5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胶质瘤细胞系U251凋亡的调节

目的甲基化与胶质瘤的发生和发展关系密切,本研究的目的是探讨去甲基化试剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)对胶质瘤细胞系凋亡的调节。方法将浓度分别为10μM、25μM和50μM的5-氮杂-2'-脱氧胞苷加入胶质瘤细胞系U251细胞中,应用RT-PCR法检测U251细胞系经不同浓度的5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后细胞内胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达,应用流式细胞术(AnnexinV-FITC染色)检测不同药物浓度处理组中U251细胞的凋亡率。结果 5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后,U251细胞内caspase-3的转录水平明显上调(P<0.01),具有较为明显的剂量依赖性。流式细胞术结果显示U251细胞经5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后细胞的凋亡率显著上调,且具有剂量依赖性。结论 5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理具有剂量依赖性上调胶质瘤细胞系U251caspase-3表达,促进细胞凋亡。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对肺癌细胞系BE1和LTEP-α-2中Axin基因表达及细胞增殖的影响

目的本研究的目的是探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza)对人肺癌细胞系BE1及LTEP-α-2的增殖和侵袭的调节及其可能的机制。方法两个细胞系均应用5-Aza进行处理,并应用MTT法检测两细胞系经5-Aza处理后细胞增殖能力的变化,Transwell法检测了两细胞系处理后侵袭能力的变化,Westernblot检测Axin、β-catenin、cyclin D1和MMP-7的表达。结果 5-Aza抑制BE1和LTEP-α-2细胞的增殖和侵袭能力(<0.05),与LTEP-α-2细胞系相比,BE1细胞系受抑制程度更为明显(<0.05)。5-Aza上调BE1细胞中Axin的表达,抑制β-catenin、cyclin D1和MMP-7的表达,但对LTEP-α-2细胞中Axin等的表达没有明显的影响。结论 5-Aza可以抑制肺癌细胞的增殖和侵袭,BE1细胞中的Axin基因可能存在异常高甲基化,高甲基化的Axin基因可能成为未来治疗肺癌的靶点。     

5-氮-2-脱氧胞苷与曲古抑菌素A对胃癌细胞生长抑制作用的研究

目的 探讨5-氮-2-脱氧胞苷与曲古抑菌素A对胃癌细胞生长抑制作用.方法 应用MTT比色法检测各组细胞增殖情况.应用金氏公式计算联合用药效果.结果 单独及联合应用不同浓度的5-氮-2-脱氧胞苷与曲古抑菌素A作用MGC-803细胞不同时间,细胞生长抑制作用均随着药物浓度的增加和时间的延长逐渐增加,联合用药效果表现为相加作用(q>0.85).结论 单独应用5-氮-2-脱氧胞苷与曲古抑菌素A,细胞生长抑制率均明显增加;联合用药发挥相加作用,为临床联合用药提供了理论依据.     

miR-361-5p对脑胶质瘤迁移和侵袭的影响

目的 探讨miR-361-5p对脑胶质瘤迁移和侵袭的影响。方法 应用miR-361-5p mimics转染人脑胶质瘤U251细胞,CCK-8法检测细胞增殖能力;采用Transwell实验检测U251细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的蛋白表达。结果 与对照组和NC组相比,mimics组U251细胞的增殖能力显著降低（P<0.01）,mimics组迁移和侵袭的细胞个数明显减少（P<0.05）;与对照组和NC组相比,mimics组MMP-2、MMP-9以及VEGF表达明显减少（P<0.05）。结论miR-361-5p能抑制胶质瘤U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且降低MMP-2、MMP-9以及VEGF蛋白表达,从而能够控制胶质瘤的生长和转移。     

5-Aza-CdR抑制HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对DLK1基因及肝癌细胞系HepG2增殖、侵袭的影响.方法 不同浓度的5-Aza-CdR及PBS作用HepG2细胞后,RT-PCR、Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平;MTT、Transwell和流式细胞术检测HepG2细胞的生长、侵袭力及细胞周期的变化.结果 HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,DLK1 mRNA、蛋白表达量降低;MTT试验显示细胞生长速度依5-Aza-CdR浓度出现不同程度减慢;流式结果表明G1期细胞减少,S期细胞增加,出现S期阻滞;Transwell证实侵袭能力显著降低(P＜0.05).结论 去甲基化药物5-Aza-CdR能有效地抑制DLK1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖、侵袭能力.     

