可溶性小鼠BTLA对树突状细胞表面B7-1和B7-2表达的影响

目的研究可溶性小鼠B/T淋巴细胞弱化因子（murine B and T lymphocyte attenuator ，mBTLA）-人IgG1 Fc融合蛋白（mBTLA-hIg）对树突状细胞表面共刺激分子表达的影响。方法克隆mBT／A基因，构建mBTLA胞外功能区和人IgG1Fc融合基因的真核表达载体（pmBTLA-hIg），并采用脂质体转染法，将pmBTLA-hIg质粒转染小鼠树突状细胞系（DC2．4）。采用RT-PCR、ELISA和Westem blot分别检测pmBTLA-hIg质粒转染DC中mBTLA基因mBNA的表达及细胞培养上清中mBTLA-hIg融合蛋白的表达；采用流式细胞术检测pmBTLA-hIg质粒转染对DC2．4表面共刺激分子B7-1（CD80）和B7-2（CD86）表达的影响。结果成功克隆了小鼠BT／A基因，并构建了真核表达载体；mBTLA-hIg融合基因转染的DC高表达mBTLA-hIg融合蛋白，并可结合到DC表面。表达可溶性mBTLA-hIg融合蛋白的DC2．4表面B7．1的表达上调，B7-2的表达下调，而且这种改变可被兔抗GST-mBTLA血清阻断。结论可溶性mBTLA-hIg融合蛋白对DC细胞表面研分子的表达具有调节作用，可能是BTLA反向信号作用于DC的结果。     

人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达及生物活性分析

目的构建携带人肿瘤坏死因子受体(TNFR)胞外区融合人IgG Fc片段的重组腺相关病毒载体(pAAV/hTNFR-Fc),并对融合蛋白hTNFR-Fc的表达和生物学活性进行鉴定。方法构建hTNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染人胚肾HEK293T细胞,收集转染上清,以Western blot法检测目的蛋白的表达,应用L929细胞测定重组表达产物对人和大鼠TNF-α细胞毒中和活性,采用ELISA比较重组表达产物对人和大鼠TNF-α的结合活性。结果成功构建重组表达载体pAAV/hTNFR-Fc,在转染细胞上清中检测到目的蛋白hTNFR-Fc的表达,重组表达产物可有效结合人TNF-α并中和其L929细胞毒活性,并对大鼠TNF-α具有一定程度的结合和中和活性。结论成功构建了hTNFR-Fc融合基因,验证了其在AAV载体上的分泌性表达,并对其生物活性进行了鉴定,为进一步病毒包装和大鼠关节炎动物实验研究奠定了基础。     

人IgG Fc基因的扩增及其在真核细胞中的分泌性表达

目的:通过扩增人IgG Fc基因并与人CD5基因信号肽序列融合,构建真核分泌型表达载体,实现在真核细胞中高效表达,为利用Fc基因制备融合抗原,研究抗原基因和抗原蛋白的免疫治疗奠定了基础.方法:从外科手术切除的扁桃体中分离人淋巴细胞,用Trizol试剂提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR方法从淋巴细胞中扩增人IgG Fc 片段的基因序列,并将其克隆到pMD-T18 质粒载体上.然后以上述含有Fc片段序列的质粒载体和含有人CD5基因的质粒为模板,通过重叠延伸PCR方法将Fc片段与CD5信号肽基因序列进行融合,并将其插入到pcDNA3.1A 真核表达载体上,构建成与CD5信号肽融合的Fc片段基因的分泌型表达载体.经磷酸钙介导转染293T细胞使其表达.结果:测序表明扩增的Fc基因序列与GeneBank发表的序列完全一致,Western blot检测结果表明,本实验构建的Fc基因分泌型表达载体能够在真核细胞进行高效分泌性表达,表达水平在转染后48小时可达50 μg/1×106细胞.结论:采用RT-PCR扩增了人IgG Fc cDNA 基因,经过与人CD5信号肽序列融合构建了分泌型表达载体,实现了在293T细胞中的高效表达,这为今后构建特定抗原基因与IgG Fc基因融合表达载体,研究DNA疫苗及Fc的生物佐剂提供了实验依据.     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

