肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY的克隆表达与多克隆抗体的制备

目的: 克隆表达伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY并制备多克隆抗体。 方法: 通过PCR技术从伤寒沙门菌基因组DNA中获得伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY,再将此基因片段克隆到表达载体pET22b(+)上,并转入大肠埃希菌JM109进行表达;Ni柱纯化后的OsmY蛋白作为抗原免疫家兔,并获得多克隆抗体。 结果: 成功制备伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY的蛋白表达菌株,并获得了纯化的OsmY蛋白,成功制备兔抗OsmY的多克隆抗体。 结论： 成功克隆表达了伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY,并获得了多克隆抗体,有助于今后研究OsmY在伤寒沙门菌高渗应激中的作用。     

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

摘要：目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希
菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗
体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37 000;
Western blot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。
结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST的构建及其表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28a-Sj26GST,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET28a中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为36×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的26%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28d-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

重组鼠IL-28的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的: 获取重组鼠IL-28(mIL-28)纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法: 用PCR技术扩增鼠IL-28成熟蛋白的编码序列,克隆入原核表达载体pET-30,构建融合表达载体pET-30a-mIL-28,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达IL-28融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后免疫6～8周龄鸡,制备多克隆抗体,采用ELISA 检测抗体效价.结果: 成功构建了表达载体pET-30a-mIL-28,DNA序列测定结果与预期结果一致.在37℃培养条件下,IPTG诱导表达的IL-28融合蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,发现其与融合蛋白的理论计算值一致,免疫鸡后收获抗血清, ELISA 显示抗体效价具有高度特异性.结论: 获得了重组鼠IL-28纯化蛋白,制备了鼠IL-28多克隆抗体,为进一步深入研究IL-28的生物活性及其应用打下基础.     

阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子的原核表达及多克隆抗体制备

目的: 原核表达阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor of Trichomonas vaginalis,TvMIF）并制备多克隆抗体。方法: 采用PCR技术扩增TvMIF基因,并克隆至pTG19 T载体,酶切及测序鉴定后,再定向插入pET 30a(+)载体。将重组载体转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导蛋白表达。采用镍柱亲和层析法纯化TvMIF蛋白,并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,蛋白质印迹法检测多克隆抗体。结果： 从阴道毛滴虫cDNA中扩增出TvMIF基因片段,测序结果与基因库收录序列一致。成功构建pET 30a TvMIF重组质粒,重组TvMIF蛋白约为15.5 kDa,以可溶性蛋白形式存在。获得TvMIF重组蛋白的多克隆抗体,蛋白印迹法检出TvMIF的特异性条带。 结论： 成功获得阴道毛滴虫MIF蛋白并制备了多克隆抗体,可用于后续研究阴道毛滴虫致病机制。     

重组人脂联素融合蛋白在大肠埃希菌BL21中的表达

目的在大肠埃希菌BL21中对构建的重组人脂联素质粒pET－32a（＋）／AP进行诱导表达,并对产物进行纯化、鉴定。方法将pET－32a（＋）质粒和重组pET－32a（＋）／AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,建立表达体系,筛选高表达的克隆子,用不同诱导时间和不同异丙基．p—D．硫代半乳糖苷诱导浓度确定最佳诱导条件,用Ni抖金属层析柱进行蛋白亲和层析,对纯化蛋白进行浓缩,蛋白质印迹鉴定所诱导的蛋白。结果得到分子量为43kD的新生蛋白,经蛋白质印迹鉴定为重组脂联素融合蛋白。结论将重组pET－32a（＋）／AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中,建立表达体系,且获得高效表达。     

人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备人磷酯酰蛋白聚糖3（Glypican3,GPC3）N端蛋白的多克隆抗体。方法：在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白,从SDS-PAGE中切胶纯化,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用ELISA、Westen-blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功制备了抗磷酯酰蛋白聚糖3N端的多克隆抗体,抗体滴度为1：64000,经Western blot检测特异性良好。结论：成功制备了抗人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体。     

重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。     

甲基CpG结合域四聚体蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 在大肠埃希菌中表达甲基CpG结合域四聚体蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法 将重组表达质粒4×MBD-pET30b+转化大肠埃希菌DH5a克隆扩增并测序鉴定后,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后接种于LB 培养基中,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达, 表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达,用此蛋白免疫染色人胚肾细胞后用荧光显微镜观察。结果 克隆质粒测序结果与理论预期完全一致,SDS-PAGE显示在大肠埃希菌中表达出相对分子量为46 000的目标蛋白,Western blot显示目标蛋白带有His融合标签（氨基端）和HA标签（羧基端）。荧光显微镜观察显示MBD蛋白能与细胞内的甲基化CpG基序特异性结合。结论 成功表达并纯化了具有免疫原性的甲基CpG结合域四聚体蛋白,为今后进一步研究DNA甲基化奠定了基础。     

PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白的原核表达、纯化与鉴定

目的构建抗菌肽-23与3型碳水化合物结合分子（CBM3）融合蛋白的原核表达载体并进行诱导表达、纯化和鉴定。方法PCR扩增PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,产物经酶切、纯化、回收后与经同样双酶切并回收后的pET21a原核表达载体相连接,连接产物转化感受态DH5α菌,经菌落PCR筛选出阳性菌落并提取质粒进行初步酶切鉴定后进一步行双向测序鉴定,插入序列完全正确者命名为pET21a-PMAP-23-LK-CBM3重组载体,并将其转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3）,加入IPTG诱导PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白表达后提取菌体蛋白行亲和层析纯化,并对纯化产物进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot鉴定。结果成功构建了pET21a-PMAP-23-LK-CBM3融合重组质粒,成功诱导、纯化并鉴定出PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,分子量与理论值相符。结论成功表达并纯化、鉴定出了PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,为进一步将其应用于抗菌机制和药理实验的研究奠定了基础。     

粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达

目的:克隆和表达日本血吸虫SJCHGC02377蛋白。方法:采用RT-PCR从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出编码SJCHGC02377蛋白的基因片段;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23 a(+),转化大肠埃希菌BL21,菌落PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导表达SJCHGC02377蛋白部分片段,亲和层析予以纯化。结果:RT-PCR扩增出SJCH-GC02377蛋白基因片段;获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的基因序列一致;SJCH-GC02377蛋白基因被亚克隆到原核表达载体pET-23 a(+),在BL21中获得了表达,表达的蛋白经亲和层析获得纯化。结论:成功构建了日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的重组表达质粒,在大肠埃希菌中获得表达。     

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法　将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果　成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论　GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。