小鼠动脉粥样硬化模型病变检测方法

小鼠动脉粥样硬化模型病变检测方法王南蔡海江史泓浏（南京医科大学动脉粥样硬化研究中心，南京２１００２９）关键词小鼠模型；动脉粥样硬化；斑块近年来国外陆续有小鼠动脉粥样硬化（Ａｓ）模型的报告［１］，随着对小鼠种系研究的迅速发展，最近已有一些实验室用小鼠模...     

后基因组时代的基因工程小鼠

基因工程小鼠是当今生命科学中集成度最高的综合性研究体系之一，在认识“基因－蛋白质－生命现象”、制备人类疾病研究的实验动物模型，以及新药开发的评价体系等领域中具有重要作用。随着生命科学中功能基因组学的兴起和模式生物时代的到来，使得生物医药研究对基因工程小鼠的需求日趋增加，同时也促使基因工程小鼠技术体系得到了快速的发展。然而，在基因工程小鼠的产生中，仍存在着一些问题。它们的解决，则需加强一些与基因工程小鼠直接相关的基础问题和有潜在应用价值的基础问题的研究。     

血小板源性生长因子基因工程活性肽在大鼠动脉粥样硬化早期中的作用

目前认为，在动脉粥样硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＳ）发病过程中，生长因子起着重要的致病作用。特别是血小板源性生长因子（ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＰＤＧＦ），它趋化单核细胞迁移、粘附，促进泡沫细胞、脂质条纹形...     

动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定

目的:介绍动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)原代培养及鉴定的方法。方法:分离载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉,组织贴块法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光及免疫组化方法检测细胞的纯度和分化状态。结果:培养第3天时,可见自组织块周围长出少量梭形或长梭形细胞,至培养2周细胞融合成片,呈"峰、谷"状生长。肌动蛋白免疫组化及荧光染色显示,细胞传至第6代后纯度在98%以上,证实应用此方法分离原代VSMC可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:应用组织贴块法培养小鼠VSMC,操作简单,结果稳定,纯度较高,具有推广应用价值。     

内置鞘管法建立小鼠颈动脉粥样硬化模型

目的:探求一种新的动脉粥样硬化模型建立方法。方法:40只雌性C57BL/6小鼠随机分为造模组和对照组,造模组通过左侧颈动脉外放置鞘管方法建立颈动脉狭窄模型,两组小鼠均饲以高脂饮食12周,分别留取造模前后血清进行生化检测,颈动脉标本进行苏木精-伊红(HE)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)染色。结果:12周后两组小鼠总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)均较造模前有明显增加,巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)造模组明显高于对照组,造模组ICAM-1染色呈阳性,HE染色可见造模组明显动脉粥样硬化形成。结论:通过内置鞘管法可成功建立小鼠颈动脉粥样硬化模型。     

近红外荧光分子标记的ox-LDL靶向小鼠动脉粥样硬化模型的成像研究

目的:合成近红外荧光分子标记的ox-LDL分子探针,进行体外细胞与体内活体成像,探讨其对诊断动脉粥样硬化的价值。方法:体外培养Raw 264.7细胞株,用不同剂量探针孵育后进行近红外荧光扫描,MTT法检测细胞活力。用8周龄Apo E-/-小鼠建立颈总动脉内膜拉伤模型,MR及近红外仪扫描小鼠颈部。结果:巨噬细胞可吞噬近红外荧光标记的ox-LDL探针,MTT法证实大、小剂量探针对细胞活力影响不同。Apo E-/-小鼠颈总动脉内膜拉伤后2周,MR扫描可见患侧内膜增厚、管腔狭窄;近红外荧光扫描可见1~2 h后信号在患侧颈部浓聚,24 h后信号明显衰减。结论:用近红外荧光分子标记ox-LDL探针可被巨噬细胞吞噬,内膜拉伤2周后可致Apo E-/-小鼠患侧颈总动脉内膜增生。     

