构建大鼠前甘丙肽原基因修饰永生化星形胶质细胞株对镇痛研究的意义

目的:转基因细胞移植镇痛是慢性疼痛治疗的新方向,构建大鼠前甘丙肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株,为转甘丙肽基因细胞移植镇痛的研究提供理论依据。方法:实验于2003-05/2004-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室完成。采用DNA重组技术将质粒pBSKS(+)-前甘丙肽原中的大鼠前甘丙肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcD-NA3.1(+)-前甘丙肽原和空质粒pcDNA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株,经G418(600mg/L)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养。采用免疫细胞化学法、反转录-聚合酶链反应和放射免疫法检测转染细胞大鼠甘丙肽的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功。结果:重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和521bp片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)-前甘丙肽原亚克隆成功。Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染到星形胶质细胞株中,筛选获得星形胶质细胞株/前甘丙肽原和星形胶质细胞株/Neo两种细胞株。星形胶质细胞株,星形胶质细胞株/前甘丙肽原和星形胶质细胞株/Neo的前甘丙肽原免疫染色均阳性,平均光密度分析结果显示星形胶质细胞株/前甘丙肽原的前甘丙肽原表达明显高于星形胶质细     

人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

目的:构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株.方法:采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1( )-hPPE和空质粒pcD-NA3.1( )分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST).经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养.采用免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(L-EK)的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功.结果:重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1( )-hPPE亚克隆成功.Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株,L-EK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的L-EK表达明显强于IAST/Neo和IAST(P＜0.01).IAST/hPPE细胞与IAST/Neo和IAST细胞相比,hPPE mRNA表达水平和培养上清液中L-EK的分泌量明显增高(P＜0.01),而IAST与IAST/Neo细胞相比无显著性差异(P＞0.05).结论:成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础.     

酸性肽对大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子水平的影响

背景：神经生长因子和脑源性神经因子对神经细胞的存活和增殖非常重要。阿尔茨海默病患者的神经生长因子和脑源性神经因子水平均较低。目的：探讨酸性肽能否增加大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子。设计：随机对照动物实验。单位：郑州大学医学院生物化学与分子生物学教研室。材料：实验于2003—09／2005—05在郑州大学生物活性肽研究所第一实验室和郑州大学基础医学院细胞培养中心完成。选取出生后2d内的SD乳鼠15只作为实验对象。方法：①将SD乳鼠在无菌条件下断头取出大脑皮质部分，进行星形胶质细胞的纯化培养，采用胶质纤维酸性蛋白免疫组化方法鉴定星形胶质细胞。②将培养的星形胶质细胞随机分为6组：空白对照组、血清对照组、阳性对照组、酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组。空白对照组不施加任何实验因素，血清对照组加入体积分数为0．2的血清，阳性对照组加入1000U／mL干扰素，酸性肽治疗组则分别加入37．5，75，150mg／L的酸性肽。③将长满瓶底的第2代星形胶质细胞消化成单细胞悬液，以5&;#215;10^5mL等量接种于3块12孔培养板中。各组均于培养24，48，72h各时间点测定细胞存活率、细胞上清液中和细胞内神经生长因子及脑源性神经因子含量。主要观察指标：①不同培养时间各组细胞计数和存活率的检测结果。②酸性肽对大鼠星形胶质细胞增殖的影响。③不同培养时间各组星形胶质细胞上清液中神经生长因子及脑源性神经因子含量的变化。结果：①与空白对照组比较，酸性肽75，150mg／L治疗组细胞计数和细胞存活率在培养24，48，72h时均明显增加（P〈0．05，0．01，0．001）；酸性肽37．5mg／L治疗组虽有所增加但不明显。②与空白对照组比较，酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组细胞增殖率均显著升高（0，17．5％，45．5％，72．5％，P〈0．001）。③与空白对照组比较，酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组细胞上清液中神经生长因子的吸光度值在培养24，48，72h时均明显增加（P〈0．001）；除了在培养24h时间点酸性肽37．5mg／L治疗组不能增加星形胶质细胞分泌脑源性神经因子外，其他各浓度酸性肽治疗组在培养24，48，72h时脑源性神经因子的吸光度值均显著提高（P〈0．05，0．001）。结论：酸性肽能够不同程度地增加大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子。     

