丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的PBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3。以pcDNA3．1(-)-NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术(bioinformatics)，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因，命名为NS3TP6，新基因的编码基因序列全长为414个核苷酸(nt)，编码产物由138个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，并成功克隆其中的NS3TP6，为阐明HcvNs3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

应用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒HBsAg基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因表达谱芯片技术研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响.方法设计并合成HBsAg主蛋白基因序列特异性的引物,以含有HBV全基因组的质粒G376 A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HBsAg蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达栽体pcDNA3.1(-)-HBsAg.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,29个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了HBsAg转染细胞后差异表达的基因,为深入研究HBsAg可能的生物学功能提供依据.     

丙型肝炎病毒核心蛋白、Bcl-2、P21Waf1在丙型肝炎中的表达及相互关系

目的　调查丙型肝炎、肝硬化病人组织中的丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白、P2 1、Bcl 2的表达以及相互间关系 ,探讨HCV核心蛋白是否抑制P2 1和促进Bcl 2表达。方法　收集 2 3例HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织 ,采用免疫组化Envision法检测核心蛋白、P2 1、Bcl 2表达 ,并用统计学方法分析三者间的表达关系。结果　HCV核心蛋白和突变P2 1的阳性表达主要位于细胞核中 ,Bcl 2的阳性表达主要位于细胞质 ;HCV核心蛋白表达阳性组织中 ,P2 1阳性表达率仅 13 % ,Bcl 2阳性表达率则达 95 .7% ,三组间比较差异有显著性 (P =0 .0 12 )。HCV核心蛋白和Bcl 2二组间比较差异无显著性 (P =0 .5 61) ;HCV核心蛋白与Bcl 2、p2 1阳性强度两者间P值分别为 0 .0 12和 0 .2。结论　三种蛋白的表达有相关性 ,HCV核心蛋白可能促进Bcl 2蛋白的表达 ,抑制P2 1蛋白表达     

一种用于HCV核心蛋白体外表达研究的CHO细胞模型的建立

目的:建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白体外表达的非肝细胞模型.方法:核酸酶切法鉴定含有HCV1b基因型C蛋白编码基因的重组质粒pCMH6K的稳定性,将pCMH6K瞬时及稳定转染于中华仓鼠卵巢(China hamster ovary,CHO)细胞并连续传代110 d,...     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功.     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

C-terminal domain of hepatitis C virus core protein is essential for secretion

AIM: We have previously demonstrated that hepatitis C virus (HCV) core protein is efficiently released into the culture medium in insect cells. The objective of this study is to characterize the HCV core secretion in insect cells. METHODS: We constructed recombinant baculoviruses expressing various-length of mutant core proteins, expressed these proteins in insect cells, and examined core protein secretion in insect cells. RESULTS: Only wild type core was efficiently released into the culture medium, although the protein expression level of wild type core was lower than those of other mutant core proteins. We found that the shorter form of the core construct expressed the higher level of protein. However, if more than 18 amino acids of the core were truncated at the C-terminus, core proteins were no longer secreted into the culture medium. Membrane flotation data show that the secreted core proteins are associated with the cellular membrane protein, indicating that HCV core is secreted as a membrane complex. CONCLUSION: The C-terminal 18 amino acids of HCV core were crucial for core secretion into the culture media. Since HCV replication occurs on lipid raft membrane structure, these results suggest that HCV may utilize a unique core release mechanism to escape immune surveillance, thereby potentially representing the feature of HCV morphogenesis.     

丙型肝炎病毒核心蛋白对肝细胞葡萄糖摄取能力的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝细胞葡萄糖摄取能力的影响.方法 表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-core通过Lipofecta- mineTM基因转染法转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞,经Western blot证实有HCV核心蛋白表达.应用放射同位素法检测表达...     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVE2蛋白反式调节相关基因。方法以HCVE2表达质粒pcDNA3.1(-)_E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCVE2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1000bp插入片段。挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中。结论应用SSH技术成功构建了HCVE2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究

目的 应用微矩阵(microauray)技术，结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因，阐明授性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌(HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVKDA反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苔酸序列分析证实正确无误。以PcDMA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总MA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5ATP13，在GenBank中登录，登录号为D21262。Ns5ATP13基因的编码序列全长为2103个核苷酸(nt)，编码产物由700个氨基酸残基(aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反式激活作用。微短阵技术是分析基因表达谱变化的自动化和高通量技术。应用这些技术，发现了HCVKDA反式激活作用的新的靶基因，将为进一步研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制及HCV相关疾病发病机制奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP1，已在GenBank中注册，注册号为AYll6969。NS3评1基因的编码序列全长为1932个核昔酸(nt)，编码产物由眺个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，HCVNS3反式激活作用的新靶基因的发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformcs)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCvNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP2，在GenBank中注册，注册号为AYll6970。NS3TP2基因的编码序列全长为1299个核苷酸(nt)，编码产物由432个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，而抑制性消减杂交(SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术，发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因，研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术，以HCV NS5A表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列数据库的搜索和比对，进行电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，命名为NS5ATP9，在GenBank中注册，注册号为AF529370。结果 Ns5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt)，编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成，并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆，为进一步研究HcvNs5A反式激活作用的分子生物学机制开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白HS5A反式激活基因HS5ATP6的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒PcDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对，进行电子拼接，根据基因起始密码子的KOZ2ak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。结果 从HePG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，命名为NS5ATP6，在GenBatk中注册，注册号为AF529367。Ns5ATP6基因的编码序列全长为1572个核苷酸(nt)，编码产物由524个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP6的筛选与克隆，为进一步研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白DNA结合区的测定

目的 阐明丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的DNA结合特性及其意义。方法 在大肠杆菌中表达谷胱甘肽转移酶（GST）融合HCV核心蛋白不同长度片段,并进行纯化。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过更换缓冲液的方法将这些蛋白片段相对固定在凝胶中,用γ－^32P[4667-0091]ATP标记人工合成的DNA进行2次电泳,通过放射自影检测核心蛋白的DNA结合区。结果 HCV核心蛋白N端第10－16位氨基酸残基和第46－70位氨基酸残基可独立地结合DNA,核心蛋白既能和单链DNA结合又能和双链DNA结合,对单双链DNA的结合域相同。对所结合的DNA序列无选择性。结论 HCV核心蛋白的N端含有两个DNA结合区,结合区序列与核内转移信号的部分重迭以及对结合靶DNA序列的非选择性可能是HCV核心蛋白具有多功能的基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4的克隆化研究

目的 探索丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白反式激活作用的新的靶基因，以有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 应用表达谱芯片分析等分子生物学技术，结合生物信息学(bioinformatics)技术，筛选、克隆HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3-core，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3-core转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆核心蛋白反式激活的新型靶基因，命名为HCTP4，新基因的编码基因序列全长为220个核苷酸(nt)，编码产物由748个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV核心蛋白是具有反式激活作用的蛋白。DNA微短阵技术(DNA mieroarray)是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因，此新基因的发现为深入研究HCV核心蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因克隆化的研究

目的 应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HBX反式激活相关基因。方法 以HBX表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照。制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组。分别与两组不同的接头衔接，再对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制聚合酶链反应（PCR），将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库；文库扩增后得到85个白色克隆，进行菌落PCR分析。均得以200-1000bp插入片段，挑取含有插入片段的65个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得19种已知基因序列。和15个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HBX反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。