EGFP)质粒为报告基因,添加共聚物P85和不同浓度的MB后进行脉冲多普勒US辐照。24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率。 结果 MB浓度在30%时达到较理想的转染率(22.14±3.06)%,且细胞存活率无明显下降(55.73±3.32)%。添加MB后基因转染率均较pEGFP+P85+US转染率高。 结论 MB与共聚物P85结合同时给予US辐照可增强基因转染率,且在MB浓度为30%时达到较理想的转染率。     

超声联合聚乙烯亚胺增强MCF-7癌细胞基因表达的转染参数优化

目的 探讨超声辐照并超声造影剂联合聚乙烯亚胺(PEI)增强MCF-7乳腺癌细胞质粒DNA转染的最优条件及协同作用.方法 制备PEI/荧光素酶质粒(pCMV-luciferase-GL3)复合物,用于MCF-7癌细胞基因转染,超声辐照前添加超声造影剂SonoVue.通过荧光素酶活性和细胞存活率的测定,对超声辐照参数进行优化,对质粒浓度、孵育时间、血清、溶媒类型、培养基体积等因素进行分析.结果 细胞活力和荧光素酶活性均受超声强度、辐照时间和占空比的影响,适当条件的超声辐照可促进PEI/DNA复合物渗透入胞内,从而提高质粒DNA的转染率.最优超声辐照条件为1 w/cm2,10%占空比,辐照3 min.超声辐照并超声造影剂联合PEI的转染效率显著高于单纯超声辐照和PEI转染(P<0.01).在超声辐照前将细胞与PEI/DNA复合物共孵育2h时,荧光素酶活性显著增强(P<0.01).此外,血清、培养基体积和溶媒类型也对转染效率有影响.结论 优化的超声和转染参数能显著提高MCF-7癌细胞的基因表达效率.超声辐照并超声造影剂联合PEI对DNA转染效率有协同作用,是一种增强质粒DNA基因表达简单而有应用前景的方法.     

超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在ECV304细胞和BALB/c鼠心肌中的表达

目的 探讨经超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在体外ECV304细胞的转染效率及表达情况和在BALB／c鼠心肌中的表达及显像效果。方法 18只BALB／c小鼠分为裸质粒组（P组）、质粒＋超声介导转化组（P＋U组）、质粒＋白蛋白微泡＋超声介导转化组（P＋M＋U组），每组6只。选择携带增强绿色荧光蛋白基因（EGFP）的质粒DNA并与自制的白蛋白微泡相混，以超声介导白蛋白微泡破裂方法分别在体外对ECV304细胞及体内对BALB／c鼠心肌细胞进行基因转染，并测定基因转染和表达效率。结果 体内和体外研究表明，超声介导的白蛋白微泡破裂组（P＋M＋U组）与P和P＋U组相比可明显提高外源性基因转染及表达效率（P〈0．01）。体外采用频率0．8MHz、声强1．0W／cm^2、10％占空比，并30s两次的超声介导白蛋白微泡破裂可有效稳定地转染EGFP基因在ECV304细胞中的表达，并对细胞无毒副作用；体内超声介导白蛋白微泡破裂后具有良好的心肌灌注显像效果。结论 超声介导的白蛋白微泡破裂是一种安全且有效的基因转染方法，在一定的超声条件下可明显提高外源性基因在体内和体外的转染和表达。     

Physical parameters affecting ultrasound/microbubble-mediated gene delivery efficiency in vitro

Ultrasound (US)/microbubble-mediated gene delivery is a technology with many potential advantages suited to clinical application. Previous studies have demonstrated transfection but many are unsatisfactory in respect to the exposure apparatus, lack of definition of the US field or the limitations on parameters that can be explored using clinical diagnostic US machines. We investigated individual exposure parameters using a system minimising experimental artefacts and allowing control of many parameters of the US field. Using a 1-MHz transducer we systematically varied US parameters, the duration of exposure and the microbubble and DNA concentrations to optimise gene delivery. Delivery was achieved, using lipid microbubbles (SonoVue) and clinically acceptable US exposures, to adherent cells at efficiencies of approximately 4%. The acoustic pressure amplitude (0.25 MPa peak-negative), pulse repetition frequency (1-kHz) and duration of exposure (10 s) were important in optimising gene delivery with minimal impact on cell viability. These findings support the hypothesis that varying the physical parameters of US-mediated gene delivery has an affect on both efficiency and cell viability. These data are the first in terms of their thorough exploration of the US parameter space and will be the basis for more-informed approaches to developing clinical applications of this technology.     

不同超声参数及转染方式对细胞活力和红色荧光蛋白基因传输的影响

目的 探讨不同超声参数和转染方式对细胞活力和红色荧光蛋白(RFP)基因传输的影响.方法 以两种不同的转染方案培养人宫颈癌细胞(Hela):(A)培养24 h以完全黏附培养板;(S)细胞悬液.对培养的细胞进行超声辐照(强度为1.0 W/cm2;占空比10%、20%、50%;辐照1 min或3 min),比较这两种转染方案和不同超声参数对细胞活力及RFP表达效率的影响.运用最优参数对其他4种不同类型的细胞(HepG2、lshikawa、MCF-7和B16-F10)行超声处理.结果 A组细胞活力随着占空比的增加、辐照时间的延长而逐步降低,超声辐照导致贴壁的细胞从培养板脱离.与A组相比,S组经相同超声参数转染的细胞数目明显增加,但存活率无明显下降.悬浮方式的转染方案,20%占空比,辐照3 min,是获得较高基因转染效率[(28.04±2.27)%]和存活率[(81.20±1.73)%]的最优选择.当培养细胞暴露于最优条件时,不同类型的细胞对超声的反应性不同.与非辐照组相比,辐照组转染率和死亡率均有不同程度的增加.结论 不同超声参数和转染方式对细胞活力和基因传输效率有较大的影响,对超声介导微泡增强的基因传输需要深人地进行优化研究,以提高转染效率.