谷氨酸诱导骨髓间充质干细胞毒性损伤的作用

目的研究谷氨酸对骨髓间充质干细胞（BMSCs）毒性损伤的作用。方法原代培养大鼠BMSCs，流式细胞仪分析细胞表型，四甲基氮唑蓝（Mrrr）法检测分别经10、30、50mmol／L的谷氨酸作用24h后的BMSCs存活率，并用PI／Annexin—V双染法流式细胞仪计算各组凋亡细胞的比例。结果流式细胞仪分析细胞显示CD29、CD44、CD105表达阳性，CD45、CD14、CD34表达阴性，符合BM-SCs的特点。谷氨酸诱导组较多细胞呈凋亡改变，BMSCs的凋亡率较对照组升高（P〈0．05），且随着谷氨酸浓度的增加，细胞凋亡率也相应增加。结论谷氨酸可诱导BMSCs毒性损伤。     

大鼠骨髓间充质干细胞移植后大鼠脑梗死区超微结构变化的研究

目的　观察接受MSCs局部注射移植的大鼠脑梗死区超微结构的变化 ,以了解MSCs移植对梗死区超微结构的影响。方法　制作大鼠大脑中动脉栓塞模型 ,将体外分离培养的大鼠MSCs注射至大鼠脑梗死区 ,于移植后第 4周电镜下观察梗死区超微结构变化。结果　接受移植的梗死区可见外形幼稚的细胞存活 ,并围绕在神经元周围 ,梗死区神经元胞浆中出现了丰富的游离核糖体 ,而对照组大鼠梗死区神经元胞核固缩 ,并有嗜神经细胞现象。结论　大鼠MSCs移植对缺血性脑损伤具有一定修复作用     

皮质酮对动物骨髓间充质干细胞迁移活性的影响及其修复学意义

目的研究下丘脑-垂体-肾上腺轴效应激素———糖皮质激素(GC)对不同动物骨髓间充质干细胞迁移活性影响。方法分离、培养并鉴定大鼠和小鼠骨髓间充质干细胞,通过不同方法观察两种来源的骨髓间充质干细胞趋化活性的变化,评价GC对不同来源的骨髓间充质干细胞迁移活性的影响。结果尽管不同种属来源的骨髓间充质干细胞在形态上存在一定差异,但一定浓度的GC能够显著增强其趋化活性(P<0.05)。结论急性应激条件下,骨髓间充质干细胞迁移活性增强对损伤组织修复具有潜在的临床意义。     

SPK1基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的观察鞘氨醇激酶-1（SPK-1）基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。方法分别用携带SPK-1和绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒载体,感染大鼠骨髓间充质干细胞后用WesternBlot的方法检测SPK1蛋白表达,用[32P]ATP掺入法检测SPK-1酶活性,用MTT法测定细胞增殖,用特殊诱导剂在体外向成骨和成脂细胞诱导后检测碱性磷酸酶的活性及油红O染色,用AnnexinV-PI双标法检测去血清诱导后细胞凋亡比例。结果Ad-SPK感染大鼠骨髓间充质干细胞后可有效表达SPK-1蛋白且有较高的酶活性;基因转染不影响MSC的增殖和向成骨、成脂细胞的分化,但可显著抑制去血清诱导的细胞凋亡。结论腺病毒介导的SPK-1基因转染不影响MSC的增殖、分化等干细胞基本特性,但可显著增强其抗凋亡能力。     

改良法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：改良大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）原代分离方法,探讨大鼠MSCs体外培养的适宜条件。方法：比较改良与传统单纯贴壁培养法、密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠MSCs,观察不同方法获得原代细胞形态及不同代MSCs的生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记,同时观察不同浓度的胎牛血清（FBS）对MSCs生长曲线的影响。结果：改良单纯贴壁培养法获得的原代细胞贴壁时间早、生长快,与其他两种分离方法差异明显（P〈0.01）;原代MSCs用15％的FBS培养,其增殖明显高于5％、10％及20％的FBS培养;第3代以后MSCs用5%的FBS培养有力于细胞纯化。结论：成功地改良了分离培养大鼠MSCs的方法,配合不同血清浓度培养基可使收获MSCs效率增高。     