Axin基因异常高甲基化对肺癌细胞生物学行为的调节

目的体轴抑制因子Axin是Wnt信号传导通路的关键抑制因子,本研究探讨部分肺癌细胞系中Axin表达下调的原因,及其表达下调对肺癌生物学行为的影响。方法应用甲基化特异性PCR(MSP)对BE1和SPC-A-1细胞系中Axin基因启动子区和第一内含子区的甲基化状态进行了检测,应用RT-PCR方法检测了两细胞系中AxinmRNA表达。利用野生型Axin质粒转染两种细胞,并且应用MTT和Transwell细胞侵袭实验观察两种细胞系在转染后细胞生物学行为的变化。结果 BE1细胞中Axin基因的启动子区和第一内含子区为高甲基化状态,而SPC细胞为非甲基化状态,BE1细胞中AxinmRNA的表达明显低于SPC细胞系(P<0.05),5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)作用于BE1细胞可以使高甲基化的Axin基因去甲基化并上调Axin的转录。转染野生型Axin可以明显抑制BE1细胞和SPC-A-1细胞的增殖和侵袭(P<0.05),其中BE1细胞受到的抑制程度更为明显。结论 Axin基因高甲基化可能是其在肺癌中表达下调的重要原因,过表达Axin可以明显抑制Axin高甲基化肺癌细胞的增殖和侵袭能力。     

5-杂氮-2'脱氧胞苷对肝癌细胞SMMC-7721 miR-1247-5p基因表达及其启动子区甲基化的影响

目的观察正常人肝细胞系LO_2和肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p的表达,研究去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p表达及其基因启动子区Cp G岛甲基化水平的影响。方法用不同浓度(0、5和10μmol/L)去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷处理SMMC-7721细胞,用甲基化特异性PCR法检测miR-1247-5p基因启动子区甲基化水平;用SYBR Green qReal Time PCR法检测miR-1247-5p的表达。结果与正常人肝细胞系LO_2相比,肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p表达降低(P0.05)且其基因启动子区Cp G岛甲基化水平高;经去甲基化药物干预后miR-1247-5p的表达较对照组有明显上调(P0.01),且其基因启动子区Cp G岛甲基化水平降低。结论 miR-1247-5p基因甲基化调控可能参与了肝癌的发生。     

ATP1A1基因沉默抑制人胶质瘤细胞U251侵袭

目的探讨沉默Na+/K+ATP酶A1亚基(ATP1A1)对人U251胶质瘤细胞系侵袭能力的影响及其机制。方法用shRNA-ATP1A1慢病毒感染人U251胶质瘤细胞,RT-q PCR及Western blot分别检测ATP1A1 mRNA和蛋白的表达;MTT法检测细胞体外的增殖;细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞的迁移及侵袭能力;Western blot检测基质金属蛋白酶2/9(MMP-2/9)的表达。结果沉默ATP1A1细胞的ATP1A1 mRNA和蛋白表达均受到了明显抑制;细胞的增殖和迁移、侵袭能力也显著受抑(P0.05);MMP-2和MMP-9的表达也明显降低(P0.05)。结论靶向ATP1A1干扰能够明显抑制胶质瘤U251细胞的体外增殖、迁移及侵袭,其机制可能与MMP-2、MMP-9的下调相关,ATP1A1可能作为胶质瘤治疗的一个潜在靶点。     

5-Aza-CdR对人结肠癌Caco-2细胞系P16基因甲基化状态及其生物学表型的影响

目的 观察人结肠癌Caco-2细胞系P16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导高甲基化失活的P16基因重新表达的可能性及其对细胞生长的影响.方法 用不同浓度的5-Aza-CdR处理Caco-2细胞系,MSP法检测用药前后P16基因的甲基化状态,RT-PCR方法检测P...     

沉默PAK4基因对胶质瘤细胞U251侵袭与迁移能力的影响

目的观察沉默P21活化酶4(p-21 activated kinase 4, PAK4)基因对神经胶质瘤细胞U251侵袭与迁移能力的影响。方法构建稳定沉默PAK4基因的U251细胞系,shRNA-U251(转染空载组作为对照即shNC组);应用免疫荧光实验检测PAK4在胶质瘤细胞系U251中的表达;应用细胞划痕愈合实验与Transwell侵袭实验比较两组细胞的迁移与侵袭能力的变化;通过Western blotting实验检测沉默PAK4基因后U251细胞系中基质金属蛋白酶MMP2与MMP9的表达改变。结果 PAK4蛋白主要表达于胶质瘤细胞系U251细胞核与细胞质; shRNA-U251组细胞划痕愈合率明显降低; shRNA-U251组细胞进入小室下壁的数量明显减少,shRNA-U251组细胞MMP2与MMP9蛋白的表达水平显著下调。结论沉默PAK4基因下调神经胶质瘤细胞U251的迁移与侵袭能力与降低基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达相关。     

