抗烯醇化酶抗体检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值

目的 利用白念珠菌烯醇化酶重组蛋白质为抗原,建立测定人血清中抗白念珠菌烯醇化酶IgG类抗体的ELISA法,评估其在侵袭性念珠菌病(IC)诊断中的应用价值.方法 收集各类确诊IC患者(66例)和白念珠菌定植者(32例)血清,用重组白念珠菌烯醉化酶包被ELISA微孔板,测定血清中的抗烯醇化酶抗体,确定cut off值并对方...     

白念珠菌烯醇化酶N端肽段ENO1 319P的原核表达和鉴定

摘要：目的:制备白念珠菌烯醇化酶N端基因重组肽段ENO1-319P并检测其抗原性。 方法:选择与人烯醇化酶蛋白α-ENO同源性低的白念珠菌烯醇化酶肽段ENO1-319P,将其编码DNA序列克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导带有His标签的重组肽段的表达。用SDS-PAGE电泳分析,TALON金属亲和层析柱纯化重组蛋白,其抗原性用侵袭性白念珠菌感染（ICAI）患者血清进行western blot评估。 结果:成功表达并纯化了目的肽段,该蛋白可与ICAI患者血清发生特异性反应。 结论:获得了白念珠菌烯醇化酶N端肽段ENO1-319P的基因表达工程菌株,为将此重组肽段用于制备特异性更高的抗体打下基础。     

白念珠菌烯醇化酶重组蛋白质的制备及鉴定

目的 制备具有高免疫原性的白念珠菌重组烯醇化酶蛋白质。 方法 以白念珠菌C1标准株基因组DNA作为模板,用PCR法扩增烯醇化酶的全长DNA序列,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白质表达。用抗his标签的单克隆抗体和白念珠菌抗体阳性的病人血清进行western blot鉴定,亲和层析柱纯化重组蛋白质。 结果 获得了含白念珠菌烯醇化酶全长基因的重组表达载体和相应工程菌株,经IPTG诱导后能高效表达重组融合蛋白质。经已含抗体的病人血清进行western blot鉴定,表明诱导的重组蛋白质有良好的免疫原性。 结论 成功克隆了白念珠菌烯醇化酶全长基因并在大肠埃希菌中获得高效表达;重组蛋白质具有良好的免疫原性。     

白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

摘要：目的：建立检测白念珠菌烯醇化酶（enolase, Eno）的双抗体夹心ELISA法,并试用于几种真菌培养上清液的检测。 方法：将抗白念珠菌Eno单抗作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗Eno抗体作为检测抗体,用方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体浓度,建立检测Eno的ELISA法,对方法的精密度、特异性、最低检测限等指标进行评价。用该法检测白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母等不同真菌培养上清中Eno水平。 结果：Eno浓度为20 ng/mL和5 ng/mL时,批内和批间变异系数(CV)分别为6.61%、9.19%和6.98%、13.81%;最低检测限为1.25 ng/mL。本法可从白念珠菌37 ℃培养24 h后的上清中检出Eno,Eno含量与白念珠菌菌丝含量呈正相关。本法对近平滑念珠菌有微弱交叉反应,与热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应。 结论：建立的检测白念珠菌Eno的双抗体夹心ELISA方法有较好的特异性,可用于评价Eno检测在侵袭性白念珠菌感染中的诊断价值。     

白念珠菌烯醇化酶N端肽段ENO1-319P的原核表达和鉴定

目的 制备白念珠菌烯醇化酶N端基因重组肤段EN01-319P并检测其抗原性.方法 选择与人烯醉化酶蛋白a-ENO同源性低的白念珠菌烯醇化酶肤段ENOI-319P,将其编码DNA序列克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导带有His标签的重组肽段的表达.用SDS-PAGE电泳分析...     

抗真菌药物新作用靶点机制的研究进展

正条件致病性真菌在过去的几十年中逐渐被认为是人类真菌感染的重要致病菌,尤其对于免疫功能低下的患者,如移植受者、艾滋病患者和癌症患者,由念珠菌属引起的侵袭性感染是现代血流感染的第四大死因~([1]),在院内血流感染的死亡率中,念珠菌感染占40%~([2])。在北京和上海大型医院的念珠菌感染调查中,白念珠菌感染分别占46.20%和57.80%~([3-4])。目前抗真菌药物有多烯类、唑类、烯丙胺类、棘白菌素类和嘧啶类等,但这些药物均会产生一定的副作用,常见的如嗳     

