荧光染料CFSE作为细胞标记的特性研究

探讨荧光染料CFSE在作为细胞标记时的特性。方法 :应用激光共聚焦扫描显微术 ,观察CFSE在细胞中的准确定位。利用MTT比色法测定CFSE标记的细胞及未标记细胞的增殖情况 ;通过细胞计数和流式细胞仪 (FCM) ,测定细胞在不加任何刺激及诱导的情况下细胞数及平均荧光强度的变化趋势。结果 :在共聚焦显微镜下 ,可见CFSE标记的细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中都带有绿色荧光 ,以胞核荧光最强。利用MTT比色法测定标记及未标记细胞的A值无显著差异。连续 6d记录的细胞数与FCM测定的平均荧光强度呈负相关。结论 :CFSE可作为细胞的标记物 ,用于细胞移植的体内检测、细胞增殖试验及细胞分裂周期的估算等研究     

制备复合生长因子的缓释微球并考察其对细胞的影响

目的:制备复合碱性成纤维细胞生长因子的可降解缓释微球,考察其生物活性保存情况,以及其对上皮细胞的作用.方法:采用改良的乳化冷凝法交联制备明胶缓释微球,将其加入上皮细胞的培养液中,用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)测定细胞增殖情况.结果:缓释微球平均粒径(12.36±3.56)μm;培养1 d后各组细胞计数、吸光度(A)值差异均无显著性意义;5 d后,缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于对照组;7 d后,缓释微球组值仍高于其它组,但差异无显著性意义.结论:复合生长因子的缓释微球制备工艺简便,成球性好;能较长时间持续释放活性生长因子,明显促进细胞增殖.     

测定淋巴细胞增殖的MTS和XTT比色法的建立

目的建立用新型四唑氮盐MTS和XTT做比色分析测定淋巴细胞增殖效应的方法.方法分别用MTS、XTT结合PMS,对小鼠脾淋巴细胞密度和增殖进行比色测定,选择最佳实验条件,并将这两种方法与3H-TdR掺入法和MTT法比较.结果用MTS和XTT比色分析法测定小鼠脾淋巴细胞的增殖,在0.5～4×109/L的范围内,所获光吸收(A)值与细胞密度呈良好的相关性.最佳细胞密度为2×109/L,最佳反应时间为6h,最佳PMS的终浓度为1×10-4mol/L.两种比色法与3H-TdR掺入法的结果相一致,且两种新方法较MTT法灵敏.结论MTS和XTT比色分析法可代替3H-TdR掺入法和MTT法,用于测定淋巴细胞的增殖效应.     

两种体外细胞毒性检测方法的比较研究

目的比较两种常用的细胞毒性检测方法在医疗器械生物学评价中的相关性.方法分别采用MTT比色法和细胞增殖度法,在37℃条件下,将五种医疗器械/生物材料的浸提液分别与小鼠成纤维细胞(L-929)接触2天和2,4,7天,比较材料对细胞的毒性影响.结果 5种不同的材料浸提液分别表现出不同程度的细胞毒性反应(0～2级).将MTT比色法与细胞增殖度法(2天)的实验数据进行相关性分析,显示两者之间具有良好的相关性(R=0.977).结论 MTT比色法由于其检测所需的细胞量相对较少,试验步骤相对简便、检测周期短,因此具有一定的优越性,是个值得推荐的细胞毒性检测方法.     

人超氧化物歧化酶用于细胞毒活性的检测

为了探讨人超氧化物歧化酶(SOD)值测定,作为一种新的细胞毒活性的检测方法及其临床应用的可行性,本文对含有不同细胞数的正常人外周血单个核细胞,反复冻融后,用放免方法(RIA)测定上清中的SOD值,观察四组不同浓度细胞数量与所测SOD值的相关性.测定20份标本SOD值均值±标准差分别为:细胞数为4×106组:SOD值为490±26.3ng/mL;2×106组;249±20.8ng/mL;1×106组:132.55±13.03ng/mL;5×105组:102.65±48.5ng/mL.四组细胞数与SOD均值的相关系数为0.91,绘制散点图,发现5×105组的均值偏离另三组的直线趋势,予以去除后,剩余的三组的相关系数为1.03,呈现完全相关.结果显示:SOD值在同一类型细胞中的含量相对恒定,在个体间一致性较高;SOD值与单个核细胞量存在直线相关性,提示这个参数可用于了解某类细胞被破坏的情况.值得注意的是,在细胞浓度较低时,SOD值可能会存在误差,建议实验时标本的细胞数宜控制在1×106以上.     