酸性肽对大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子水平的影响

背景:神经生长因子和脑源性神经因子对神经细胞的存活和增殖非常重要。阿尔茨海默病患者的神经生长因子和脑源性神经因子水平均较低。目的:探讨酸性肽能否增加大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子。设计:随机对照动物实验。单位:郑州大学医学院生物化学与分子生物学教研室。材料:实验于2003-09/2005-05在郑州大学生物活性肽研究所第一实验室和郑州大学基础医学院细胞培养中心完成。选取出生后2d内的SD乳鼠15只作为实验对象。方法:①将SD乳鼠在无菌条件下断头取出大脑皮质部分,进行星形胶质细胞的纯化培养,采用胶质纤维酸性蛋白免疫组化方法鉴定星形胶质细胞。②将培养的星形胶质细胞随机分为6组:空白对照组、血清对照组、阳性对照组、酸性肽37.5,75,150mg/L治疗组。空白对照组不施加任何实验因素,血清对照组加入体积分数为0.2的血清,阳性对照组加入1000U/mL干扰素,酸性肽治疗组则分别加入37.5,75,150mg/L的酸性肽。③将长满瓶底的第2代星形胶质细胞消化成单细胞悬液,以5×105mL等量接种于3块12孔培养板中。各组均于培养24,48,72h各时间点测定细胞存活率、细胞上清液中和细胞内神经生长因子及脑源性神经因子含量。主要观察指标:①不同培养时间各组细胞计数和存活率的检测结果。②酸性肽对大鼠星形胶质细胞增殖的影响。③不同培养时间各组星形胶质细胞上清液中神经生长因子及脑源性神经因子含量的变化。结果:①与空白对照组比较,酸性肽75,150mg/L治疗组细胞计数和细胞存活率在培养24,48,72h时均明显增加(P<0.05,0.01,0.001);酸性肽37.5mg/L治疗组虽有所增加但不明显。②与空白对照组比较,酸性肽37.5,75,150mg/L治疗组细胞增殖率均显著升高(0,17.5%,45.5%,72.5%,P<0.001)。③与空白对照组比较,酸性肽37.5,75,150mg/L治疗组细胞上清液中神经生长因子的吸光度值在培养24,48,72h时均明显增加(P<0.001);除了在培养24h时间点酸性肽37.5mg/L治疗组不能增加星形胶质细胞分泌脑源性神经因子外,其他各浓度酸性肽治疗组在培养24,48,72h时脑源性神经因子的吸光度值均显著提高(P<0.05,0.001)。结论:酸性肽能够不同程度地增加大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子。     

党参皂苷L1对抗缺氧缺糖再给氧诱导大鼠星形胶质细胞损伤的作用

目的：观察扶正固本、益气类中药党参皂苷L1对缺氧缺糖再给氧所致大鼠大脑星形胶质细胞损伤是否有保护作用。 方法：实验于2004-08／2005-05在北京中医药大学东直门医院中医脑病研究室完成。①选用出生1d的Wistar大鼠40只，雌雄不拘。②分离大脑星形胶质细胞进行原代培养。加入含连二亚硫酸钠10mmol／L的无糖Earle液，置37℃体积分数0．05CO2孵箱中孵育90min进行缺氧缺糖处理。然后吸弃Earle液，加入不含连二亚硫酸钠的无血清DMEM培养液，继续置37℃体积分数0．05CO2孵箱中孵育90min进行再给氧处理。③将在相同或不同细胞培养板中的不同培养孔中细胞按随机抽签法分为6组（每10孔或8孔细胞为1组）;正常对照组（正常细胞培养），模型组（进行缺氧缺糖再给氧处理），尼莫地平组[在无糖Earle液和无血清DMEM培养液加入终浓度0．5mg／L尼莫地平[购自山东新华制药股份有限公司，生产批号：0211048，10mL（2mg）／支1，其余处理同模型组]，缺氧缺糖再给氧＋党参皂苷L1高、中、低浓度组[在无糖Earle液和无血清DMEM培养液分别加入质量浓度1．3，0．13和0.013mg／L党参皂苷L1（由北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室采用高效液相色谱法制备法分离得到，含量为96．2％），其余处理同模型组]。测定乳酸脱氢酶漏出率时缺氧缺糖处理后直接测定，而不做再给氧处理。④四唑盐比色法测定细胞存活率，Hoechst33342和碘化丙啶原位双染法荧光显微镜观察细胞形态学变化和细胞坏死率、细胞凋亡率，比色法测定乳酸脱氢酶漏出率。 结果：①荧光显微镜观察细胞形态：尼莫地平组和党参皂苷L1各浓度组与模型组比较均可见红染的坏死细胞数量明显减少，尼莫地平、党参皂苷L1各浓度组与模型组比较凋亡细胞数量无明显变化。②星形胶质细胞存活率：模型组明显低于正常组、尼莫地平组和党参皂甙L1中、低浓度组（F=42．464，P〈0．01）。③细胞坏死率和乳酸脱氢酶漏出率：模型组明显高于其他5组（F=69．344，24．994，P〈0．01）。④细胞凋亡率：模型组明显高于正常组（F=3．311，P〈0．05），与尼莫地平组和党参皂苷L1各浓度组比较，差异不明显（P〉0．05）。 结论：中药党参皂苷L1对缺糖缺氧再给氧造成的星形胶质细胞损伤具有保护作用，可抑制细胞坏死，但对凋亡过程无保护作用。     

