表达人骨形成蛋白2的成纤维细胞系的建立与鉴定

目的:建立能稳定表达BMP2的成纤维细胞系.方法:运用阳离子聚合物转染试剂,将含有人BMP2基因的真核表达载体pcDNA3.1-B2导入NIH3T3细胞,通过G418筛选获得阳性细胞克隆,RT-PCR、免疫组化和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BMP2基因的稳定转染和蛋白表达.结果:转染细胞内有BMP2mRNA的转录,胞内及胞外有BMP2蛋白的表达.结论:采用阳离子聚合物转染法可成功地将外源性hBMP2基因导入NIH3T3细胞,为进一步研究诱导牙周膜细胞骨化分化建立基础.     

稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

Effects of secretive bone morphogenetic protein 2 induced by gene transfection on the biological changes of NIH3T3 cells

Background Bone morphogenetic proteins (BMPs), which belong to the transforming growth factor beta superfamily, are powerful regulators of cartilage and bone formation. This study investigated the biological changes of NIH3T3 cells incubated with secretive BMP2 that was induced by gene transfection through transwell. Methods Eukaryonic expression vector (pcDNA3.1-B2) was transfered into NIH3T3 cells with Sofast™,a positive compound transfection agent. The positive cell clones were selected with G418. The cytoplasmic and extracellular expressions of BMP2 were determined by immunohistochemical stain and enzyme-linked immunosorbent assay. NIH3T3 cells were co-cultured with hBMP2 gene transfecting cells through transwell, and the ultrastructure, alkaline phosphatase activity and the expression of osteocalcin (the marker of osteogenetic differentiation) changes were observed. Results There were cytoplasmic and extracellular expressions of BMP2 in transfecting NIH3T3 cells. The ultrastructural changes, the high activity of alkaline phosphatase and the positive stain of osteocalcin suggested the osteogenetic differentiation tendency of NIH3T3 cells co-cultured with transfecting NIH3T3 cells. Conclusion Secretive BMP2 that is induced by gene transfection could promote the osteogenetic differentiation of fibroblast cells.     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义

目的:探讨将HAb18G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/3T3的可行性及其意义.方法:将含有肝癌相关抗原HAb18G全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.0/HAb18G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株t3T3;利用流式细胞仪、间接免疫荧光染色方法鉴定目的蛋白转染情况;RT-PCR琼脂糖电泳、明胶酶谱分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后HAb18G刺激3T3细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的情况.结果:利用脂质体介导法将HAb18G全长cDNA转染入成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选,流式细胞仪分析、间接免疫荧光染色证实成功建立了稳定表达HAb18G的阳性克隆株;RT-PCR琼脂糖电泳证实t3T3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA转录水平较未转染前增多;明胶酶谱表明t3T3分泌MMPs能力较未转染前增强.结论:HAb18G全长cDNA可以稳定转染成纤维细胞,并能从核酸和蛋白水平诱导基质金属蛋白酶高表达,具有其独特的生物学意义.     

含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达

目的构建带加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人骨形成蛋白2(hBMP2)真核表达载体，观察其在正常人皮肤成纤维细胞中的表达情况。方法构建携带hBMP2和EGFP基因的真核表达载体pcDNA3-hBMP2-IRES-ECFP(pcBE)，将其转染NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后，采用RT—PCR和免疫组化染色方法分别检测人BMP2和EGFP基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果转染后的NIH3T3和正常人皮肤成纤维细胞均能转录人BMP2 mRNA和表达人BMP2蛋白，同时显示绿色荧光。结论pcBE真核表达载体可在正常人皮肤成纤维细胞内有效表达人BMP2蛋白，并以其荧光报告基因起示踪作用。     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达

目的　研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达。方法　采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞 (NIH3T3) ,转染后 72h ,经G4 18抗性筛选出阳性克隆并培养到第 2 4d ,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达 ,同时用ELASA法监测转染后 2 4d的细胞培养液的胰岛素水平。结果　转染PCMV .INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及PCMV转染组 (P <0 .0 1) ,未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的重要治疗手段 ,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。     