复合bFGF缓释微球的制备及其对成纤维细胞增殖作用的实验研究

制备复合碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)可降解缓释微球 ,考察其生物活性的保存情况 ,以及它对成纤维细胞的作用。采用改良的乳化冷凝法交联制备复合bFGF的明胶缓释微球 ,将它加入成纤维细胞的培养液中 ,用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法 (MTT法 )测定细胞增殖情况。结果表明 ,复合bFGF的缓释微球平均粒径 12 .36± 3.5 6 μm ;培养 1d后各组细胞计数、吸光度 (A)值差异均无显著性 ;5d后 ,缓释微球组细胞计数、吸光度 (A)值明显高于对照组 ;7d后 ,缓释微球组值仍高于其它组 ,但差异无显著性。复合bFGF的缓释微球制备工艺简便 ,成球性好 ;能较长时间地持续释放活性bFGF ,明显促进成纤维细胞的增殖。     

结晶紫蚀斑法检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度方法的建立

目的 建立重组天坛株痘苗病毒(rTV)艾滋病疫苗的结晶紫蚀斑病毒滴度检测方法,为rTV艾滋病疫苗病毒滴度测定提供更稳定的方法.方法 通过对Vero细胞浓度、病毒吸附时间及温度、病变判定时间等方面进行优化,建立rTV艾滋病疫苗病毒滴度的结晶紫蚀斑检测方法,并应用BioSpot Reader进行蚀斑计数及分析,比对仪器蚀斑计数和人工蚀斑计数的相关性;应用血球吸附法、中性红蚀斑、结晶紫蚀斑3种方法,对多批rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒滴度进行检定,进行3种方法的相关性分析;采用结晶紫蚀斑法重复测定样品,计算变异系数(CV),对方法的精密性进行验证;采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析.结果 确定Vero细胞浓度为5.0×105 ～9.0×105个/ml时,病毒37℃吸附2h后加入含甲基纤维素的维持液,培养72 h,应用BioSpot Reader进行蚀斑计数,与人工计数的相关系数r=0.985,能客观反映不同大小的病毒蚀斑,降低了人工计数引起的非客观因素误差;经过3种方法对不同批次的rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒进行病毒滴度检定,结晶紫蚀斑与血吸附法的相关系数r=0.997,结晶紫蚀斑法与中性红蚀斑法相关系数r=0.980 (P＜0.01),具有高度相关性.结论 建立了可用于rTV艾滋病疫苗病毒滴度检测的结晶紫蚀斑方法.     

雌激素减轻β-淀粉样蛋白25-35所致的PC12细胞毒活性

目的：观察17-β雌激素对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)所致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)毒活性的影响。方法：PC12细胞暴露于不同浓度的Aβ25-35或Aβ25-35加17-β雌激素，观察PC12细胞的细胞计数，四甲基偶氮唑蓝(MTT)代谢率与乳酸脱氢酶(LDH)释放率。结果：Aβ25-35引起PC12细胞计数及MTT代谢率减少，LDH释放率升高，且有剂量依赖性；而17-β雌激素可提高相应的细胞计数及MTT代谢率，降低相应的LDH释放率。结论：17-β雌激素具有拮抗Aβ25-35所致PC12细胞毒性的作用。     

EGFR单克隆抗体抗结肠癌作用的实验研究

目的:观察表皮生长因子受体单克隆抗体(EGFRMcAb)对结肠癌的作用。方法:用不同剂量的EGFRMcAb处理LST174结肠癌细胞系, 采用细胞计数、生长曲线测定及MTT法测定体外培养细胞的生长和增殖抑制率。结果:可见一定程度的增殖抑制并呈剂量依赖性。抗-EGFR抗体组细胞数明显低于对照组(P<0.01).不同浓度之间比较:当EGFRMcAb为0.625mL/L时细胞计数相对高, 是对照组的61.3%;当EGFRMcAb为2.5mL/L时细胞计数最低, 是对照组的33.8%.EGFRMcAb组细胞生长受到抑制, 细胞生长曲线较对照组速度减慢。MTT值显示实验组细胞增殖能力低于对照组, 抑制率为42.3%(P<0.01).结论:EGFRMcAb可抑制人结肠癌LST174细胞生长, 具有一定的抗结肠癌作用。     

