MALDI-TOF MS鉴定马尔尼菲篮状菌的实验条件优化

目的 构建用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)鉴定马尔尼菲篮状菌的数据库,并探索用于MALDI-TOF MS鉴定马尔尼菲篮状菌的最佳培养条件和前处理方法 .方法 利用8株马尔尼菲篮状菌构建自建数据库,比较不同培养基[沙保弱葡萄糖琼脂培养基(SDA)、沙氏葡萄糖肉汤培养基(SDB)]、培养...     

百日咳鲍特菌MALDI-TOF MS谱库的扩展及鉴定效果评价

目的对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术鉴定百日咳鲍特菌谱库进行扩展。方法采用Microflex LT软件,用经全基因组测序确认的9株百日咳鲍特菌和1株副百日咳鲍特菌构建蛋白质指纹谱库,对布鲁克数据库进行扩展。对标准菌株ATCC 29213、ATCC 25922、ATCC 700603、ATCC 27853进行MALDI-TOF MS鉴定,评价扩展库的准确性。选取6株百日咳鲍特菌,每个菌株取3个菌落分别用MALDI-TOF MS鉴定,评价试验的精密度。采用36株临床分离株验证扩展谱库对百日咳鲍特菌的识别能力,并进行扩展库前后鉴定结果比较。结果成功构建9株百日咳鲍特菌和1株副百日咳鲍特菌参考谱库,并扩展现有布鲁克数据库Taxonomy(5989)数据库为Taxonomy(5989+)。扩展库准确鉴定4株标准菌株ATCC 29213、ATCC 25922、ATCC 700603、ATCC 27853,对鲍特菌鉴定无干扰;6株百日咳鲍特菌的重复鉴定符合率为100%,精密度良好。用于外部验证的36株菌经扩展后数据库鉴定,种水平鉴定率达86.1%。结论百日咳鲍特菌质谱库的扩展提升了地区性分离菌株鉴定能力。     

VITEK MS质谱仪错误鉴定福氏志贺菌1例

目的了解VITEK MS对1株从血培养分离的福氏志贺菌的鉴定能力。方法采用VITEK MS、Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定仪、血清凝集试验及16S rRNA基因测序进行鉴定;采用VITEK MS分别对福氏志贺菌临床株、福氏志贺菌CMCC51572、大肠埃希菌ATCC8739进行质谱鉴定及蛋白质谱图比较分析。结果 VITEK MS鉴定为大肠埃希菌,可信度为99.9%;Vitek 2 Compact鉴定为志贺菌属,可信度为89.0%;血清学结果为福氏志贺菌3a型;16S rRNA基因测序为志贺菌、福氏志贺菌1a、福氏志贺菌2a、大肠埃希菌,序列同源性达97%以上;福氏志贺菌临床株、福氏志贺菌CMCC51572、大肠埃希菌ATCC8739的蛋白质谱图相似。结论志贺菌和大肠埃希菌在基因角度上符合同一个种,VITEK MS不能区分志贺菌和大肠埃希菌,需要附加生化反应、科玛嘉尿道定位显色培养及血清学试验进行志贺菌的排除。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定布鲁菌1例

正布鲁菌病(布病,brucellosis)又称波浪热或马耳他热等,是由布鲁菌引起的人畜共患的烈性传染病,主要以牛、羊、猪为传染源。布鲁菌可通过皮肤、呼吸道、消化道进入人体引起感染,以长期发热、多汗、关节痛及全身乏力、疼痛为主要特征。该病以往多见于牧区,近年来散发于大中城市,以青壮年为主。我院近期从1例来自山西的反复发热的患儿血培     

MALDI-TOF-MS鉴定丝状真菌研究进展

正近年来,丝状真菌感染的发病率和病死率逐渐增高,研究表明抗真菌治疗延迟与病死率升高密切相关,因此,快速、准确鉴定至种水平越来越必要[1]。目前形态学鉴定是丝状真菌鉴定最广泛的方法。该方法鉴定率低,鉴定时间长,需4~5d时间,易延误临床的诊断和治疗;由于菌株表型特征多变,易受到实验室人员个人经验的影响:裂褶菌、尖端赛多孢子菌组织形态学与曲霉属、镰刀菌非常相似,仅靠组织形态学很难区别开[2]。用真菌通用引物Its1和Its4进行聚合酶链反应扩增结合DNA测序对丝状真菌进行鉴定,是目前公认的金标准,但操作繁琐,前处理需1h,鉴定需24~48h,对操作人员要求高,     