动脉粥样硬化药理模型概述

动脉粥样硬化是一种常见的心脑血管疾病,严重危害人类的健康,已受到越来越多的重视。研究其发病机制对动脉粥样硬化的防治具有重要意义。实验模型的选择和构建则是其中的关键和核心,一个恰当的实验模型不仅能减少物力、人力消耗,更重要的是能够准确反映实验现象,达到实验目的。本文主要介绍目前常用的动脉粥样硬化动物及细胞模型,以便为相关药理学研究提供借鉴。     

慢性心理应激apoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型的建立与评价

目的探索建立慢性心理应激动脉粥样硬化动物模型。方法 4周龄80只apoE-/-小鼠随机均分为对照组与应激组,实验动物都以高脂、高胆固醇饲料（5%猪油,1%的胆固醇）喂养。应激组小鼠按顺序接受昼夜颠倒7或17 h（每周2次）、鼠笼倾斜成45度角7或17 h（每周2次）、噪声刺激9或15 h（每周2次,70 dB）与恐惧刺激1 h（放入大鼠刚住过鼠笼、每周2次）应激原的刺激;对照组的小鼠关在单独的实验动物房,除了不给予应激刺激外,其它的实验条件与应激组相同。分别在0、4、8与12周后4个时间点处死动物,检测血浆中总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白与低密度脂蛋白水平;采用放射免疫测定方法测定血浆中皮质酮激素水平;油红O染色法观察主动脉窦动脉粥样硬化病变。结果应激组的总胆固醇、三酰甘油与低密度脂蛋白明显高于对照组（均P〈0.05）;与相应对照组相比较,应激组小鼠血浆中的皮质酮激素的水平显著升高（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.001）;主动脉窦动脉粥样硬化病变显著加重（均P〈0.01）。结论成功建立慢性心理应激动脉粥样硬化动物模型。     

大鼠动脉粥样硬化模型的建立方法

目的:建立一种大鼠动脉粥样硬化模型的实验方法.方法:30只雌性SD大鼠随机分成正常对照组(C组,n=10)与模型组(M组,n=20只),C组普通饲料喂养,M组采用分次大剂量维生素D.注射 高脂饲料喂养,2个月后处死大鼠,检测血脂学变化,制作动脉切片进行形态学观察.结果:M组中的胆固醇、甘油三脂及低密度脂蛋白较C组显著升高(P＜0.01),高密度脂蛋白则较C组下降(P＜0.05).光镜下M组中膜严重钙化,明显不规则增厚,有泡沫细胞形成,平滑肌纤维排列显著紊乱等;C组主动脉平滑肌排列整齐规则,管腔内皮光滑,无增生.电镜下M组胶原纤维明显增多,排列紊乱,局灶性纤维溶解变性.局部有脂质样颗粒沉积在细胞间隙中.平滑肌细胞核固缩,核染色变深,部分可见坏死的平滑肌细胞,平滑肌细胞线粒体空泡化.内皮细胞大部分脱落,局灶有血栓形成(大量红细胞),可见有泡沫细胞.C组内皮完整,平滑肌纤维正常,排列紧密,胶原纤维排列规则,无增生.结论:用高脂饲料及大剂量维生素D.可有效诱发大鼠动脉粥样硬化.     

ApoE与动脉粥样硬化的关系及ApoE基因敲除小鼠在动脉粥样硬化研究中的应用

载脂蛋白E是血浆脂蛋白的重要组成成份,在脂蛋白代谢中发挥重要作用.动脉粥样硬化是目前危害人类健康的主要疾病,血脂异常是其发病及进展中重要因素之一.载脂蛋白E通过不同机制对动脉粥样硬化起到一定的抑制作用.随着基因工程动物的广泛应用,ApoE基因敲除小鼠逐渐成为动脉粥样硬化研究领域中应用最多的动物模型.现就近几年有关载脂蛋白E与动脉粥样硬化的关系以及ApoE基因敲除小鼠在动脉粥样硬化研究中的应用作一综述.     