AFP启动子调控增强型绿色荧光蛋白在人肝癌细胞中表达的研究

目的研究人0.3 kb的AFP启动子序列对EGFP在人肝癌细胞中表达的影响.方法通过设计含有特定酶切位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋白启动子(AFP promoter)序列,分别构建含有AFP启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及AFP启动子序列和DTA基因的真核表达载体pAF-EGFP、pAF- DTA;将pAF- EGFP转染HepG2、SMMC-7721及NIH3T3后进行荧光强度检测.结果转染pAF-EGFP质粒细胞的EGFP表达量在HepG2细胞中明显高于SMMC-7721、NIH3T3细胞,组间差异显著(P<0.01).结论 AFP启动子可以特异性地启动它后面的目的基因在AFP阳性的细胞中高效表达.     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。     

小鼠24p3基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠24p3基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH3T3细胞中24p3/SIP24蛋白的表达情况,初步鉴定24p3/SIP24蛋白介导铁向细胞内转运的生物学功能.方法RT-PCR自小鼠肺组织中克隆24p3 cDNA.用基因重组技术构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体并行酶切和测序鉴定.脂质体DOTAP方法转染NIH3T3细胞,48 h后用G418筛选阳性克隆并培养扩增至21 d.对阳性克隆的培养基上清中24p3/SIP24蛋白的表达用ELISA和Westernblot分析,进一步用原子吸收分光光谱观察其介导铁向NIH3T3细胞内转运的生物学功能.结果成功克隆24p3cDNA并构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体,筛选出稳定表达24p3/SIP24蛋白的NIH3T3细胞株,24p3/SIP24蛋白在NIH3T3细胞上清中获得表达,并能介导铁向NIH3T3细胞内转运.结论24p3基因在NIH3T3细胞中获得表达,有良好的生物学活性,为进一步研究24p3/SIP24蛋白介导铁转运的生物学功能及作用机制奠定了基础.     

人精子顶体膜相关蛋白32真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:研究人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)mRNA在体外细胞NIH3T3中的表达。方法:利用RTPCR及亚克隆技术构建pcDNA3.1( )hSAMP32质粒,实验组以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )hSAMP32真核表达载体导入NIH3T3细胞中,同时设置空白和阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1( ))。原位杂交检测hSAMP32mRNA在3组细胞中的表达。结果:①RTPCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致。亚克隆酶切鉴定可见目的片段。②实验组阳性细胞胞浆中可见hSAMP32mRNA的表达,镜下可见蓝紫色阳性颗粒,空白和阴性对照组未见蓝紫色阳性颗粒。结论:脂质体介导基因转染法能够将pcDNA3.1hSAMP32真核表达载体高效导入NIH3T3细胞中,实现了hSAMP32基因的体外表达。     

Human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces human mesenchymal stem cell proliferation and differentiation in vitro

To identify eukaryotie expression veetor of human bone morphogenetie protein 2 peDNA3/BMP2, verify its expression in transfected hulnan mesenchynlal stem cells(hMSCs) and the effect on hMSCs differentiation. Methods: The BMP2 gene was cloned into a eukaryotic expression veetor pcDNA3. Transfeeted the reeombinant into hMSCs by liposome, Lmmunnohistochemistry and it situ hybridization methods were used to identify the expression of BMP2 mRNA and protein; ALP and Von Kossa stains were performed to identify the BMP2 gene differentiated effect on the hMSCs. Resuits: The pcDNA3/BMP2 fragments were as large as theory. BMP2 mRNA and protein were espressed and synthesized both in 48 h and 4 weeks after transfeetion, the ALP and Ca deposit eshibitiio, which marked the osteogenie lineage of hMSCs, were enhanced and Sped. Conclusion: Transfeetion of pcDNA3/BMP2 is able to provide transient and persistent expressionin hMSCs, and promote the MSCs differentiation to osleogenic lineage.     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞后细胞形态及生物学变化

