大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定

目的：纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法：取1~3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）鉴定星形胶质细胞.结果：培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95%以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP表达阳性.结论：该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.     

ICR胎鼠原代神经元细胞培养及鉴定

目的 建立较理想的胎鼠神经元细胞体外原代培养方法。方法 取13.5 d ICR胎鼠的大脑皮层,经剪碎消化得到单细胞悬液进行培养,观察细胞形态并作PCR及Western blotting等进行神经元相关的基因及蛋白Tuj1和Map2的鉴定。结果 细胞生长状态良好,细胞胞体明显,周围有明亮光晕,细胞突触交错形成网络样,通过PCR及Western blotting验证证明所分离培养的细胞是神经元细胞。结论 本培养方法简单易行,可获得典型和纯度较高的ICR胎鼠大脑皮层神经元细胞。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法的建立及鉴定

目的:大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养、纯化和鉴定.方法:新生1-3d大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定星型胶质细胞.结果:培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态且生长旺盛,第3代星形胶质细胞纯度达95％.结论:本研究建立的星形胶质细胞体外培养方法操作简单、可靠.     

新生大鼠海马神经元原代培养及膜片钳全细胞记录

目的探讨一种适用于膜片钳全细胞记录的海马神经元培养方法。方法选择鼠龄在1d内的Wistar大鼠,迅速断头,取双侧海马,神经基础培养基添加B-27及L-谷氨酰胺进行神经元原代培养,培养至第10天时,使用免疫荧光技术配合神经元特异性核蛋白NeuN进行细胞鉴定;神经元的电生理特征由膜片钳全细胞记录。结果该方法所培养神经元状态良好,经鉴定发现纯度可高达100%,通过膜片钳全细胞法可记录到自发性动作电位及自发性兴奋性突触后电流。结论本方法操作简便、高效,所培养的海马神经元状态良好,适用于膜片钳全细胞记录。     

八肽胆囊收缩素对新生小鼠大脑皮层神经元生长的影响

目的：探讨八肽胆囊收缩素（octa-peptide cholecystokinin,CCK8）对体外培养的新生小鼠大脑皮层神经元生长的影响。方法：原代培养新生小鼠大脑皮层神经元,采用烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）免疫细胞化学染色法鉴定皮层神经元,培养24h的皮层神经元随机分为对照组和CCK8刺激组（终浓度为10-7mol/L）,作用24h、48h、72h、96h后,倒置相差显微镜下行动态观察,MTT法检测细胞的生长活性并以OD值绘制生长曲线。结果：CCK8处理后,有突起的神经元数目增加,存活时间延长,同一时间点的细胞活性明显增强,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：CCK8能促进皮层神经元的生长,延长其存活时间。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较理想的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法。方法:新生大鼠大脑皮层通过胰酶消化获取单细胞悬液,用台盼蓝染色鉴定活性后种板培养;培养第3~4天加入阿糖胞苷纯化神经元;最后用甲苯胺蓝染色检测尼氏体进行鉴定。结果:实验获取细胞存活率高;在体外培养条件下细胞生长旺盛,培养第6~7天,细胞胞体较大,突起粗,分支多,突起交织成网,并能形成典型的神经细胞网络;培养第10~14天,检查有尼氏体细胞占90%以上。结论:该培养技术是大鼠皮层神经元体外培养的一种较理想的方法。     

一种简单高效的新生鼠海马神经元原代培养方法

【目的】建立一种简单、高效、高纯度的新生小鼠海马神经元的原代培养方法。【方法】取出生24 h内的C57BL/6J新生鼠,分离海马组织,采用胰蛋白酶消化加机械吹打的方法获得单个细胞,用含体积分数1%B27及2%Glutamax-100X、终浓度25μmol/L Glutamate的Neurobasal-A培养基接种培养,3 d后用去Glutamate成分的上述培养基换液,并加阿糖胞苷作用48 h以抑制胶质细胞增长。于倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态,采用微管蛋白相关标志物2(MAP2)及Hoechst33258免疫荧光染色鉴定神经元纯度。【结果】此培养方法获得的海马神经元生长状态良好,细胞形态从接种时的圆形透亮、无突起,到培养第7天后发展为神经元胞体聚集、树突发达并形成纵横交错的神经网络;经鉴定,神经元的纯度高达97.2%以上,且能稳定存活2~3周。【结论】该方法操作简单、高效,所得神经元纯度高,结果稳定。     

SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外原代培养

目的：建立原代培养的SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系.方法：取新生24 ～48 h的SD大鼠,无菌操作取出大脑皮层,剪碎后用胰酶消化、机械吹打制成分散细胞悬液,网筛过滤,将细胞悬液接种培养7～9d;置于摇床（37℃、250 r/min振摇6h）,弃掉含脱离细胞的细胞悬液,去除小胶质细胞及少突胶质细胞,细胞传代,进行GFAP细胞免疫荧光鉴定.结果：成功分离和培养原代星形胶质细胞,GFAP免疫荧光鉴定星形胶质细胞比例在95％以上.结论：采用该培养方法能够成功的建立原代SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系,为研究神经系统疾病及其相关疾病提供了可靠的细胞模型.     