丙泊酚对慢性神经痛大鼠脊髓星形胶质细胞激活的影响

目的 :研究丙泊酚对慢性神经痛大鼠脊髓星形胶质细胞激活的影响。方法 :Wistar大鼠 4 0只 ,随机分为 4组 ,Ⅰ组为正常对照 ;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组结扎左侧坐骨神经 ,术后第 7天 ,Ⅰ、Ⅱ组腹腔均注射生理盐水 5 0ml·kg 1,Ⅲ、Ⅳ组腹腔分别注射丙泊酚 5 0、75mg·kg 1( 1mgoml 1) ,共 7d ;术后第 6、10和 13天 ,使用VonFrey纤维分别测定各组动物触诱发痛阈 ,观察丙泊酚对其影响 ;随后取脊髓切片 ,观察星形胶质细胞在脊髓背角的分布。结果 :①与Ⅰ组比较 ,Ⅱ组双侧的 5 0 %缩足阈值 (PWTs)在术后第 6、10和 13d均较低 (P <0 .0 5 ) ;与Ⅱ组比较 ,Ⅲ、Ⅳ组双侧的PWTs在术后第 10、13天升高 (P <0 .0 5 )。②Ⅱ组星形胶质细胞在脊髓背角的分布密度 (AD)、平均光密度 (AOD)和积分光密度 (IOD)值显著高于Ⅰ组 (P <0 .0 1) ,Ⅲ、Ⅳ组低于Ⅱ组 (P <0 .0 5和P <0 .0 1)。③与Ⅱ组比较 ,Ⅲ、Ⅳ组星形胶质细胞在脊髓背角数量、体积依次减少。结论 :慢性神经痛大鼠的脊髓星形胶质细胞被激活 ,丙泊酚可抑制激活 ,抑制程度与剂量有相关性     

高压氧对大鼠活化的星形胶质细胞增殖及神经生长因子基因表达的影响

目的研究通高压氧对大鼠活化的星形胶质细胞的增殖作用及对神经生长因子(NGF)mRNA表达的影响,为探究通高压氧治疗脊髓损伤提供细胞学研究基础。方法采用酶消化法分离培养大鼠星形胶质细胞,用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定星形胶质细胞;取第4代细胞激活,将其暴露在不同的氧环境中,分四组:对照组(CO2温箱)、空气加压组(0.2 MPa空气加压舱)、纯氧组(85%以上氧浓度的纯氧舱)、高压氧组(0.2 MPa,85%以上氧浓度的高压氧舱),连续3 d,每天干预1 h,用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖水平,采用荧光定量PCR法测各组细胞NGF mRNA的相对表达量。结果经胶质纤维酸性蛋白鉴定,星形胶质细胞纯度达95%。高压氧组细胞较对照组、空气加压组和纯氧组增殖速度快,而纯氧组细胞较对照组和空气加压组增殖速度慢;荧光定量PCR测得NGF mRNA的相对表达量在通高压氧组高于对照组、空气加压组和纯氧组(P<0.05),而对照组、空气加压组和纯氧组之间两两比较差异无统计学意义。结论上述结果提示0.2 Mpa、85%的通高压氧可以促进星形胶质细胞增殖,提高NGF mRNA的相对表达量,为高压氧治疗脊髓损伤提供了细胞学研究基础。     

