鼠血管紧张素Ⅱ受体1短发夹环RNA质粒的构建与鉴定

目的:探讨血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)的RNAi对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)功能的影响,我们构建了AT1R短发夹环RNA(shRNA),以期为进行这方面研究提供基础.方法:在Gene Bank中查到鼠AT1R的mRNA基因序列并输入到相应设计软件中,以此设计引物序列.经PCR扩增、酶切后,克隆于T载体并行酶切鉴定.结果:构建的鼠AT1R shRNA质粒经测序鉴定验证与预期相符.结论:本研究结果为进一步研究AT1R shRNA质粒的RNAi功能及其对AngⅡ功能影响的研究奠定了基础.     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

CD146短发夹RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 CD146基因表达增高与涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)的临床症状相关.为进一步研究CD146基因的功能,构建人CD146短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并鉴定.方法 根据Genebank中靶基因CD146序列,按照Tuschl设计原则,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pGenesil-1载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定.结果 经过限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定,证实重组质粒pGe-CD146-shRNA的序列正确.结论 成功构建了靶向人CD146基因的shRNA真核表达载体系统,为进一步研究CD146基因的功能奠定了实验基础.     

大鼠Pik3cb shRNA质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制移植术后血管再狭窄的研究做准备。方法根据大鼠Pik3cb mRNA序列设计6条并经预实验挑选出2条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠Pik3cb shRNA表达载体质粒。结论成功构建了2条大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。     

靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体.方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照.结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符.结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gs a 蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础.     

NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能.方法 设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用双酶切及DNA测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆质粒并转染293T细胞,收集细胞全蛋白用Western检测RNAi效果.结果 重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Western检测证实设计的三条RNA干扰序列有效敲低了293T细胞中的内源性NSPc1.结论 3个NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用基于慢病毒系统的RNAi技术来研究NSPc1基因的功能打下了基础.     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向Survivin基因及CDKl基因的短发夹样RNA（Short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体。方法根据Genbank报道的Survivin序列及CDKl序列,遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDKl基因的shRNA寡核苷酸序列,构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒,并进行限制性内切酶酶切及基因测序鉴定。结果经酶切及测序结果分析,pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shR-NA-Survivin-U6-shRNA—CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建。结论成功构建Survivin基因及CDKl基因联合靶向shRNA重组质粒,为进一步研究Survivin基因和CDKl基因联合干扰提供了新的方法。     

NF-κB基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建转录因子NF-κB的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路及以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法设计针对NF-κB的shRNA特异性序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体,EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切及DNA测序鉴定重组克隆;脂质体转染RNAi重组载体至前列腺癌细胞PC-3后,Western blot分析各组NF-κB蛋白表达水平。结果双酶切和DNA测序证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较NF-κB转染组细胞NF-κB表达明显下调。结论成功构建人NF-κB基因RNAi质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为靶向NF-κB的基因治疗提供了有力工具。     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

胃癌组织中Cyr61、VEGF表达的意义

目的研究胃癌组织中Cyr61和VEGF的表达与临床病理学特征的关系。方法应用免疫组织化学方法检测70例胃癌组织以及20例胃癌癌旁组织中Cyr61和VEGF的表达。结果Cyr61和VEGF的在胃癌组织中表达均显著高于癌旁组织（P〈0．05）;胃癌组织中Cyr61和VEGF表达与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期密切相关（P〈0．05）;Cyr61和VEGF表达呈正相关性（P〈0．05）。结论Cyr61和VEGF在胃癌组织中高表达,两者在胃癌的生成和进展中起重要作用。     

Cyr61在单纯及放创复合伤愈合过程中的表达及其临床意义

目的研究Cyr61在单纯和放创复合伤愈合过程中的表达变化,对伤口愈合和组织改建的影响,及其在创伤实验室诊断中的意义。方法制备单纯及放创复合伤动物模型,采用光镜、免疫组化、RT-PCR等方法,动态观察伤口愈合过程中Cyr61mRNA及蛋白表达变化规律。结果5Gy(γ射线)全身照射后对伤口愈合有明显的损害作用。在伤后第3、6、9、15天,Cyr61表达量均随创伤愈合时间延长而增加;但在同一时间点,放创复合伤组Cyr61蛋白和mRNA的表达量均低于单纯创伤组,第21天放创复合伤组表达继续升高,而单纯创伤组表达下降。Cyr61表达时相拖后与辐射所致伤口愈合延迟一致。结论Cyr61在放创复合伤肉芽组织中表达较单纯创伤组明显降低,影响细胞迁移、新生血管形成和组织改建等重要过程,这可能是辐射所致伤口难愈的重要原因之一,认识Cyr61在创伤愈合过程的表达规律有助于创伤的预后判断和治疗。     