乙脑病毒prME蛋白与BALB/c鼠IgG Fc段编码基因联合构建DNA免疫研究

目的 研究IgG Fc编码基因对流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)DNA疫苗免疫增强效应的影响.方法 巢式RT-PCR法从BALB/c鼠脾组织获取IgG Fc段编码基因,用限制性内切酶从含流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白基因重组子获取prME蛋白基因,分别插入同-真核表达载体pcDNA3.1(+)不同酶切位点,构建蘑组子pJME/IgG Fc并经酶切及DNA测序分析.脂质体法将pJMrY/IgG Fc转染CHO细胞.免疫荧光、Western blot法检测转染的CHO细胞中融合蛋白分布与表达.将pJME/IgG Fc肌注免疫BALB/c鼠,检测小鼠脾特异性细胞毒T细胞(CTL)杀伤活性和中和抗体滴度.结果 pJME/IgG Fc经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ/Not Ⅰ酶切释出的插入子大小,(2001 bp,2730 bp)分别与预期结果相符合.所编码的融合蛋白相对分子质量(Mr)为101×103,主要分布于胞浆,少最分布于胞膜,pJME/IgG Fc转染CHO细胞经32次传代仍可表达融合蛋白.pJME/IgGFc免疫组中和抗体滴度与CTL活性较pJME及灭活疫苗组均升高(P<0.05).结论 pJME/IgG Fc成功构建,转染的CHO细胞可稳定表达融合蛋白,IgG Fc段编码基因能够增强JEV DNA疫苗的细胞和体液免疫应答.     

小鼠趋化因子CCL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列,经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3.1-mCCL19Ig,酶切和测序鉴定插入序列;将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达,利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgG1 Fc段序列,其序列分别与GenBank中公布序列比对一致,IgG1 Fc段读码框未发生改变;Western blot结果证实转染了pcDNA3.1-mCCL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38 000的融合蛋白mCCL19Ig表达;体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性,且呈剂量依耐关系。     

人PD-1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hPD1Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hPD1Fc融合蛋白。方法PCR方法扩增编码hPD1膜外区的cDNA序列,将其与人IgG1Fc和pcDNA3.1( )片段连接,构建成hPD1Fc重组表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,夹心ELISA法检测上清液中融合蛋白hPD1Fc的表达,经ProteinA亲合层析纯化,SDSPAGE、免疫印迹鉴定表达产物。结果PCR扩增得到编码人PD1全长的288aa编码基因片段,将其膜外区167aa的编码序列与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pcDNA3.1( )表达质粒。重组质粒转染CHO细胞后,夹心ELISA法检测显示培养上清液中有hPD1Fc蛋白表达。纯化后的hPD1Fc蛋白经SDSPAGE和免疫印迹鉴定其相对分子质量约42800,与理论预测值相符。结论成功构建了hPD1Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hPD1Fc融合蛋白,为进一步研究PD1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

小鼠可溶性CD83对树突状细胞表达共刺激分子和共刺激活性的影响

目的：研究可溶性小鼠CD83（mCD83）对树突状细胞（DC）表达共刺激分子及共刺激活性的影响。方法：克隆mCD83基因，构建mCD83胞外功能区与人IgG1αFc段融合基因的真核表达载体pmCD83-hIg，并在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白。采用ELISA、Western blot和RT-PCR技术检测mCD83-hIg融合基因在COS-7细胞中的表达。用mCD83-hIg处理小鼠DC细胞系（DC2．4）采用流式细胞术检测DC细胞周期、细胞凋亡和共刺激分子CD80、CD86的表达影响；采用混合白细胞培养试验，检测mCD83-hIg对DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的影响。结果：酶切和序列测定鉴定显示构建的真核表达载体完全正确；mCD83-hIg对DC2．4细胞周期和细胞凋亡无影响，但可下调DC2．4表面共刺激分子CD80和CD86的表达；mCD83-hIg处理过的DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的能力显著下降。结论：mCD83-hIg可抑制DC表达共刺激分子并下调DC共刺激活性，从而抑制同种异基因T细胞增殖和产生细胞因子。     

重组载体pEGFP-N1/TNFR 1在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

目的： 构建肿瘤坏死因子受体1（TNFR 1）绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1/TNFR 1,并在人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中表达。方法: 分离并培养HUVECs,将已成功构建的融合表达载体pEGFP-N1/TNFR 1,通过阳离子脂质体Lipofectin介导的方法转染到HUVECs中,RT-PCR检测TNFR 1 mRNA的表达,Western blotting检测融合蛋白的瞬时表达,同时在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察。结果: 成功分离HUVECs,重组pEGFP-N1/TNFR 1融合表达载体转染HUVECs后,在细胞中检测到TNFR 1基因片段,Western blotting可以检测到TNFR 1在HUVECs表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论: 重组pEGFP-N1/TNFR 1融合表达载体在HUVECs中获得了表达,融合蛋白具有TNFR 1和绿色荧光蛋白(GFP)的双重活性,为进一步研究TNFR 1转位的调控因素打下基础。     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用

目的:克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒, 初步探讨其表达产物sST2-Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响.方法:借助RT-PCR技术, 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA, 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体(psST2-Fc).应用脂质体将重组质粒psST2-Fc转染CHO细胞, 经G418筛选, 获得稳定表达sST2-Fc融合蛋白的CHO细胞株.细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后, 采用Western blot进行鉴定, 应用FACS检测sST2-Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况;ELISA法检测sST2-Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响.结果:测序证实克隆和构建的小鼠sST2-Fc cDNA阅读框序列正确, Western blot 证实sST2-Fc融合蛋白的表达, sST2-Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-6.结论:成功构建sST2-Fc融合基因并获得稳定表达, sST2-Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应.     