两株形态不同脓肿分枝杆菌的鉴定与分析

分析比较临床1例重症肺炎患者痰标本培养出的平滑型脓肿分枝杆菌（Mab S）和粗糙型脓肿分枝杆菌（Mab R）,并进行药敏试验研究,为临床诊断治疗提供科学依据。对Mab S和Mab R进行菌体形态观察、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和16S r...     

3种方法对曲霉菌鉴定结果对比研究

目的 对传统手工法、分子测序、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)3种鉴定方法进行比较,建立一套适合该实验室的快速准确的丝状真菌鉴定标准操作流程。方法 收集2020年1月至2021年3月于重庆医科大学附属第二医院住院患者的56株曲霉菌株,分别采用上述3种鉴定方法对菌株进行鉴定,比较鉴定准确率;比较传统甲酸乙腈萃取法与改良锆珠甲酸乙腈法两种前处理方法对质谱鉴定能力的影响;比较曲霉菌不同培养基及培养天数对质谱鉴定能力的影响。结果 以分子测序为金标准,传统手工法鉴定准确率为57.1%(32/56),MALDI-TOF MS鉴定准确率为92.9%(52/56);菌丝在锆珠中震荡研磨后,再进行甲酸乙腈萃取获得的质谱鉴定能力更佳;曲霉菌用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养3 d和5 d时,质谱鉴定准确率最高,分别为73.2%和75.0%。结论 MALDI-TOF MS操作简便、快速,且准确性高。曲霉菌用PDA液体水平振摇培养后,使用锆珠甲酸乙腈法前处理,进行质谱鉴定可获得较理想的鉴定效果和蛋白图谱质量,适合常规实验室曲霉菌的质谱鉴定。     

人源猪链球菌19株分离鉴定及毒力基因检测

目的检测广西右江民族医学院附属医院2015-2019年临床分离的猪链球菌对常用抗生素耐药性及毒力基因,了解该地区猪链球菌对常用抗生素耐药性及分子流行病学特征。方法收集2015-2019年临床分离的猪链球菌19株,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对其进行鉴定,参照CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定猪链球菌对常用8种抗生素的敏感性,同时检测其种特异性基因16S rDNA及cps2J、mrp、ef、orf2、fbps、gapdh 6个毒力基因携带情况。结果19株菌株经MALDI-TOF MS鉴定均为猪链球菌,鉴定正确率均在99%以上。药敏试验结果显示这19株菌株对青霉素的敏感率为68.5%,对氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和万古霉素均100%敏感,对红霉素和克林霉素100%耐药。毒力基因检测结果显示该地区流行的猪链球菌主要基因型以cps2J、mrp、ef、orf2、fbps、gapdh型为主。所有的分离株均携带了ef和fbps毒力基因。结论及时掌握该地区致病性猪链球菌对常用抗生素的耐药性及其毒力因子的流行病学,对于预防和控制大规模暴发猪链球菌感染具有参考意义。     

3种方法对1株临床疑难菌的鉴定及结果比较

目的 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、16S rRNA序列分析和全基因组测序(WGS)对从临床标本中分离的1株疑似盐单胞菌进行菌种鉴定,比较3种方法的鉴定结果。方法 采用MALDI-TOF MS对待测菌进行蛋白质图谱收集,通过比对图谱特征峰实现菌种鉴定;对菌株进行16S rRNA基因测序,将测序结果与数据库比对;待测菌WGS后进行序列比对分析,具体包括使用ANIm和ANIb 2种方法计算平均核苷酸一致性(ANI)以及与基因组分类数据库(GTDB)进行比对;基于全基因组序列中的16S rRNA序列和看家基因序列构建系统进化树,以及基于COG和KEGG功能对基因组进行聚类分析。结果 MALDI-TOF MS对待测菌株的鉴定结果是Halomonas hamiltonii;经16S rRNA序列分析,发现待测菌株与3种盐单胞菌(Halomonas hamiltonii、Halomonas stevensii和Halomonas johnsoniae)的相似度均>99%,且相似度差异非常小,因此无法进行准确的菌种鉴定;基于WGS的基因序列比对、系统发育树、...     