血管紧张素Ⅱ通过上调富含半胱氨酸蛋白61表达诱导HEK293T细胞凋亡

目的探讨富含半胱氨酸蛋白61（Cyr61）在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导HEK293 细胞功能中的改变及作用。方法 HEK293T细胞于体外培养,并应用CRISPR/Cas9技术敲低HEK293T细胞Cyr61基因。将细胞分为四组：（1）对照组;（2）Cyr61 敲低组;（3）AngⅡ组;（4）AngⅡ+Cyr61敲低组,以10-7 mol/L AngⅡ处理细胞,48 h收集细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡,通过 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术及蛋白质免疫印迹技术检测细胞Cyr61及Bcl-2的mRNA及蛋白表达量。结果Cyr61敲低 组Cyr61蛋白水平较正常对照组明显下降（P<0.05）,AngⅡ干预48 h 后Cyr61蛋白和mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Bcl-2 蛋白和mRNA表达水平明显下降（P<0.05）,敲低Cyr61 后Bcl-2 蛋白和mRNA表达水平明显升高（P<0.05）,与对照组凋亡率 （11.88±1.46）%相比,Cyr61敲低组凋亡率为（3.87±0. 83）%,AngⅡ干预组HEK293T细胞凋亡率为（26.94±3.73）%（P<0.05）,与 AngⅡ干预组相比,Cyr61 敲低+AngⅡ组凋亡率为（15.76±1.31）%（P<0.05）。结论Cyr61 表达量的上调与AngⅡ诱导的 HEK293T细胞损伤有关,下调Cyr61的表达可以有效地保护AngⅡ诱导的细胞损伤。     

低氧对小鼠成骨细胞Cyr61/CCN1表达的影响

目的 探讨低氧环境对小鼠成骨细胞富含半胱氨酸61（Cyr61/CCN1）表达的影响。 方法 分别在氧浓度和去铁敏诱导的低氧环境下培养小鼠成骨细胞,Real-time PCR和Western blotting于不同时间点检测成骨细胞低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、Cyr61/CCN1和血管内皮生长因子的表达。分别敲除小鼠成骨细胞中HIF-1α和VHL基因,检测细胞Cyr61/CCN1的表达。 结果 两种低氧环境下,小鼠成骨细胞HIF-1α通路被激活,Cyr61/CCN1 mRNA和蛋白表达均显著增加（P<0.05或P<0.01）。HIF-1α基因敲除小鼠成骨细胞Cyr61/CCN1 mRNA和蛋白表达均显著减少,VHL基因敲除成骨细胞Cyr61/CCN1 mRNA和蛋白表达均显著增加（P<0.05或P<0.01）。 结论 低氧环境通过激活HIF-1α通路来上调小鼠成骨细胞Cyr61/CCN1的表达。     

Cyr61在增生性瘢痕及正常皮肤中的差异表达和意义

目的探讨Cyr61在增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中表达差异及其意义。方法取自愿捐献的增生性瘢痕及正常皮肤标本,采用组织块法进行原代成纤维细胞培养。采用实时定量PCR法及细胞免疫荧光法检测Cyr61在两种细胞中的表达。结果在m RNA水平及蛋白水平上,Cyr61在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达均高于正常皮肤成纤维细胞。结论 Cyr61在增生性瘢痕形成过程中可能存在一定的作用,可能通过调节胶原代谢以及调节成纤维细胞增殖影响增生性瘢痕的形成。     