侵袭性念珠菌感染血清学诊断的研究进展

随着免疫力低下宿主的增多,侵袭性念珠菌感染(ICI)患者有不断增加趋势。除了常规培养技术,血清学诊断因其快速越来越受到临床关注。近年来,研究者用蛋白质组学分析了ICI患者血液中存在的念珠菌抗原成分及其特异抗体,并用分子生物学技术不断探寻新的检测指标。抗原包括念珠菌细胞壁及胞浆成分(β-葡聚糖、甘露聚糖、甘露糖蛋白65、热激蛋白90、烯醇化酶1等)、分泌酶类(分泌型天冬氨酸酶2等),抗体包括细胞壁甘露聚糖抗体、菌丝相抗原抗体(细胞延长因子、菌丝调节蛋白、凝聚素样序列、菌丝壁蛋白等抗体)、代谢酶Eno1抗体及多种抗体联合检测等。本文就血清学检测诊断ICI的研究进展作一综述。     

133例念珠菌血症临床与实验室分析

摘要：目的：探讨医院内侵袭性念珠菌病（IC）的流行特征、耐药情况及血清学检测结果,为念珠菌感染的病原学诊断及合理用药提供依据。 方法：收集2009~2011年间南京军区南京总医院全部血培养念珠菌阳性病例进行回顾性分析。 结果：共检出念珠菌血症133例。菌株主要为热带念珠菌（28.6%）、白念珠菌（23.3%）和近平滑念珠菌（19.5%）。对抗真菌药物的敏感率依次为：伏立康唑（97.8%）、伊曲康唑（69.2%）、氟康唑（45.4%）、酮康唑（38.9%）。31例检测了血清(1,3)-β-D-葡聚糖（BG）水平,阳性率为48.3%（15/31）;102例检测了血清抗烯醇化酶（Eno）抗体,阳性率为60.8%（57/102）;23例同时进行抗Eno抗体和BG检测,阳性率为73.9%（17/23）。 结论：引起念珠菌血症的病原体主要为热带念珠菌、白念珠菌和近平滑念珠菌。对氟康唑均有不同程度的耐药。联合血清学检测有助于辅助诊断念珠菌血症。     

用系统性念珠菌感染小鼠模型评价白念珠菌蛋白Eno1、Bgl2、Pgk1的免疫反应性

目的用系统性念珠菌感染小鼠模型评价白念珠菌蛋白烯醇化酶1(Eno1)、β-葡萄糖苷酶2(Bgl2)、磷酸甘油激酶1(Pgk1)的免疫反应性。方法腹腔注射环磷酰胺致小鼠免疫力低下后,再腹腔注射白念珠菌SC5314以制备系统性念珠菌感染小鼠模型;用ELISA法和western blot法分析重组Eno1、Bgl2和Pgk1蛋白与模型小鼠血清抗体的免疫反应性。结果建模小鼠肠系膜边缘有米黄色细小颗粒,腹腔中有菌丝样生长的念珠菌,肾脏中可检测到念珠菌生长。小鼠感染白念珠菌6~8 d后出现抗Eno1、抗Bgl2和抗Pgk1的Ig G类抗体,效价峰值出现在感染后第20~24天。抗Eno1抗体效价最高,其次为抗Pgk1,抗Bgl2最低。Eno1与小鼠血清免疫反应性最强,Bgl2免疫反应性较弱。结论念珠菌可有效刺激小鼠产生抗Eno1、抗Bgl2和抗Pgk1的Ig G类抗体。重组Eno1蛋白免疫反应性最强,可用于后续研究。     

用动物模型评估抗烯醇化酶抗体测定对系统性白念珠菌病的诊断价值

目的:建立系统性白念珠菌痛(SC)家兔模型,考察免疫功能正常组和免疫功能低下组家兔产生特异性抗体的动力学,评估抗烯醇化酶抗体的诊断价值.方法:新西兰大白兔随机分为A组(免疫功能正常组)和B组(免疫功能低下组,注射氢化可的松建模),每组4只,静脉注射白念珠菌分生孢子,建立SC动物模型.每2d采血,用western blo...     

念珠菌耐药机制研究进展

近年来念珠菌感染的流行病学发生改变,尽管白念珠菌仍是大多数医院引起侵袭性念珠菌病的主要病原体,但是非白念珠菌的感染比例有所增加。不同种念珠菌对不同药物的敏感性不同,耐药现象成为念珠菌感染治疗的主要问题,抗菌药物常导致临床念珠菌感染治疗失败。了解念珠菌耐药机制对提高患者预后和加强感染控制十分重要。该文对念珠菌的耐药机制做一综述。     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋白的制备及鉴定

摘要：目的：制备有免疫原性的白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶（fructosebisphosphate aldolase, Fba1)重组蛋白。 方法：以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,用PCR法扩增Fba1 DNA序列,与克隆载体pMD18-T连接、测序,再与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组表达质粒pET28a(+)/Fba1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白表达,亲和层析柱纯化重组蛋白。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊为侵袭性白念珠菌病（ICAI）、且抗白念珠菌烯醇化酶抗体阳性的患者血清进行抗原性鉴定。 结果：Fba1 DNA序列与GenBank中的序列一致。在大肠埃希菌中获得白念珠菌Fab1重组蛋白的高效表达,表达产物以可溶性蛋白为主,最终蛋白质得率为7.6 mg/g湿菌。经免疫印迹鉴定,重组蛋白与抗His标签的单克隆抗体和确诊ICAI患者血清呈特异性反应,显示出良好的抗原反应性。 结论：成功制备了具有良好抗原反应性的重组蛋白,为建立特异性诊断ICAI的新方法打下基础。     