羧基荧光素乙酰乙酸与四甲基偶氮唑盐法检测人脐血间充质干细胞刺激脾淋巴细胞增殖作用的比较

目的 比较羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)与四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测人脐血间充质干细胞(CB-MSCs)和神经分化的CB-MSCs对大鼠脾淋巴细胞(LCs)刺激作用的敏感程度. 方法 分别制备刺激细胞和LCs,将刺激细胞分为4组:1. CB-MSCs组;2. Dif-CB-HSCs组:脐血间充质干细胞培养7d后维甲酸(RA)处理4d诱导其神经分化细胞;3. SH-SY5Y组:人源SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞系)作为阳性对照组;4. Auto-LC组:自体大鼠LCs作为阴性对照组.分别将上述各组刺激细胞与LCs进行混合培养,分别通过酶标仪(MTT法),流式细胞术(CFSE法)检测LCs增殖情况( n =3). 结果 CFSE法和MTT法检测结果 均显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组刺激LCs增殖明显弱于阳性对照组(SH-SY5Y细胞组),但CFSE法检测结果 显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组细胞刺激LCs增殖百分率高于阴性对照Auto-LC组,MTT法检测结果 显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组的吸光度( A )值稍低于阴性对照Auto-LC组. 结论 CFSE法比MTT法能更加客观地反映淋巴细胞增殖情况,在实际应用中更具有优势.     

Aβ_(42)蛋白与胶质细胞吞噬相关受体相互作用的研究

目的探讨寡聚形态Aβ_(42)蛋白与胶质细胞吞噬相关受体SRB、CD36的体外结合情况,以及上述受体封闭状态下或内吞抑制剂存在条件下该细胞吞入Aβ_(42)数量的变化规律。查明富寡聚物Aβ_(42)(o Aβ_(42))环境对小胶质细胞的吞噬相关受体SRB、CD36、TNF-α、TNF-R基因表达量的影响。方法用酶联免疫法测定o Aβ_(42)与胶质细胞SRB、CD36受体的结合力。用SRB、CD36受体的功能性抗体,受体内吞(巨吞饮)抑制剂作用细胞,检测BV2细胞对o Aβ_(42)吞噬能力的变化,反转录法测定o Aβ_(42)影响下的BV2小胶质细胞吞噬相关基因表达量变化。结果 o Aβ_(42)与胶质细胞清道夫家族SRB、CD36受体在体外实验中特异性结合,SRB受体的阻断使小胶质细胞内吞o Aβ_(42)的能力显著下降,CD36受体阻断剂对细胞内吞量无显著影响,受体内吞(巨吞饮)抑制剂增加细胞对o Aβ_(42)摄取的量。o Aβ_(42)对人脑小胶质细胞吞噬相关受体的表达量有显著影响。结论 o Aβ_(42)与胶质细胞吞噬相关受体的相互作用可进一步影响细胞对病理蛋白的吞入和清除过程。该结论可为从分子水平调节胶质细胞与Aβ_(42)相互作用的受体激活剂,基因封闭剂等AD免疫疗法提供参考依据。     

肾上腺髓质素抑制肺动脉平滑肌细胞低氧性增殖

目的观察肾上腺髓质素（AM）对肺动脉平滑肌细胞低氧性增殖的影响。方法体外培养猪的肺动脉平滑肌细胞，采用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定其增殖反应。结果低氧+AM组MTT比色法平均吸光度（A值）为0.394±0.025,显著低于缺氧组的0.514±0.035(P＜0.01)，PCNA表达减少，图像分析平均吸光度（A值）为0.168±0.049，显著低于低氧组的0.307±0.078（P＜0.01）。结论肾上腺髓质素能抑制低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖，提示AM在肺动脉高压的发生发展中起一定的保护作用。     