逆转录病毒介导外源基因高效感染大鼠骨髓间充质干细胞

目的 通过逆转录病毒系统将小鼠同源盒基因Soxl转移至大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）。检测外源基因的表达，感染效率及感染时间。方法 常规分子生物学亚克隆技术构建重组逆转录病毒载体，转染至包装细胞株PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液，感染rMSC，并用带EGFP表达盒的pLEGFP-N1载体的逆转录病毒系统作为平行对照，评估感染率；使用Westernblot以及免疫组织化学的方法检测携带目的基因的重组逆转录病毒在rMSC中的感染和表达情况。结果 本实验成功地制备了pLXSN—Soxl重组逆转录病毒载体并制备出高滴度病毒颗粒；将病毒上清感染rMSC，EGFP阳性细胞为21％，感染时间持续20d，而对照脂质体转染法EGFP阳性细胞仅为3％。免疫组化及Westernblot显示用重组逆转录病毒液感染的rMSC可表达外源基因产物Soxl蛋白。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将外源性基因高效转移至rMSC中，并有外源性基因的稳定表达。     

过表达GCNF诱导骨髓间充质干细胞凋亡的相关研究

目的研究过表达生殖细胞核因子(GCNF)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的可能机制。方法通过过表达GCNF腺病毒上调BMSCs中GCNF表达水平,利用间接免疫荧光化学技术确定其亚细胞定位,MTT检测细胞活力的影响,DAPI染色检测细胞凋亡,Caspase3/8/9检测细胞凋亡蛋白活性。结果 BMSCs细胞中GCNF过表达后,GCNF蛋白亚细胞定位于细胞核,细胞活力降低,凋亡通路被激活。结论腺病毒GCNF过表达能降低大鼠BMSCs细胞活力,增加其凋亡水平。     

骨髓间充质干细胞离子通道的表达及意义

目的：研究分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜表面离子通道的表达,为研究干细胞在分化过程中离子通道变化奠定基础。方法：采用Percoll分离液体外分离法,体外培养出能稳定传代的大鼠BMSCs,利用膜片钳技术记录BMSCs的离子电流。通过设定不同的实验程序,记录通道电流的幅度、激活和失活电流的峰值与时程、离子通道的选择性、Ⅰ-Ⅴ曲线。利用各种通道阻滞剂对记录到的电流进行鉴定、分析。结果：培养的细胞接种后24 h开始贴壁,传代后细胞呈漩涡状。流式细胞术检测培养的细胞CD71、CD44呈阳性,CD34、CD45阴性,证实其为大鼠BMSCs。利用膜片钳技术在大鼠BMSCs上记录到延迟整流钾电流,并且在24%的BMSCs中发现了对河豚毒素（TTX）敏感的钠电流,在25%的BMSCs中记录到L-型电压依赖型钙电流。RT-PCR法证实BMSCs存在SCN5A、 Kv4.3 和CACNA1C 3种通道。结论：记录到的离子电流具有兴奋细胞的特点。     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的 探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性.方法 重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs.转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性.结果 转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P＜0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用.结论 重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白.为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs。转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性。结果转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P<0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用。结论重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白。为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

卵巢癌细胞系Smac基因的表达及意义

目的 探讨Smac基因在卵巢癌细胞系A2780、COC1及其顺铂(DDP)耐药株A2780/DDP、COC1/DDP中的表达及其意义.方法 半定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法检测卵巢癌细胞A2780、COC1及其顺铂耐药株A2780/DDP、COC1/DDP中Smac mRNA和蛋白的表达.结果 卵巢癌细胞A2780、COC1及其顺铂耐药株A2780/DDP、COC1/DDP四种细胞系中均有Smac mRNA和蛋白的表达;Smac在A2780、COC1中的表达高于其顺铂耐药株.结论 低表达Smac抑制凋亡,低表达Smac可能与耐药有关.     

异种骨髓间充质干细胞胸腺修饰诱导免疫耐受的可行性研究

目的:确定骨髓间充质干细胞(BMSCs)在异种胸腺内的演化过程,为进一步进行BMSCs胸腺修饰诱导异种免疫耐受的研究提供可行性依据.方法:取豚鼠BMSCs经分离纯化体外扩增至第3代,并行胎牛血清-Fe2O3和4,6-二咪基-4-联苯基吲哚(DAPI)标记,标记后的豚鼠BMSCs行胸腺注射,7天后进行切片普鲁士蓝-中性红...     