乳鼠皮层神经元原代培养与观察

目的:通过原代培养乳鼠皮层神经元,为脑血管疾病的研究提供实验模型。方法:酶消化法原代培养出生1天Wistar乳鼠的皮层神经元,利用免疫细胞化学和免疫荧光方法进行鉴定。结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长。免疫细胞化学染色显示神经元特异性烯醇化酶阳性细胞达85%,免疫荧光显示胶质细胞酸性蛋白阳性细胞达15%。结论:酶消化法原代培养乳鼠皮层神经元是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的建立一种简便的新生大鼠皮层神经元的体外原代培养方法。方法取新生24 h内的大鼠,分离大脑皮层,消化后接种于L-多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶内,以含胎牛血清的DMEM高糖培养基为种植液,24 h后换用含有B27的Neurobasal的无血清培养基维持,倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光染色法鉴定皮层神经元纯度。结果接种后2 h,皮层神经元开始贴壁;随着时间延长,贴壁细胞增多,细胞长出突起,神经元突起间逐渐开始交织成网。接种后7 d神经元胞体丰满,突起明显延长,相互间形成了明显的神经网络。经NSE免疫荧光技术鉴定神经元纯度为(93.57±3.9)%。结论该方法简单易行,可获得高纯度的大鼠皮层神经元。     

体外培养新生大鼠海马神经元突起的形态学

目的研究体外培养过程中，神经元的形态学。方法用扫描电镜观察体外培养的新生大鼠海马神经元在体外发育过程中，神经突起的形态学。结果培养海马神经元呈现梭形、三角形、锥体形等多种形态；神经突起随着培养时间延长，逐渐出现长度增加，突起分支增多；扫描电镜下，突起上显示串珠样膨大的膨体样结构，垂直分出呈鼓槌状的树突棘，突起来梢有矛头样和泪滴状生长锥，并见突起之间有连接存在。结论体外培养的海马神经元，在形态学上经历了与在体相似的变化，并且具有执行神经元功能的基本形态学基础。     

体外培养新生大鼠海马神经元的图象分析

目的：研究体外培养海马神经元不同时期的形态学变化。方法：用图象分析方法，研究体外培养的新生Wistar大鼠海马神经元在不同时间的形态、细胞数密度、面数密度、长度密度以及分支数密度的发育性变化情况。结果：体外培养的海马神经元呈梭形、锥体形、多角形多形性生长。随着培养时间的延长，细胞数密度和面数密度保持不变，突起长度密度和分支密度逐渐增加，突起上膨体样结构数密度增加。结论：体外培养的新生大鼠海马神经元在离体1-14d，随着培养时间的延长，细胞突起、分支数目以及膨体样结构逐渐增多，细胞间连接增加，呈现形态和功能成熟过程。     

荧光示踪法在检测神经元细胞间缝隙连接功能中的应用

目的:建立细胞荧光示踪法定量检测神经元细胞间缝隙连接功能。方法:原代培养神经元细胞,免疫荧光法鉴定神经元细胞的纯度。2种不同分子量的荧光染料Calcein和Dil与神经元细胞共同孵育30 min制成供体神经元细胞,与受体神经元细胞共同孵育2.5 h后,在倒置荧光显微镜下观察供体神经元细胞周围的受体神经元细胞数目。结果:原代培养的神经元细胞纯度达90%,可用于检测神经元细胞缝隙连接功能的实验。所建立的方法可以清晰观察到供体神经元细胞周围受体神经元细胞,并可以计数。结论:本实验所建立的荧光示踪法能够定量检测神经元细胞间缝隙连接功能。     