丙泊酚对人胶质瘤U251细胞株增殖、凋亡、侵袭和转移能力的调节作用

目的　探究丙泊酚对人胶质瘤U251细胞增殖、凋亡、侵袭和转移能力的作用和机制。 方法 将细胞随机分为U251组、Propofol（1 mM）组、Propofol（2 mM）组和Propofol（5 mM）组。除U251组外,其余组用相应浓度的丙泊酚处理,CCK8检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡,Transwell检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测Ki67、Caspase-3、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（Phosphoinositide 3-kinase, PI3K）、Akt、p-PI3K和p-Akt的表达。 结果 与U251组比较,Propofol （1, 2, 5 mM）组细胞增殖速度明显降低,细胞凋亡率显著升高;同时,Propofol （1, 2, 5 mM） 组侵袭细胞数与U251组比较明显减少,Propofol（2, 5 mM） 组划痕闭合率明显低于U251组;此外,丙泊酚还能显著抑制细胞增殖和迁移相关蛋白Ki67和VEGF表达,诱导细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达;丙泊酚能明显降低p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值。 结论 丙泊酚能降低胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和转移能力,抑制U251细胞凋亡,作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路激活有关。     

血管细胞黏附分子-1增强人脑胶质瘤细胞系迁移和侵袭能力

目的探讨血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)在脑胶质瘤细胞迁移侵袭能力中作用。方法用慢病毒p SGU6/GFP/Neo介导VCAM-1的shRNA、慢病毒EF1a-GFP/puro介导VCAM-1过表达载体、划痕迁移、Transwell侵袭、蛋白免疫印迹(Western blot)和细胞染色等实验技术和方法,观察了VCAM-1蛋白表达水平对人脑胶质瘤T98G和U251细胞系细胞迁移和侵袭能力的影响。其中,T98G细胞分为空白对照组、空载体对照组、乱序对照组和实验组(抑制VCAM-1蛋白表达水平组),U251细胞分为空白对照组、空载体对照组和实验组(过表达VCAM-1组),每组6个复孔。结果首先利用慢病毒介导VCAM-1的shRNA和过表达载体建立了稳定低表达VCAM-1的T98G细胞和稳定过表达VCAM-1的U251细胞。稳定低表达VCAM-1的T98G细胞划痕恢复能力(迁移能力)明显减弱(P0.01);而稳定过表达VCAM-1的U251细胞迁移能力明显提高(P0.05)。同样,稳定低表达VCAM-1的T98G细胞侵袭能力显著减弱(P0.05);而稳定过表达VCAM-1的U251细胞侵袭能力明显增强(P0.01)。结论VCAM-1可显著增强人脑胶质瘤细胞系细胞的迁移和侵袭能力。     

单胺氧化酶抑制剂诱导胶质瘤细胞的体外分化

为研究单胺氧化酶抑制剂(TCP)对体外培养的人脑胶质瘤U251细胞的诱导分化作用,以不同浓度TCP单独或与100nmol/L组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)联合处理U251细胞。采用倒置显微镜观察细胞形态学变化;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖变化;流式细胞仪检测细胞周期变化;Hoechst 33258染色显示细胞凋亡;Real-time PCR和Western印迹法检测分化相关基因mRNA和蛋白表达水平的改变。结果表明:TCP可诱导细胞突起增多且变细长,抑制细胞增殖,阻滞细胞周期于G1期,抑制全能性转录因子Oct4和Sox2的表达,上调分化标志基因胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,TCP联合TSA也诱导了GFAP的高表达。这些结果提示:TCP可诱导胶质瘤U251细胞分化,TSA对TCP诱导细胞分化有协同作用。     

Knockdown of Gli1 by small-interfering RNA enhances the effects of BCNU on the proliferation and apoptosis of glioma U251 cells

Aims: The present study is to investigate the effect of the combination of small-interfering RNA (siRNA) treatment with bis-chloroethylnitrosourea (BCNU) on the proliferation and apoptosis of glioma cells. Methods: According to different treatments, glioma U251 cells were randomly divided into blank group, Lipofectamine group, siRNA-Gli1 group, BCNU group and combination group. After treatments, the morphology of U251 cells was visualized under the microscope. Afterwards, semi-quantitative real-time polymerase chain reaction and Western blotting were used to determine Gli1, Bcl-2, Bax and cyclin D1 mRNA levels and protein expression, respectively. MTT assay was used detect the proliferation of U251 cells, while flow cytometry was performed to determine cell apoptosis and cell cycle. Results: The combination of siRNA-Gli1 and BCNU caused more severe damages to U251 cell shapes compared with siRNA-Gli1 or BCNU alone. The combination of BCNU and siRNA-Gli1 altered mRNA level and protein expression of Bcl-2 and Bax, but not those of Gli1 and cyclin D1. The combination of siRNA-Gli1 and BCNU promoted U251 cell apoptosis. The combination of siRNA-Gli1 and BCNU enhanced the arrestment of U251 cells in G0/G1 phase. The combination of siRNA-Gli1 and BCNU significantly inhibited U251 cell proliferation. Conclusions: The present study demonstrates that combined treatment with siRNA-Gli1 and BCNU significantly inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of glioma U251 cells, possibly by the up-regulation of Bax and the down-regulation of Bcl-2. The combination of siRNA-Gli1 and BCNU enhances the inhibition of cell cycles, but does not down-regulate the expression of cell cycle protein cyclin D1.     