目的 通过基因转染方法，用骨形态发生蛋白3（BMP3）基因转染成纤维细胞（NIH－3T3细胞），观察转染不同时期被转染细胞的形态学改变及细胞内碱性磷酸酶含量的变化，初步探讨骨组织工程种子细胞来源的另一途径。方法 定向克地将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，观察不同时期被转染细胞的形态学变化，钙钴法染色转染细胞时相的碱性磷酸酶并作图像分析。结果 转染细胞培养筛选6周提取的总RNA用Dot blot可以检出有明显的BMP3 mRNA表达。转染细胞第1周细胞形态由长梭形变为杆状，转染后2周细胞由长梭形变为多角形，转染后4周细胞变为多边形，类似成骨细胞，钙钴法碱性磷酸酶染色示转染组细胞胞浆内有大量染色黑色的碱性磷酸酶颗粒，及图像分析及转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。结论 通过向NIH－3T3细胞内转染BMP3基因，可以使NIH－3T3细胞形态向成骨细胞形态发生转化，被转染细胞内碱性碱性磷酸酶水平明显增高，已具有成骨细胞某些特性。     

稳定表达Trop-2基因的NIH3T3细胞系的构建和特性分析

目的:建立稳定表达人滋养层细胞表面抗原(Trop-2)NIH3T3细胞,分析过表达Trop-2对NIH3T3细胞的生长?增殖和侵袭特性的影响?方法:将Trop-2基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,转染NIH3T3细胞,通过G418筛选及RT-PCR鉴定获得稳定表达Trop-2的NIH3T3细胞(NIH3T3-Trop-2)?用MTS法检测NIH3T3-Trop-2细胞的增殖能力,软琼脂集落形成实验检测NIH3T3-Trop-2细胞的克隆形成能力,明胶酶谱法检测NIH3T3-Trop-2细胞的基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌及细胞划痕实验检测NIH3T3-Trop-2细胞的迁移能力?结果:稳定表达Trop-2的NIH3T3细胞在生长增殖?克隆形成及侵袭能力均较NIH3T3细胞强,细胞培养上清中的MMP-2和MMP-9增多?结论:Trop-2对细胞的增殖与迁移能力具有明显的促进作用?     

重组人骨形成蛋白2在皮肤成纤维细胞中的表达

目的 构建人骨形成蛋白2(BMP2)的真核表达载体以探讨成纤维细胞表达BMP2的情况。方法 构建携带人BMP2基因的真核表达载体pRK5-hBMP2，并将其转染CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后，采用RT-PCR方法检测人BMP2在mRNA水平上的表达。结果 RT-PCR显示转染后的CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞可以有效地转录BMP2 mRNA。结论 含有人BMP2 cDNA的重组质粒pRK5-hBMP2转染正常人皮肤成纤维细胞后可以有效地表达BMP2。     

干扰Gnb21l对节律基因mPer1表达的影响

目的研究干扰Gnb211表达对节律基因mPer1表达的影响。方法采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐（Phorbol 12-Myristate 13-acetate,PMA）诱导NIH3T3细胞,使其节律基因稳定表达,然后用脂质体介导法将pGenesil-1／Gnb211质粒（实验组）及pGenesil-1／vector质粒（对照组）分别转染入NIH3T3细胞中,采用RT—PCR半定量技术检测不同时间点NTH3T3细胞中Gnb2l1及mPerl mRNA的表达水平的变化情况。结果实验组比对照组的白6221以及roPer1 mRNA的表达量均明显降低（P〈0．05）,但经余弦分析比较两组的mPer1表达周期无明显改变。结论干扰Gnb2l1使节律基因mPer1表达量降低。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

Effect of N,N’- dinitrosopiperazine on in vitro expression of humancytochro me P450 2E1

目的：建立人细胞色素P450 2E1(CYP2E1)cDNA体外异源表达模型,观察化学致癌物二亚硝基哌嗪（N,N‘-dinitrosopiperzine,DNP）对CYPWE1表达的影响。方法：脂质体介导转染法将外源人CYP2E1cDNA导入NIH3T3细胞,PCR和Southern blot鉴定外源基因的整合,RT-PCR检测其表达;用不同浓度乙醇和DNP处理转化细胞,RT-PCR和western bloting 检测CYP2E1表达的改变。结果：获得二个具外源基因CYP2E1cDNA整合及稳定表达的细胞克隆NIH3T3-2E1-A1和NIH3T3-2E1-A8;经乙醇和DNP处理的细胞克隆CYP2E1mRNA和蛋白质水平的表达增强。结论：DNP与乙醇对CYP2E1表达的诱导可能与其mRNA转录增强有关,DNP致癌可能与CYP2E1对其原位代谢活化相关。