基于高通量测序的平均核苷酸一致性在1株弗朗西斯菌鉴定中的应用

目的对一溺水性肺炎患者血液标本中分离的弗朗西斯菌(编号Wenzhou1)进行菌种鉴定。方法采用Illumina二代测序平台2000/mi Seq系统对实验菌株进行高通量测序,Microbe Trakr Plus软件对测得的全基因组草图进行序列拼接。在Gen Bank数据库中,对实验菌株的16S rRNA基因、mdh基因、rpo B基因和sdh A基因序列进行NCBI BLAST分析,获得与实验菌株遗传关系接近的近缘菌种信息。Java 8运行环境,Ortho ANI软件对实验菌株和近缘菌种进行全基因组序列NCBI BLAST搜索和全基因组平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)分析。结果测得的弗朗西斯菌Wenzhou1的基因组大小为1.96×10~6bp,含74个重叠群(contigs)。基因组G+C mol%为32.1%,与其他弗朗西斯菌和另弗朗西斯菌一致。Gen Bank数据库NCBI BLAST分析结果显示,Wenzhou1的16S rRNA基因、mdh基因、rpo B基因和sdh A基因序列与西班牙弗朗西斯菌FSC454和"土拉弗朗西斯菌新凶手亚种"3523最为近缘。ANI分析显示,实验菌株Wenzhou1与西班牙弗朗西斯菌FSC454的ANI为97.8%,与"土拉弗朗西斯菌新凶手亚种"3523的ANI在97.5%~97.6%之间,而与土拉弗朗西斯菌的4个亚种的ANI在91.3%~91.5%之间。结论基于全基因组序列的ANI分析是一种准确和有效的菌种鉴定方法。Wenzhou1可明确鉴定为西班牙弗朗西斯菌。     

巴尔通体MALDI-TOF MS数据库的建立与鉴定方法的评价

目的 建立巴尔通体的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)数据库和质谱鉴定方法,利用野生菌株进行验证、评价.方法 应用MALDI-TOF MS采集巴尔通体ATCC标准菌株和国内流行菌株的质谱数据,每株菌采集24张的质谱图集,获得特定的蛋白指纹图谱,汇总成不同种巴尔通体的标准质谱图,建立巴尔通体MA...     

MALDI-TOF MS identification of anaerobic bacteria: assessment of pre-analytical variables and specimen preparation techniques

Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has emerged as a tool for identifying clinically relevant anaerobes. We evaluated the analytical performance characteristics of the Bruker Microflex with Biotyper 3.0 software system for identification of anaerobes and examined the impact of direct formic acid (FA) treatment and other pre-analytical factors on MALDI-TOF MS performance. A collection of 101 anaerobic bacteria were evaluated, including Clostridium spp., Propionibacterium spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., and other anaerobic bacterial of clinical relevance. The results of our study indicate that an on-target extraction with 100% FA improves the rate of accurate identification without introducing misidentification (P < 0.05). In addition, we modify the reporting cutoffs for the Biotyper “score” yielding acceptable identification. We found that a score of ≥1.700 can maximize the rate of identification. Of interest, MALDI-TOF MS can correctly identify anaerobes grown in suboptimal conditions, such as on selective culture media and following oxygen exposure. In conclusion, we report on a number of simple and cost-effective pre- and post-analytical modifications could enhance MALDI-TOF MS identification for anaerobic bacteria.     

Identification,characterization, and biofilm formation of clinical Chryseobacterium gleum isolates

Chryseobacterium gleum is not commonly isolated from clinical source(s). Using 16S rRNA gene sequencing, we identified 15 C. gleum isolates from the Central Region Hospital Alliance, Taiwan, which were all misidentified: 14 as Chryseobacterium indologenes and 1 as Elizabethkingia meningoseptica using the Vitek 2 GN card. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, a rapid and clinically applicable method, was evaluated for the identification of C. gleum, and the rate of species or probable species level identification reached 13.3% and 86.6%, respectively. Using pulsed-field gel electrophoresis analysis, all C. gleum isolates from central Taiwan were found to be epidemiologically unrelated. The most prevalent sample was urine (35.7%, 5/14), followed by sputum (28.6%, 4/14), whereas 1 isolate was from an unknown source. All of the isolates were susceptible to minocycline, 93.3% susceptible to trimethoprim/sulfamethoxazole, but were completely or highly resistant to the other drugs examined. Biofilm-forming ability was observed in 40.0% (6/15) isolates using the Luria–Bertani broth. To the best of our knowledge, this is the first focusing on exploring clinical C. gleum isolates.     