成熟型Smac真核表达载体的构建及其在膀胱癌T24细胞中的表达

目的 构建成熟型Smac基因真核表达载体．探讨成熟型Smac基因促进肿瘤细胞凋亡的可能性。方法 以Xba Ⅰ和Bam HⅠ双酶切质粒pET15b-Smac．回收酶切释放基因片断．定向插入以Xba Ⅰ和BamHⅠ双酶切的真核表达质粒pcDNA3．1（-）中．构建含有成熟型Smac基因的真核表达载体pcDNA-MT Smac．测序鉴定重组的质粒。构建的质粒转染膀胱癌T24细胞．在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导下以原位未端转移酶标记法（TUNEL）检测凋亡率。结果 以T7引物测序证实得组的质粒pcDNA-MT Smac含有成熟型Smac基因。空白对照组、50ng／ml TRAIL处理组、转染Smac组和转染Smac后50ng ml TRAIL处理组的凋亡率分别为1．6％、20．2％、1．7％和35．7％．未经TRAIL诱导．T24细胞及转染了成熟型Smac的T24细胞间凋亡率差异无显著性意义（P〉0．05）．然而作TRAIL的诱导下．转染了成熟型Smac的T24细胞凋亡率明显高于术转染细胞．其差异有级显著性意义（P〈0．01）。结论 成功构建了含有成熟型Smac基因的真核表达载体．并证实该基因可以促进TRAIL诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡．为研究成熟型Smac基因促进肿瘤细胞凋亡提供了实验依据。     

Inhibition of hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis by salvianolic acid in rat mesenchymal stem cells

OBJECTIVE:To investigate the influence and mechanism of salvianolic acid B(SalB) on apoptosis inhibition in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells(BMSCs) induced by hypoxia and serum deprivation(hypoxia/SD).METHODS:SalB concentration of 0.1,1,10 or 100 mg/L(drug groups) were investigated for their ability to inhibit apoptosis in rat BMSCs.BMSCs in both the apoptosis model and drug groups were cultured under hypoxic conditions for 6 h,after which cell apoptosis and change in mitochondrial membrane potential(MMP) were detected using flow cytometry.Activation of caspase-3 was detected using western blot analysis.RESULTS:Hypoxia/SD induced apoptosis in rat BMSCs.The early apoptosis rate was lower in the drug groups compared to the apoptosis model group(P<0.05).SalB was found to inhibit the reduction in MMP and decrease the activation of caspase-3.CONCLUSION:0.1,1 and 10 mg/L of SalB inhibits activation of caspase-3 and early apoptosis of rat BMSCs induced by hypoxia/SD and could therefore enhance the survival rate of grafted stem cells.     

骨髓间充质干细胞对继发性骨质疏松大鼠骨缺损愈合的影响

目的：探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在继发性骨质疏松性的个体骨缺损愈合过程中的作用。方法采用全骨髓贴壁分离法培养原代BMSCs细胞,并使用流式细胞仪检测及使用成骨成脂特异性染色鉴定培养的BMSCs;选取60只雌性SD大鼠,通过肌注地塞米松(DEX,1 mg·kg-1·d-1)8周,建立大鼠骨质疏松模型。所有大鼠经手术于胫骨平台下钻孔造骨缺损模型,将大鼠随机分成三组：对照组(NS组,骨折不处理)、DEX骨折+生理盐水(NS)组、DEX+BMSCs组,将BMSCs注射到大鼠骨缺损部位治疗(采用生理盐水进行对照),于术后4周和8周,采用Micro-CT检测各组大鼠的骨缺损愈合情况。结果经流式细胞表型鉴定及成骨成脂特异性染色实验均证实分离得到的细胞是BMSCs。Micro-CT结果表明,与DEX+NS组比较,BMSCs细胞治疗能促进DEX诱导的骨质疏松性骨折的愈合。结论 BMSCs对继发性骨质疏松性大鼠的骨缺损具有显著的促进愈合作用,这为临床治疗继发性骨质疏松个体的骨损伤提供了一种新的研究思路。     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株中survivin和SMAC/DIABLO基因表达的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3中survivin、Smac/DIABLO表达的影响,探讨survivin、Smac/DIABLO在ASODN诱导卵巢癌细胞凋亡和细胞周期改变中的作用和分子机制.方法 用脂质体(LipofectamineTM 2000)介导survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,用MTT比色法检测细胞生长活性,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数、细胞周期分布及survivin、Smac蛋白表达改变,逆转录酶链反应检测survivin、Smac/DIABLO基因表达改变.结果 同对照组比较,不同浓度ASODN作用后细胞生长明显减慢,转染后48 h IC50在600 nmol/1左右.用600 nmol/LASODN转染48h后,细胞凋亡指数(AI)明显增加,(t=6.3671,P＜0.05);更多的细胞停留在G0/G1期(t=10.3832,P＜0.01).Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.5031,P＜0.05,t=7.8146,P＜0.01),SmacmRNA和蛋白表达上调(t=2.8011,P＜0.05,t=11.3917,P＜0.01).结论 ASODN诱导细胞凋亡,使更多的细胞停留在G0/G1期,减少进入有丝分裂细胞数的作用,是通过下调survivin基因,上调Smac基因表达来共同完成的,survivin、Smac/DIABLO基因在调节SKOV3细胞周期、凋亡的功能上密切相关,二者的相互作用是卵巢癌发生、发展的重要分子机制之一.     