新生鼠下丘脑结节乳头核组胺能神经细胞的原代培养

目的 探讨新生鼠下丘脑结节乳头核(TM)组胺能神经细胞的体外培养方法。方法 从新生鼠(24h内)下丘脑后部分离出TM神经细胞，采用含有B27的Neurobasal Medium培养液进行体外原代培养。应用免疫细胞化学染色对培养的细胞进行鉴定。结果 从新生鼠下丘脑中分离的TM神经细胞，在本实验条件下生长良好。原代培养7～9d的神经细胞在形态上趋向成熟。免疫细胞化学染色结果表明培养的神经细胞呈组胺免疫反应阳性。为组胺能神经细胞。结论 新生鼠下丘脑TM神经细胞可进行体外原代培养，它可作为研究中枢组胺神经系统的体外细胞模型。     

HPK1在缺糖缺氧诱导的大鼠海马神经元凋亡中的作用

目的观察造血祖细胞激酶1（HPK1）对缺糖缺氧（OGD）诱导的大鼠海马神经元凋亡的作用。方法采用细胞免疫荧光技术通过免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察HPK1是否在大鼠脑细胞中存在;采用DAPI染色技术观察HPK1反义寡核苷酸对OGD诱导的海马神经元凋亡的作用。结果在体外培养的原代大鼠海马神经元中有HPK1的表达。HPK1反义寡核苷酸对OGD诱导的海马神经元凋亡具有保护作用,并有剂量依赖性。结论HPK1反义寡核苷酸对OGD诱导的海马神经元凋亡具有保护作用。     

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元

目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。方法将小鼠胚胎干细胞以"无血清"方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。     

大鼠鼠胚海马神经细胞原代培养及神经元鉴定

目的建立大鼠鼠胚海马神经元原代培养的方法。方法取孕龄17-18天的Wistar大鼠腹中胎鼠,血清培养法进行海马神经元的原代培养,然后用倒置显微镜进行形态学观察和神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学方法进行神经元的鉴定。结果培养8天后的海马神经元经形态学和组织化学方法观察证实神经细胞发育成熟。结论大鼠鼠胚海马神经元原代培养是一种新型的培养方法,具有明显的优势。     

邻苯二甲酸二丁酯对原代培养海马神经元的毒性及机制

目的 本研究探讨邻苯二甲酸二丁酯（DBP）暴露对原代培养海马神经元的神经毒性及可能机制。方法 海马神经元原代培养4 d后将海马神经元暴露在含有终浓度为0.0（对照）、1 g/LDBP的培养基中，选取染毒24、48、96 h 3个时相点，免疫荧光及透射电子显微镜下观察DBP染毒后海马神经元轴突及超微结构的形态变化；膜片钳测定海马神经元的动作电位；cck-8检测DBP染毒后海马神经元活性。Western blot测定脑源性神经营养因子（BDNF）、神经肽Y（NPY）、雌激素受体β（ERβ）核酸及蛋白的表达情况。高效液相色谱串联质谱检测神经递质GABA的释放。结果 DBP染毒96 h后神经元网络稀疏、轴突长度变短（P<0.01），电镜下细胞核呈圆形，染色质聚集，细胞质空泡化；膜片钳测定发现DBP染毒96 h后细胞出现去极化漂移、放电频率增加（P<0.01）；cck-8检测发现DBP染毒24、48、96 h的细胞活性均低于同时间点正常对照组（P<0.01）。DBP染毒48、96 h的ERβ、BDNF、NPY蛋白表达显著低于对照组（P<0.05）。DBP染毒96 h后神经递质GABA的释放显著低于对照组（P<0.05）。结论 DBP染毒后可导致海马神经细胞形态受损，并导致功能改变，这可能与神经递质GABA参与的ERβ-BDNF-NPY信号通道受阻相关。     

Wnt3a影响大鼠海马神经干细胞增殖的体外研究

目的:探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外增殖的影响。方法:采用机械分离、无血清传代培养法,从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对NSCs及其分化情况进行鉴定。将NSCs与5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)共孵育,观察Wnt3a对NSCs体外增殖情况的影响。结果:海马源胚胎NSCs具有增殖能力,可以传代培养,可分化为神经元和星形胶质细胞。与Brdu共孵育后,添加Wnt3a的实验组Brdu阳性率高于对照组(P0.01)。结论:使用机械分离、无血清培养的方法获得的NSCs具有增殖和多向分化能力,Wnt3a可以促进大鼠海马NSCs的体外增殖。     

p38MAPK蛋白在体外培养神经元中的表达及W-7的干预作用

目的:探讨p38MAPK蛋白在体外培养神经元中的激活及钙调蛋白抑制剂W-7的干预作用.方法:神经元原代培养并采用NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元.取原代培养7 d的大鼠皮质神经元随机分为5组:正常对照组,仅用DMEM/F12完全培养基;NMDA组,去除正常神经元培养液,加入NMDA 50 μmol·L-1,处理时间10...