4株威克汉姆无绿藻的鉴定及基因特征分析

目的对临床分离的4株无绿藻进行菌种鉴定和基因特征分析。方法对临床分离的4株酵母样微生物进行培养特性和形态学特征分析,商品化Vitek 2细菌鉴定系统(配套YST卡)和MALDI-TOF MS微生物鉴定系统鉴定;PCR扩增其16S rRNA基因和28S rRNA基因,并进行系统发育分析,以确定其分类学地位。结果该4株微生物在沙保氏葡萄糖琼脂培养基上培养3 d可形成灰白色、光滑、湿润的"酵母样真菌"菌落;光镜下观察可见大量圆形、卵圆形或椭圆形的孢子囊,且其内含内孢子,形似桑葚状或草莓状,与酵母菌的菌体形态差异显著;Vitek YST和MALDI-TOF MS系统,均鉴定为威克汉姆无绿藻。该4株微生物同时存在代表原核生物的16S rRNA基因以及代表真核生物的28S rRNA基因,其中,16S rRNA基因序列与威克汉姆无绿藻相似度最高,在99.7%以上;28S rRNA基因经克隆测序发现其存在多拷贝,且同一菌株不同克隆序列之间相似度在91.9%～100%。16S rRNA基因和28S rRNA基因系统发育分析均显示,该4株微生物与威克汉姆无绿藻聚类在同一个分枝。结论该4株微生物可鉴定为威克汉姆无绿藻,且单拷贝的小亚基16S rRNA更适合作为其菌种鉴定的靶基因。     

Identification of Brucella spp. isolates and discrimination from the vaccine strain Rev.1 by MALDI-TOF mass spectrometry

Brucellosis' surveillance and control programs require robust laboratory techniques that can reliably identify and biotype Brucella strains and discriminate between vaccine and field infection. In the recent years, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) has revolutionized the routine identification of several microorganisms in clinical microbiology laboratories. Nevertheless, its application on Brucella spp. identification is limited since there are no reference spectra in the commercial databases, due to the microorganism's potential bioterrorist use.In this study, a custom MALDI-TOF MS reference library was constructed and its performance on identification at species level was evaluated using 75 Brucella spp. isolates. Furthermore, distinct peak biomarkers were detected for biovar assignment and discrimination from vaccine strain Rev.1. Analysis of mass peak profiles allowed Brucella accurate identification at genus and species level (100%) with no misidentifications. Despite the high intrageneric similarity, MALDI-TOF MS database succeeded in classifying at biovar level, 47 out of 62 B. melitensis bv. 3 isolates (75.81%), whereas all B. melitensis strains, except for one, were correctly discriminated from vaccine strain Rev.1.MALDI-TOF MS appeared to be a rapid, cost-effective and reliable method for the routine identification of brucellae which reduces time consumption in pathogen identification and could replace in the near future the current conventional and molecular techniques. Its ability to differentiate vaccine from field infection could facilitate brucellosis’ monitoring systems contributing in the effective control of the disease.     

应用MALDI-TOF质谱技术检测多发性骨髓瘤Jak2基因单核苷酸多态性

本研究探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI—TOFMS）检测多发性骨髓瘤（MM）jak2基因的单核苷酸多态性（SNP）的实用性。用PCR扩增出含jak2基因2个SNP（C428T和C643T）位点的DNA片段作为模板,产物纯化后利用MALDI,TOFMS检测5例MM和5例健康对照者样本的jak2基因多态性。结果表明：C428T和C643T位点基因型在多发性骨髓瘤病例与健康对照组的分布无差异,均为T／T纯合子。结论：本实验建立的基于MALDI—TOFMS与引物延伸技术检测jak2基因多态性的方法是一个快速、准确和可靠的检测方法。