用免疫磁珠法检测抗白念珠菌烯醇化酶抗体

摘要：目的：建立检测人血清抗白念珠菌烯醇化酶(Eno)IgG类抗体的免疫磁珠法,并评估其在念珠菌血症诊断中的价值。 方法：将Eno重组蛋白耦联至磁性微珠上,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG为二抗,优化免疫磁珠法的反应条件,考察其精密度和特异性。收集经血培养确诊的念珠菌血症患者（n=113）、念珠菌定植者（n=50）、细菌菌血症患者（n=30）和健康人对照者（n=100）血清,用免疫磁珠法测定抗Eno抗体,并与ELISA法结果进行比较。 结果：免疫磁珠法测定抗Eno抗体的批内、批间变异系数（CV）分别为8.2%和14.2%,重组Eno抗原对相应抗体的阻断率为91.6%。以吸光度（A）值0.29为cut off值时,诊断念珠菌血症的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为80.5%、92.3%、90.1%和84.5%。免疫磁珠法的敏感性和特异性与ELISA法比较无统计学差异,但检测流程从37 ℃ 2.5 h缩短至常温1 h。 结论：免疫磁珠法检测抗Eno IgG类抗体简便、快捷、可靠,在侵袭性念珠菌感染研究中具有潜在的应用价值。     

侵袭性真菌感染的诊治现状

近20年来侵袭性机会真菌感染显著增多,同时其患病率和病死率也增高,机会感染的主要病原真菌为白念珠菌、新型隐球菌和烟曲霉。但近年来其他机会真菌亦日益重要,如非白念珠菌属、除烟曲霉外的其他曲霉属、毛孢子菌属、红酵母属、接合菌属(根霉、毛霉等)、镰刀霉属、赛多孢菌属以及各种暗色真菌等。一、侵袭性真菌感染的流行病学念珠菌属是机会感染最重要的病原真菌,据报道约占医院感染中血流感染的8%~10%,并且其发生率在持续增加。也是医院ICU、骨髓移植、器官移植病房最常见的病原真菌。据国外统计,侵袭性念珠菌病使病死率增加10%~49%,住…     

克柔念珠菌对抗真菌药物耐药的机制和新药开发研究进展

<正>近年来,随着HIV感染的增加、广泛使用免疫抑制剂治疗、长期使用广谱抗生素以及侵入性的临床检查如实体器官或骨髓移植~([1]),使得非白色念珠菌已超过白色念珠菌,非白色念珠菌如光滑念珠菌、克柔念珠菌等所致的侵袭性真菌的发病率和病死率呈现上升的趋势~([2])。伴随着而来的是念珠菌的耐药现状也愈演愈烈,因此导致患者治疗的失败已成为临床的重要挑战。目前克柔念珠菌对三唑类、多烯类以及棘白菌素药物均     

腹腔念珠菌病诊疗进展

<正>侵袭性念珠菌病(IC)是一种与医疗技术进步相关的真菌感染性疾病，根据念珠菌侵袭部位的不同，可分为念珠菌血症和深部念珠菌病(包括腹腔、肝脾、脑、眼、心脏、关节)^[1-2]。腹腔念珠菌病(IAC)是一类特殊的腹腔真菌感染疾病，腹腔真菌感染占腹腔感染的10%～15%，致病真菌中70%～90%为念珠菌，在重症监护病房(ICU)中由念珠菌导致的腹腔感染比例更高，     

侵袭性念珠菌病的实验室诊断研究进展

现代医学日益发展，广谱抗生素、免疫制剂及肿瘤放化疗等的广泛应用延长并改善了许多重症患者的生命，但同时也使得真菌感染日渐增多，特别是在免疫抑制疾病、恶性血液系统疾病、干细胞移植和器官移植中。念珠菌是侵袭性真菌病的主要病原体。据报道，在美国，念珠菌是引起院内血源性感染（BSI）的第4位最常见病原体，使得BSI死亡率高达49％ 。在过去的40年中，白念珠菌引起的感染数量有所下降，而其他少见的念珠菌种如光滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁念珠菌和近年新发现的都柏林念珠菌等感染显著增多。另外，不同种的念珠菌对抗真菌药物的敏感性和耐药性也有所不同。因此，提高念珠菌病诊断方法的敏感性，并对致病念珠菌鉴定到种的水平十分必要。目前，念珠菌的鉴定方法已由传统的培养法发展到非培养法，包括血清学方法和分子生物学技术等。     