Cyr61基因与慢性粒细胞白血病的相关性研究

目的探讨慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓单个核细胞(BMMNC)中富半胱氨酸61基因（Cyr61）的表达水平及其临床意义。方法应用半定量RT PCR和免疫组化技术分别检测38例CML患者和10例正常对照者（正常对照组）骨髓单个核细胞中Cyr61mRNA和蛋白水平的表达情况,CML患者中慢性期20例（慢性期组）,加速期11例（加速期组）,急变期7例（急变期组）。结果38例CML患者中,慢性期组、加速期组、急变期组Cyr61mRNA的表达明显高于正常对照组(P＜0.05)。Cyr61基因在加速期及急变期的表达高于慢性期(P<0．05),Cyr61基因在加速期和急变期的表达虽升高,但两者差异无统计学意义(P>0．05)。Cyr61蛋白在CML中的表达明显高于正常对照组,CML加速期和急变期中Cyr61蛋白的表达高于慢性期（P均<0．05）。结论Cyr61基因参与了CML的发生、发展过程,且与CML的急变有关,可作为预示CML急变的实验依据。     

Cyr61在人肿瘤组织中的表达

目的观察分析富含半胱氨酸61(cysteine-rich61,Cyr61)在人类肿瘤组织中的表达情况。方法采用HE染色、免疫组化的方法检测多组织肿瘤组织芯片和30例肿瘤组织标本(包括食管癌、胃癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌组织标本各5例)中Cyr61的表达。结果组织芯片中79%(38/48)的肿瘤组织Cyr61表达阳性,93%(28/30)肿瘤组织标本中Cyr61表达阳性。其中神经、食管和甲状腺等肿瘤组织中呈强阳性表达,胃、肝、结肠、直肠、肺、肾、子宫、皮肤、卵巢、乳腺等组织的肿瘤呈阳性表达,在膀胱、前列腺和胰腺等肿瘤组织中表达较弱。结论Cyr61在多数肿瘤组织中均过表达,在不同肿瘤组织中表达程度不同,Cyr61可能成为新的肿瘤标志物应用于多种肿瘤的诊断。     

Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1基因在肾癌中的表达

目的〓〖HTK〗探讨肾癌组织CCN蛋白中Cyr61、CTGF、NOV和WISP-1 基因的蛋白表达水平及意义。〖HTW〗方法〓〖HTK〗采用Western blot半定量方法检测31例肾癌组织和18例癌旁正常肾组织中Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1基因的蛋白表达。 〖HTW〗结果〓〖HTK〗Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1蛋白在肾癌组织中的表达水平均低于癌旁正常组织(P<0.05)，其中乳头状肾癌的NOV和WISP-1 表达水平高于透明细胞癌(P<0.05)，G1级肿瘤NOV表达水平高于G2，3肿瘤(P<0.05)。 〖HTW〗结论〓〖HTK〗Cyr61、CTGF、NOV和WISP-1在肾癌中低表达， CCN基因在肾癌的发生和发展中可能起抑制作用。     

Cyr61基因的生物学功能及在肿瘤发生发展过程中的作用

Cyr61（cysteine-rich 61）是CCN家族第一个被克隆出来的、由生长因子诱导产生的富含半胱氨酸的即刻早期基因产物。作为一种重要的细胞基质调节因子,Cyr61在胚胎发育、伤口修复、血管性疾病及肿瘤的发生发展过程中均发挥重要的生物学作用。研究发现Cyr61在肿瘤组织中广泛表达,并且与肿瘤新生血管形成及肿瘤细胞的增殖与凋亡、转移密切相关。Cyr61在不同细胞中的表达受多种信号通路的调控,可与多种整联蛋白结合激活不同的下游通路,可能通过参与Wnt、NF-kB、Tyrosine Kinase（酪氨酸激酶）、Akt等信号转导通路调控其它癌基因、抑癌基因或凋亡调控因子的表达。     

过表达Cyr61对胰腺癌细胞化疗耐药性的影响

目的:研究富半胱氨酸61(cysteine-rich 61,Cyr61)在胰腺癌细胞中对吉西他滨化疗耐药性的影响.方法:培养人胰腺癌细胞株MIA PaCa2,分别感染空白对照病毒,表达Cyr61的病毒或shRNA,用吉西他滨(10 μg/ml)处理.细胞克隆形成试验检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测胰腺癌细胞凋亡;蛋白质...