胰腺癌转基因小鼠模型研究进展

胰腺癌是人类恶性肿瘤中最为致命的一种,癌基因KRAS的突变,抑癌基因(如CDKN2A、SMAD4)的失活或缺失以及大量信号途径的变化是胰腺癌的重要特征。因此,为弄清胰腺癌的这些生物学行为以及制订合理的治疗方案,建立模拟胰腺癌发生、发展过程的实验动物模型显得尤为重要。目前,基于KRAS突变的转基因小鼠模型较好地模拟了胰腺癌的癌前病变过程,结合其他抑癌基因的缺失或突变,进一步展示了胰腺癌的进展过程,如侵袭和转移等。该文就胰腺癌转基因小鼠模型予以综述。     

阿尔茨海默病转基因小鼠的特点和应用

氨浓度是动态实验动物繁育、生产设施环境的重要指标，作者认为现行实验动物环境及设施氨浓度测定方法有诸多不当之处，提出来供商讨：     

研究生实验动物学实验课的教学体会

实验动物学吸纳了生物学、医学、兽医学、遗传学等诸多学科的知识,是一门具有很强的综合性和交叉性的学科。人们普遍认为实验动物是生物医学乃至整个生命科学研究的重要支撑条件之一,在新技术革命蓬勃发展的当今世界中占有重要地位,因而也受到了各个医学院校的高度重视,成为许多学校本科生的选修课和研究生的必修课。实验动物学实验课作为理论知识的验证和补充,也受到学校和学生的高度重视。但由于师资、经费和教学条件的限制,多数学校只能选择性地面向研究生开设实验课。我系对研究生开设实验动物学实验课程已10年有余,对于普及实验动物学的有关知识和研究生的动手能力起到了一定的推动作用。通过长期的实验课教学,作者的有关认识是:     

造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的 对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型.方法 采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2) ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3)ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin(-)c-kit(+)Sea-1+(LSK)造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠.结果 活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光.流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS和C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞.结论 筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具.     

Afp-cre-lacZ转基因小鼠的构建

目的 研究甲胎蛋白(Afp)阳性细胞的增殖分化在组织生长修复,肿瘤发生过程中的作用,建立Afp-CreERT转基因小鼠细胞示踪系统.方法 采用DNA雄原核显微注射方法获得Afp-CreERT转基因小鼠,筛选出合适的品系后,使之与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交,获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠.结果 显微注射后,共出生小鼠56只,经PCR鉴定Cre阳性小鼠共4只,阳性小鼠传代后各为一系.筛选内源性Afp表达与Cre表达相对符合的品系作为Afp-CreERT转基因小鼠品系建系.Afp-CreERT转基因小鼠与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交,经PCR鉴定后获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠.经实时PCR,X-gal染色,免疫荧光染色鉴定后得到Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统,同时证实该系统能够正确示踪Afp表达阳性的细胞,同时也能够应用于肝损伤小鼠模型中.结论 成功构建了Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统,为研究这类细胞的谱系发生提供了工具.     

Dicer 1转基因小鼠模型的建立

目的 建立Dicer1转基因小鼠模型.方法 构建pcDNA3.I-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导人BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内.出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基冈表达.结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern榆测6只均为阳性.对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达.对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常.结论 成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础.     