谷氨酸对体外培养胎鼠神经干细胞的损伤作用

目的:探讨谷氨酸对体外培养胎鼠神经干细胞的损伤作用,为开发神经干细胞保护药物的研究提供理论依据。 方法:取妊娠15 d的Wistar大鼠胚胎脑组织行体外细胞培养,采用免疫组化方法检测证实为神经干细胞。以正常培养的神经干细胞为对照组,谷氨酸处理组加入不同浓度的谷氨酸,MTT比色法观察神经干细胞的存活率。结果:从神经干细胞球内分化的细胞既有神经元又有神经胶质细胞,免疫组化结果显示,神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色阳性和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。谷氨酸处理组给药 24 h后,与对照组比较神经干细胞存活率明显降低,50 μmol·L^-1 谷氨酸组细胞存活率为86.45%,与对照组比较差异无显著性（P>0.05）; 100及1 000 μmol·L^-1 谷氨酸组干细胞存活率（分别为71.22%和15.14%）低于对照组（P<0.05,P<0.01）。结论:谷氨酸对神经干细胞有损伤作用,且呈剂量依赖关系,随着谷氨酸剂量的增加,神经干细胞的存活率逐渐降低 。     

软骨细胞与骨髓间充质干细胞隔离共培养构建组织工程化软骨

目的探讨隔离共培养条件下,软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化并形成软骨组织的能力。方法分别提取并培养兔BMSCs和耳软骨细胞,以5．0×10^7／ml的终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）支架上并置于Transwell室内。实验组Transwell下方为贴壁软骨细胞,对照组Transwell下方为DMEM培养液（含10％胎牛血清）。两组BMSCs-支架复合物体外培养8周后植入裸鼠皮下,继续培养6周后取材。通过大体观察、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生组织进行评价。结果体外培养期间,实验组和对照组BMSCs在支架上黏附良好并能分泌细胞外基质,RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖有较强的表达,而对照组两者的表达较低或检测不到。裸鼠皮下培养6周,实验组BMSCs-支架复合物能基本保持原形,组织学染色及免疫组织染色显示新生组织有明显的软骨陷窝形成并表达软骨特异性细胞外基质。对照组BMSCs-支架复合物逐渐皱缩变形,未见形成软骨样组织。结论采用Transwell隔离共培养的方法,软骨细胞能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。     

转染绿色荧光蛋白-胰岛素融合基因的小鼠骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病小鼠

目的:构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)及胰岛素融合基因的重组质粒,转染小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察转染融合基因后BMSCs移植治疗糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法:应用重叠延伸PCR技术合成insulin-IRES-EGFP和IRES-EGFP两段序列,分别克隆至逆转录病毒载体pMSCV中,经过包装细胞PT67的包装后转染小鼠BMSCs。荧光显微镜观察转染后EGFP的表达；RT-PCR法检测转染后胰岛素基因的表达。将转染了两种质粒的BMSCs培养后分别植入两组糖尿病模型小鼠体内,观察各组受体鼠血糖及体质量等指标的变化,并以正常对照组小鼠作对照。结果:成功构建重组质粒pMSCV-insulin-IRES-EGFP、pMSCV-IRES-EGFP;倒置荧光显微镜下观察到转染后的BMSCs发出稳定的绿色荧光信号。转染了pMSCV-insulin-IRES-EGFP的BMSCs能稳定表达外源性胰岛素基因,转染后小鼠血糖明显低于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05)；转染后35 d体质量明显高于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05)。结论:重构的insulin-EGFP载体能够起到良好的示踪作用,且EGFP的表达不影响胰岛素基因的表达；转染融合基因的小鼠BMSCs移植治疗糖尿病小鼠可以部分缓解小鼠糖尿病症状。