小鼠趋化因子COL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列，经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3．1-CCL19Ig，酶切和测序鉴定插入序列；将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达，通过RT—PCR、Western blot鉴定目的基因的表达，利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgGI Fc段序列，其序列分别与GenBank中公布序列比对一致，IgG1-Fc段读码框未发生改变；Western blot结果证实转染了pcDNA3．1-mCEL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38000的融合蛋白mCCL19Ig表达；体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性，且呈剂量依耐关系。     

hdll1~(ext)-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 :构建人dll1ext(humandelta like1extracellularregion) Fc融合蛋白的真核表达载体pEF BOSneo hdll1ext Fc,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta like1胞外段 ,通过DNA重组构建真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。瞬时转染COS 7细胞 ,应用RT PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA ,检测融合蛋白的表达。结果 :成功地构建了真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。以重组载体转染COS 7细胞后 ,RT PCR结果显示delta like1胞外段与IgG1Fc在mRNA水平正确拼接 ;细胞免疫荧光染色呈阳性反应 ;夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论 :成功地扩增了人delta like1胞外段 ,构建了 pEF BOSneo hdll1ext Fc真核表达载体 ,并在COS 7细胞中获得表达 ,为下一步研究奠定了基础     

人TACI-Fc融合蛋白对XG6细胞体外生长的调节作用

目的 建立人TACI-Fc基因转染细胞，获得该融合蛋白，研究其对多发性骨髓瘤细胞系XG6的生物学作用。方法利用RT-PCR方法从扁桃体细胞中克隆全长TACI cDNA片段，将该基因的胞外段sTACI与人IgGI Fc段连接到pcDNA真核表达载体上，使两者融合表达。脂质体法将重组质粒pcDNA-sTACI-Fc转入小鼠成纤维细胞系L929-ELISA法测定转染TACI-Fc基因的L929细胞培养上清中TACI-Fc的含量，培养上清经亲和层析柱纯化，获得纯化的融合蛋白TACI-Fc。然后应用台盼蓝染色活细胞计数和^3H-TdR掺入法检测其对XG6细胞的生长和增殖的调节作用。结果经RT-PCR和ELISA方法检测表明，成功构建了稳定表达sTACI-Fc融合蛋白的基因转染细胞。基因转染细胞的培养上清经亲和层析柱纯化，得到TACI-Fc融合蛋白。体外检测其生物学活性结果表明，该融合蛋白可有效地阻断Blys对骨髓瘤细胞株XG6的促增殖作用。结论本实验成功地将TACI胞外段与人IgG1 Fc段在真核细胞中进行融合表达，表达的蛋白质具有良好的生物学功能，这为进一步对TACI基因进行功能研究奠定了物质基础。     

人源性促甲状腺激素受体单链抗体Fc 融合蛋白的制备及鉴定

目的:构建含有促甲状腺激素受体抗体(TRAb)单链抗体的重组载体pFastBac~(TM)1-ScFv-IgG1Fc,通过Bac-to-Bac表达系统实现单链抗体融合蛋白的高效表达,并检测目的蛋白表达和免疫学活性。方法:TRAb抗体的重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的序列以linker(G4S)连接,构建ScFv;Genbank检索人IgG1Fc序列,SnapGene软件分析上述序列和载体pFastBac~(TM)1,以基因合成方式构建重组质粒pFastBac~(TM)1-ScFv-IgG1Fc;pFastBac~(TM)1-ScFv-IgG1Fc转化感受态大肠杆菌DH10Bac生成重组杆粒,pUC/M13正向和反向引物进行PCR分析确认目的基因的序列;重组杆粒采用Cellfectin?Ⅱ试剂转染昆虫细胞Sf9生成P1病毒储液,继续感染Sf9生成高滴度的P2和P3病毒储液;P3病毒储液感染High Five~(TM)细胞,收集上清通过SPA-Sepharose CL-4B亲和层析纯化获得较纯的单链抗体融合蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白;化学发光和免疫组化检测目的蛋白抗原结合力。结果:PCR扩增得到约3 747 bp的基因序列,重组杆粒中目的基因正确插入;目的蛋白位于55 kDa附近且无杂带,纯度较高;目的蛋白浓度为248 U/L,单链抗体融合蛋白的结合力较好。结论:Bac-to-Bac表达系统成功构建并表达了TRAb单链抗体融合蛋白,抗原亲和力良好。     

CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究

目的 构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国地仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovurm,CHO）中功能性表达,寻找消除白血病细胞免疫逃逸的有效方法.方法 采用定向分子克隆技术将小鼠CD80胞外段和IgG1 Fc段的cDNA串联至真核表达载体pcDNA3.0中,运用脂质体将所得的重组子转染CHO细胞,经免疫印迹、斑点ELISA检测其表达,免疫亲和层析法纯化其表达产物,用流式细胞术、MTT比色法及ELISA在体外检测该产物的生物学活性.结果 两段目的基因按预期设想克隆入空载体中并得到了表达,亲和层析纯化获得了高纯度目的蛋白,该蛋白能够将白血病细胞表面CD80分子密度提高5倍,并可显著增强同种异体小鼠淋巴细胞的增殖、对白血病细胞的杀伤以及Ⅱ-2的分泌.结论 成功构建了融合基因真核表达载体,其表达产物在体外具有相应的生物学功能,有希望成为消除白血病细胞免疫逃逸的有力工具.     

CD80-IgG1 Fc融合蛋白修饰的HepG2细胞对淋巴细胞抗肿瘤免疫的影响

目的：探讨CD80-IgG1 Fc段融合蛋白修饰的HepG2细胞对淋巴细胞抗肿瘤免疫的影响。方法：应用福建省临床免疫研究所构建的CD80-IgG1 Fc段融合蛋白，修饰肝癌细胞株HepG2细胞，用流式细胞术检测修饰的HepG2细胞上CD80的表达。将修饰的HepG2细胞与健康人外周血淋巴细胞混合后进行培养，分别应用MTT比色法、乳酸脱氢酶释放试验；检测经CD80-IgG1 Fc段融合蛋白修饰的HepG2细胞对外周血淋巴细胞增殖及其细胞毒性的影响。结果：CD80-IgG1Fc段融合蛋白可有效地结合于HepG2细胞膜上，结合的量在一定范围内与融合蛋白的浓度呈正相关（P＜0．05）。融合蛋白修饰的HepG2细胞可明显刺激外周血淋巴细胞活化增殖并增强CTL的细胞毒活性（P＜0．05）。结论：CD80在抗肿瘤免疫中起着重要作用，用CD80-IgG1Fc段融合蛋白修饰的HepG2肿瘤细胞能明显增强淋巴细胞的特异性抗肿瘤免疫，为CD80用于肿瘤免疫治疗的研究提供了实验依据.     

融合蛋白mTSLPR-Ig的表达、纯化及其鉴定

目的:构建含小鼠TSLPR胞外段与小鼠Ig Fc段融合基因的腺病毒表达载体(Ad-mTSLPR-Ig),体外表达、纯化并鉴定可溶性融合蛋白mTSLPR-Ig。方法:运用PCR方法从小鼠胸腺cDNA文库中扩增mTSLPR胞外段基因,构建并鉴定mTSLPR胞外段与小鼠Ig Fc段融合基因的腺病毒表达载体(Ad-mTSLPR-Ig);将Ad-TSLPR-mIg转染COS-7细胞,收集细胞上清液;采用双抗体ELISA夹心法检测上清中融合蛋白表达;经蛋白A亲和层析,制备纯化可溶性融合蛋白mTSL-PR-Ig。结果:经测序证实,所构建表达载体的目的基因片段mTSLPR-Ig序列正确,成功包装出腺病毒表达载体Ad-mTSL-PR-Ig;ELISA法检测到上清中融合蛋白mTSLPR-Ig的表达;通过亲和层析法获得纯化的融合蛋白,经Western blot鉴定融合蛋白表达无误。结论:成功获得可溶性融合蛋白mTSLPR-Ig,为进一步研究其生物学特性奠定基础。     

人可溶性TNF受体(sTNFRI)在大肠杆菌中的表达及其活性鉴定

目的 :构建人可溶性TNF受体I(sTNFRI)基因表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达。方法 :用RT PCR扩增编码人TNFRI胞外段基因片段 ,将其插入到表达载体pET 2 8a ,并转入大肠杆菌进行表达。结果 :在IPTG诱导下 ,转入外源基因的大肠杆菌BL 2 1可高效表达sTNFRI蛋白 ,SDS PAGE显示在 2 7kD处有一特异表达条带 ,其表达量占菌体蛋白总量的 31%。纯化的sTNFRI可有效封闭TNF对L92 9细胞的胞毒效应 ;间接免疫荧光显示它可特异性抑制TNF与靶细胞TNFR的结合。结论 :通过基因工程技术获得了人sTNFRI重组蛋白。