共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型的建立

目的建立共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型。方法利用RT-PCR方法从来自小鼠胸腺的mRNA中扩增出B7-DC cDNA,继而将B7-DC基因插入到真核表达载体PEF6/V5-His中得到含B7-DC和V5-His融合蛋白的PEF6-B7-DC/V5-His。注射外源基因PEF6-B7-DC/V5-His至FVB小鼠原核,注射胚胎移植到同期发情的假孕受体,所生仔鼠经PCR和Southem-blot检测获得阳性转基因小鼠。结果共注射移植胚胎87枚,出生小鼠39只,检测出阳性小鼠3只,并稳定遗传至F2代。结论成功建立了B7-DC转基因小鼠模型。     

脂肪细胞因子CTRP4转基因鼠的构建与鉴定

目的建立人CTRP4基因的转基因小鼠,为脂肪细胞因子CTRP4的体内功能研究奠定基础。方法首先构建人CTRP4的转基因小鼠线性化表达载体,再利用显微注射的方法将载体注射入小鼠受精卵,从而构建人CTRP4的首建鼠(Founder)并与野生型小鼠交配繁殖得到F1代阳性小鼠,再通过近亲繁殖与测交的方法,得到CTRP4转基因纯合子小鼠,并通过PCR和western blot的方法对纯合子小鼠进行鉴定。结果得到人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠两个品系,western blot鉴定该转基因小鼠心脏,肝脏,脑,肾脏等多种组织中均呈现CTRP4高表达。结论成功构建了人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠。     

绿色荧光裸鼠的建立和验证

目的建立系统性表达绿色荧光蛋白的裸鼠,接种人源肺癌细胞验证该模型是否具有免疫缺陷性,并观察双色荧光的成像效果。方法利用系统性表达绿色荧光蛋白的C57BL/6J小鼠与BALB/C裸小鼠多代杂交和互交,建立稳定表达绿色荧光蛋白的裸鼠。大体解剖观察胸腺生长情况,整体和器官荧光成像验证绿色荧光蛋白的表达情况。以2×106/只的剂量对其皮下腋下接种表达红色荧光蛋白的人类A549肺癌细胞(RFP-A549),通过观测肿瘤生长来验证模型的免疫缺陷性。同时,利用红色荧光标记的肿瘤和绿色宿主鼠,对双色的整体成像效果进行观测。结果构建出系统性表达绿色荧光蛋白的裸鼠,大体解剖可见胸腺缺失。在激发光的激发下,绿色荧光裸鼠全身发出清晰的绿色荧光,脑、心脏、肺脏、肝脏、肾脏,肠胃及胰腺等主要器官可见明显绿色荧光。接种RFP-A549细胞后,成瘤率达到100%,整体动物荧光成像表现出清晰的双色。结论本研究构建出的绿色荧光裸鼠,动物整体可以清晰地表达绿色荧光并具有免疫缺陷性     

土拨鼠肝炎病毒转基因小鼠模型的建立

目的:建立土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,以用于嗜肝病毒感染的发病机制研究。方法:采用微注射技术将1.3-倍WHV基因[野生型和WHV S抗原(WHV surface antigen,WHsAg)缺陷型]注射入C57BL/6xC3H小鼠的胚胎,然后与C57BL/6小鼠回交,建立WHV转基因小鼠。肝内WHV DNA复制和mRNA表达水平分别采用Southern杂交和real-time RT-PCR检测,血清中WHV病毒载量采用real-time PCR检测,HE染色进行肝组织病理学检测,ELISA检测血清中WHV核心抗体,流式细胞仪检测WHV核心抗原(WHV core antigen,WHcAg)特异性细胞毒性T淋巴细胞。结果:成功建立野生型WHV转基因小鼠和WHsAg缺陷型转基因小鼠。WHsAg缺陷型小鼠肝内WHV复制水平显著高于野生型小鼠,野生型WHV转基因小鼠血清WHV载量104¹08copies/mL。而且雄性小鼠肝内和血清WHV复制水平显著高于雌性小鼠。16周龄以上的WHV转基因小鼠约半数血清可检测出高滴度的WHV核心抗体。而且少数转基因小鼠可以检测到WHcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞。结论:这种新建的WHV转基因小鼠肝内可检测到病毒复制和mRNA表达,血清有高水平的WHV病毒载量,可以用于嗜肝病毒感染的发病机制、抗病毒治疗等研究。