用白念珠菌菌丝相蛋白抗原诊断白念珠菌病的探讨

目的建立一种特异性强的检测白念珠菌血清抗体方法，协助临床诊断侵袭性念珠菌病。方法应用超声粉碎和ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析法去除细胞壁甘露糖和糖蛋白后，ＰＡＧＥ电泳显示４７０００部分是主要的胞浆蛋白抗原，用４７０００～２９０００或全菌抗原建立ＥＬＩＳＡ法测血清抗体。结果全菌抗原，８０份正常血清７５份阳性，４０份患者血清３７份阳性；４７０００～２９０００蛋白抗原，８０份正常血清２份阳性，４０份患者血清３６份阳性。结论检测血清中抗白念珠菌菌丝相蛋白抗体，有助于诊断侵袭性白念珠菌感染。     

肾上腺髓质分泌物CgA、NSE和SYN在髓质病变中分布特点研究

目的:研究肾上腺髓质分泌物嗜铬蛋白A、神经特异性烯醇化酶和突触素在肾上腺髓质病变中的分布特点;证明肾上腺的内分泌功能是一有机整体,在肾上腺髓质发生病变时,髓质可能参与皮质功能的调节,从而导致皮质功能的异常;阐明出现临床诊断与病理诊断不一致性的可能原因;为进一步深入研究皮、髓质之间的相互作用奠定基础。方法:运用免疫组化方法对肾上腺髓质增生、嗜铬细胞瘤和嗜铬细胞癌病例进行嗜铬蛋白A、神经特异性烯醇化酶和突触素染色,正常肾上腺作为对照,观察其在皮质中分布特点。结果:肾上腺嗜铬细胞瘤和嗜铬细胞癌的皮质中均可见嗜铬蛋白A染色阳性细胞,髓质增生和正常肾上腺病例皮质肾上腺髓质分泌物嗜铬蛋白A染色阴性;肾上腺髓质增生和嗜铬细胞癌皮质神经特异性烯醇化酶染色呈阳性,嗜铬细胞瘤和正常肾上腺皮质神经特异性烯醇化酶染色呈阴性;肾上腺髓质增生、嗜铬细胞瘤和嗜铬细胞癌的皮质中神经特异性烯醇化酶染色呈阳性,正常肾上腺皮质神经特异性烯醇化酶染色呈阴性。结论:肾上腺髓质分泌物嗜铬蛋白A、神经特异性烯醇化酶和突触素分布特点可以帮助鉴别肾上腺髓质增生、嗜铬细胞瘤和嗜铬细胞癌。肾上腺皮、髓质之间联系紧密,受共同机理所调控,除经典的下丘脑-垂体-肾上腺轴和肾素-血管紧张素-醛固酮系统外,肾上腺皮、髓质之间存在相互调节的解剖学和内分泌学基础。     

关注分子技术在临床微生物检验中的应用

本期"微生物分子诊断专题"精心组织了6篇文章,包括1篇综述和5篇专著。内容主要围绕临床常见的细菌、真菌和分枝杆菌感染等的诊断、治疗(耐药)、预防和控制问题,重点介绍了分子生物学技术在临床微生物标本的直接检测、基因分型、耐药基因研究、抗原制备及血清学诊断等方面的应用研究。血流感染是一种严重的全身感染性疾病,但血培养存在检验周期长、阳性率低等问题,应用分子生物学技术能够对血流感染中的常见或少见病原菌、分枝杆菌、苛养菌等进行快速鉴定及耐药分析,可以缩短检验周期。艰难梭菌是一种重要的医院感染病原菌,引起抗菌药物相关性腹泻,GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)能够直接检测粪便标本中的艰难梭菌,具有快速、操作简便等优点。光滑念珠菌可引起血流感染等多种感染,且耐药性强,是医院感染中常见的侵袭性真菌,微卫星多态性分析法简便快速,分辨力高于多位点序列分析(MLST),可作为临床实验室光滑念珠菌基因分型方法。近年来白念珠菌对唑类抗真菌药的耐药性有增高趋势。"白念珠菌对唑类耐药的机制和生物膜相关基因的表达"一文提示ERG11基因的过度表达为白念珠菌对唑类耐药的重要机制。菌丝细胞壁蛋白HWP1基因的高表达与白念珠菌生物膜形成相关。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的主要机制是产生质粒介导的2型肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC-2),"同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌质粒blaKPC-2基因"一文建立的λred同源重组法能可靠敲除其质粒上的blaKPC-2,为进一步研究blaKPC-2在肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药中所起的作用奠定基础。"结核分枝杆菌rdESA7-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究"一文研究制备的结核分枝杆菌融合蛋白-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性,可用于结核病患者的血清学诊断。