全自动血细胞分析仪体液模式与手工法对胸腹腔积液细胞计数及分类的结果比较

目的 与手工法对比,评价迈瑞BC-6900全自动血细胞分析仪体液模式对胸腹腔积液细胞计数及分类的准确性.方法 收集2017年7月至2018年3月某肿瘤专科医院患者胸腹腔积液标本112例.应用全自动血细胞分析仪体液模式(仪器法)与改良牛鲍计数板(手工法)进行红细胞、有核细胞计数及分类,观察两种方法的计数结果的相关性和偏差.结果 无论血性或非血性胸腹腔积液标本,红细胞(RBC-BF)手工法与仪器法计数均有较强的相关性(rs分别为0.989、0.973).与手工法比较,血性标本红细胞仪器法计数较非血性标本一致性好,偏差分别为-8.9％～27.6％、-27.6％～25.3％.有核细胞总数≤100×106/L时,有核细胞(TC-BF)、单个核细胞(MN)、多个核细胞(PMN)仪器法与手工法计数相关性(rs分别为0.704、0.792、0.761),低于计数>100×106/L区间内的相关性(rs分别为0.958、0.930、0.925);两个区间内三者仪器法与手工法计数的最大相对负偏差分别为-60％～-42.3％、-25.2％～-22.1％,最大正偏差分别为41.1％～54.5％、28.7％～29.7％.结论 迈瑞BC-6900全自动血细胞分析仪体液模式红细胞计数和在有核细胞数>100×106/L时的TC-BF、MN、P MN计数与手工法比较具有良好的一致性.     

NAG微量酶反应比色法在IL-2活性检测中的应用

本文研究了NAG微量酶反应比色法在IL-2活性检测中的应用,结果表明IL-2活性测定所用的CTLL-2细胞浓度与OD值呈直线关系(r=0.964715)。本文还探讨了NAG法在IL-2活性测定中CTLL-2细胞浓度,培养时间对检测效果的影响。本法与~3H—TdR掺入法和MTT法相比有较好的一致性。     

IL-2对培养的人垂体腺瘤细胞增殖的影响及其机制

目的:研究IL-2对人垂体腺瘤细胞的增殖、细胞周期、细胞内蛋白激酶C(PKC)及cAMP/cGMP的影响,并探讨其作用的机制。方法:采用MTT比色法和3H-TdR掺入法检测IL-2对人垂体腺瘤细胞增殖和DNA合成的影响;用流式细胞术检测IL-2对垂体腺瘤细胞细胞周期的影响。用放射免疫测定法检测PKC的活性及cAMP和cGMP的含量。结果:(1)IL-2可促进垂体腺瘤细胞增殖和DNA合成,且呈剂量依赖性。(2)IL-2可显著降低垂体腺瘤细胞G1期的细胞比率,而增加S期和G2期的细胞比率。(3)与空白处理组相比较,使用PKC的激动剂PMA处理培养的人垂体腺瘤细胞,可使胞膜和细胞总PKC升高;而用IL-2(1×105U/L)处理后,胞质、胞膜和细胞总PKC的活性均升高。(4)IL-2(5×104、1×105U/L)作用于人垂体腺瘤细胞后,胞内cAMP浓度显著降低;而cGMP的浓度没有明显改变。结论:IL-2对垂体腺瘤细胞增殖分化的调控作用是细胞内多信息系统相互整合的结果。     

食管癌放射抗拒与P-gp、HER-2及microRNA-296表达的相关性

目的: 探讨P-糖蛋白(P-gp)、人表皮生长因子受体2(HER-2)及microRNA-296的表达与食管癌放射抗拒的相关性。方法: 将人食管癌细胞Eca109分为对照组和处理组,处理组通过X射线反复照射(累计放射剂量60 Gy),采用MTT法检测2组细胞的增殖抑制率。免疫细胞化学法测定P-gp和HER-2的表达。Northern blotting法测定microRNA-296的表达。结果: 处理组细胞较对照组显示出明显的放射抗性,增殖抑制率明显低于对照组细胞。免疫细胞化学测定P-gp和HER-2在处理组中较对照组表达显著增加。2组细胞中microRNA-296表达无显著差异。结论: P-gp、HER-2可能与食管癌放射抗拒有关;暂不能说明microRNA-296与食管癌细胞Eca109放射抗拒具有相关性。     

中药复方补肾活血液对成骨细胞影响的实验研究

目的:观察中药复方补肾活血液对体外培养新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化的影响。方法:采用二次酶消化法从新生SD大鼠颅骨获取成骨细胞进行培养, 取第3代成骨细胞为实验模型, 将其分为4组, 在各组中分别加入双蒸馏水(对照组), 低(20mg/L)、中(40mg/L)、高(80mg/L)浓度的补肾活血中药提取液。用MTT法(波长570nm处A值表示)测定细胞增殖功能;用对硝基苯基磷酸二钠(PNPP)法测定碱性磷酸酶(ALP)活性;用放免分析方法测定细胞培养液中的骨钙素(BGP)含量;用茜素红染色法, 在40倍光镜下作矿化结节计数。结果:中药中、高浓度组的A值在24h、48h、72h时明显高于对照组(P＜0.01), 且与药物浓度呈剂量依赖性;低浓度组的A值在72h时点明显高于对照组(P＜0.05), 在24h、48h时点与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。不同浓度给药组培养48h、72h、96h后, ALP(除低浓度组培养48h外)、BGP均呈不同程度增加(P＜0.01)。在中、高浓度组矿化结节数量/视野, 显著多于对照组(P＜0.01), 低浓度组与对照组比较无显著差异(P＞0.05)。结论:补肾活血液具有促进体外培养的新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化作用, 这种作用呈剂量相关性。     