miR-205通过靶向调控TBX18抑制神经胶质瘤细胞的侵袭能力

目的:探讨微小RNA-205(miR-205)在神经胶质瘤组织中的表达模式及其在胶质瘤细胞侵袭中的作用及可能机制。方法:用real-time PCR检测配对神经胶质瘤组织中miR-205的表达,同时用免疫组化方法检测配对组织中TBX18蛋白的表达量;用脂质体将miR-205模拟物(miR-205 mimics)、miR-205抑制物(miR-205 inhibitor)以及相应对照(control)导入U251胶质瘤细胞后,Transwell实验检测细胞的侵袭能力变化;生物信息学分析结合萤光素酶报告基因实验观察miR-205对TBX18的靶向调控作用;采用RNA干扰技术下调U251细胞中TBX18的表达,用Transwell实验检测细胞侵袭能力变化。结果:miR-205在82.6%所检测的神经胶质瘤组织中表达下调,而TBX18在神经胶质瘤组织中表达上调,两者表达呈负相关;过表达miR-205使U251细胞的侵袭细胞数下降(P0.01),抑制miR-205表达后U251侵袭细胞数增加(P0.01);miR-205在U251胶质瘤细胞中能直接靶向抑制TBX18的表达,干扰TBX18的表达亦使U251细胞的侵袭细胞数下降(P0.01)。结论:miR-205在神经胶质瘤中表达下调,miR-205可能通过靶向调控TBX18影响胶质瘤细胞的侵袭能力,这将为完善胶质瘤侵袭的分子机制及开发新治疗策略以提高胶质瘤治疗效果提供有力的理论依据。     

乙酰辅酶A羧化酶1对胶质瘤细胞系U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）对人胶质瘤细胞系U87细胞增殖、迁移及侵袭的作用。 方法 Western blotting检测人胶质瘤细胞系U87、U251及U373中ACC1的表达;构建ACC1过表达质粒载体,将过表达ACC1质粒载体瞬时转染至U87细胞中;Western blotting检测转染后U87细胞中ACC1表达情况;MTT实验检测过表达ACC1对U87细胞增殖的影响;Transwell迁移和侵袭实验分别检测过表达ACC1对U87细胞迁移和侵袭的影响;划痕实验检测过表达ACC1对U87细胞划痕愈合能力的影响;Western blotting检测相关蛋白表达变化。 结果 与人胶质瘤细胞系U251和U373相比,U87细胞中ACC1表达较低;ACC1过表达抑制U87细胞增殖（P<0.01）;ACC1过表达抑制U87细胞迁移、侵袭和划痕愈合能力（P<0.01）;ACC1过表达迁移和侵袭相关蛋白波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)表达下调（P<0.01）,凋亡抑制蛋白Bcl-2和细胞周期蛋白(cyclin) B、cyclin D表达下调（P<0.01）,p-STAT3蛋白表达下调（P<0.01）,细胞周期蛋白P21表达上调（P<0.01）。 结论 过表达ACC1可能通过抑制STAT3活性,抑制人胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。     

5-Aza/TSA表观遗传处理诱导非霍奇金淋巴瘤B细胞表型丢失

目的:探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷/曲古抑菌素A(5-Aza/TSA)介导的DNA去甲基化/组蛋白乙酰化处理对B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤B细胞表型的影响。方法:构建含有G418抗性的CD19特异性启动e GFP表达载体,转染霍奇金(阴性对照)和非霍奇金淋巴瘤细胞,并筛选目的序列稳定整合的克隆,比较CD19启动子在2组细胞中的活性。流式细胞术检测5-Aza/TSA处理对2组细胞GFP表达水平的影响。分离Eμ-myc转基因小鼠非霍奇金淋巴瘤原代细胞并鉴定其B细胞表型,通过流式细胞术检测5-Aza/TSA对其B细胞表面抗原CD19等表达水平的影响。结果:5-Aza/TSA表观遗传处理能够降低人非霍奇金淋巴瘤细胞中外源性CD19启动子的转录活性,并沉默小鼠原代非霍奇金淋巴瘤细胞表面B细胞特异性抗原的表达。结论:DNA甲基化和组蛋白去乙酰化对人类及小鼠B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤B细胞表型稳定有重要作用。