氢硫酸钠抑制脂多糖引起的A549细胞损伤

目的观察氢硫酸钠(Na HS)对脂多糖(LPS)诱导的A549肺癌细胞损伤的影响并探讨其可能机制。方法 A549细胞分为对照组、LPS处理组、Na HS处理组和LPS联合Na HS处理组。处理24 h后,采用ELISA测定培养液中C反应蛋白(CRP)的含量;MTT法与乳酸脱氢酶(LDH)法测定细胞损伤情况;测定A549细胞单层模型的跨上皮电阻(TER)值;免疫荧光染色法测定A549细胞中闭锁小带蛋白1(ZO-1)的分布情况。结果对照组与Na HS处理组比较,CRP的水平、TER值、细胞活力和ZO-1表达与分布情况无显著性差异;与对照组相比,LPS处理组中的CRP水平明显升高、TER值显著减少、细胞活力下降、细胞膜ZO-1表达减少且边界不清;与LPS处理组相比,LPS联合Na HS处理组中的CRP水平明显降低、TER值增加、细胞活力增加,ZO-1在细胞膜处的表达增强且分布情况部分恢复。结论 Na HS通过增强A549细胞活力、降低CRP水平、增加TER值并增加ZO-1表达抑制LPS诱导的肺损伤。     

人羊膜间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖并减少γ干扰素的分泌

目的观察人羊膜间充质干细胞(hAMSC)对体外培养的淋巴细胞功能的影响。方法通过酶消化法分离培养hAMSC,采用荧光团标记的小鼠抗人单克隆抗体结合流式细胞术鉴定细胞表面抗原;免疫荧光染色检测培养细胞波形蛋白(vimentin)和阶段特异表达抗原4(SSEA-4)的表达;分离培养hAMSC和外周血单个核细胞(PBMC),将刀豆蛋白(ConA)刺激的淋巴细胞与1×104、5×104、1×105个hAMSC进行共培养。CCK-8法测定淋巴细胞增殖,ELISA测定细胞上清液中IFN-γ的水平。结果5μg/mLConA能够引起淋巴细胞增殖;共培养条件下,hAMSC能够抑制ConA引起的淋巴细胞增殖,且随着hAMSC的数量增加,抑制效果更明显。培养72h后,CCK-8法结果表明,单纯ConA刺激后淋巴细胞数显著高于共培养细胞。选择抑制效果最佳的组别1×106个淋巴细胞与1×105个hAMSC共培养,ELISA测定1×105个hAMSC对淋巴细胞抑制72h后,上清液中IFN-γ分泌,共培养细胞上清液中IFN-γ水平显著低于单纯ConA刺激细胞。结论hAMSC能在体外抑制ConA引起的淋巴细胞增殖并减少IFN-γ分泌。     

Genistein对大鼠基底前脑胆碱能神经元发育影响的体外研究

本文旨在研究染料木素(genistein)对体外培养的基底前脑胆碱能神经元发育的影响。取孕18d胎鼠基底前脑神经元,体外有血清培养7d后,随机分为3组:无血清培养液组(control组),genistein+无血清培养液组(G组)、E2+无血清培养液组(E2组)。48h后用MTT法测定细胞活力和代谢状态;用AChE组化染色以及ChAT和MAP2免疫荧光双重染色,镜下计数AChE阳性和ChAT阳性神经元数,并对两种神经元的细胞面积、第一级突起数及最长突起长度进行检测。结果显示:MTT法所测的OD值、AChE阳性和ChAT阳性神经元数、细胞面积、第一级突起数及最长突起长度在G组与control组之间无明显差异,然而E2组中的上述数值均明显增加。本研究的结果提示:genistein对体外培养的基底前脑胆碱能神经元无类似雌激素样的神经保护和营养作用。