鞘内注射胶质细胞抑制剂对CCD大鼠脊髓星形胶质细胞的影响

[目的]研究鞘内注射氟代柠檬酸(fluorocirrate FC)和米诺四环素(minocychine MC)对背根节慢性压迫模型(the experiment model for chronic compression of dorsal root ganglion,CCD)大鼠脊髓背角星形胶质细胞活化增殖的影响.[方法]采用大鼠脊髓背根节慢性压迫实验模型,96只鞘内1管SD大鼠分为第7天组(A组)和第14天组(B组),每组随机分为六个亚组组,每小组(n=8)包括:假手术(sham)组,CCD组,溶荆磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)组(0.01mmol/L PBS20μL i.t.),FC组(lμmol/LFC 20μL i.t.),MC组(5g/LMC20μL i.t.),MC FC组(lμmol/L FC和5g/L MC混合演20μL i.t.).术后每天给药一次.分别于术后d7和d14运用免疫荧光化学方法观察脊缱背角胶原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.[结果]脊髓背角GFAP阳性表达CCD、PBS、FC组在Ⅰ～Ⅳ层都表达明显.在数目上没有差异性,而MC、MC FC组主要集中在Ⅰ～Ⅱ层,Ⅲ、Ⅳ层在数目上有明显减少.CCD组和PBS组胞体比其余各组明显肥大.[结论]鞘内给药后,慢性神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞GFAP表达减少,提示小胶质细胞抑制刑MC能很好的抑制星形胶质细胞的活化,小肢质细胞在星形胶质细胞活化的形成和维持中可能起重要作用.     

关节炎疼痛对大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响

关节炎性病变引发的慢性疼痛是困扰关节炎患者的首要症状,严重影响患者的工作和生活,现有临床治疗方法常不能有效缓解关节炎患者的慢性疼痛[1]。因此,有必要深入研究关节炎疼痛产生的机制,寻求更为有效的治疗方法。近年来的研究表明,脊髓中胶质细胞激活在炎性疼痛的产生和维持中发挥着重要作用[2,3],但脊髓中胶质细胞激活与关节炎慢性疼痛的关系并不清楚。本研究采用大鼠佐剂单发关节炎疼痛模型,探讨关节炎疼痛与脊髓星形胶质细胞激活的关系。材料与方法1.实验动物及试剂Wistar大鼠20只,雌雄各半,体重150～180g(同济医学院实验动物中心),随…     

氯胺酮对脊神经结扎大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响

目的：观察腹腔注射氯胺酮（KET）对脊神经结扎（SNL）大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响.方法：雄性SD大鼠42只随机分为五组：SHAM组;KET0组和NS0组结扎后分别腹腔注射KET 10mg/kg和生理盐水（NS）10 ml/kg;KET7组和NS7组,结扎7天后分别腹腔注射KET 10 mg/kg和NS.每组（除SHAM组）给药,每天两次,共7天.结扎后第4、7、14、21、28天行机械性痛敏实验,并用组化方法测定右侧脊髓背角胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞的变化.结果：与SHAM比较,KET0、NS0组机械痛敏试验的压力阈值（PWPT）下降,二者GFAP阳性细胞染色较SHAM深,GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别增加45.0%（P＜0.01）和86.7%（P＜0.01）;与NS7比较,KET7组PWPT升高,KET7组GFAP阳性细胞染色较NS7组浅,相对面积（不同时段）分别下降40.3%（P＜0.01）和24.6%（P＜0.01）.结论：低剂量的KET能抑制星形胶质细胞的激活,从而起到治疗神经病理性疼痛的作用.     

吸氧预处理对大鼠大脑皮质星形胶质细胞的影响

目的 观察吸氧预处理对大鼠大脑皮质内胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响，探讨吸氧预处理产生的脑缺血耐受与星形胶质细胞的关系。方法 雄性SD大鼠6只，随机分为两组：吸氧预处理组和对照组各3只。吸氧预处理组大鼠吸入1000ml/L氧气，持续24h。间隔24h后经心脏多聚甲醛灌注，取脑，固定，冷冻切片机冠状切片；对照组大鼠不给予吸氧预处理，吸空气24h，余同吸氧预处理组。用免疫组化法（ABC法）进行免疫组化染色，观察胶质原纤维酸性蛋白在大鼠大脑皮质的表达，比较两组大鼠的表达差异。结果 吸氧预处理组大鼠各部大脑皮质内胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞明显增多（P&;lt;0.05），包括枕皮质（t=8.32）、压后部皮质（t=6.l7）、顶皮质（t=4.76）、额皮质（t=4.93)、皮质前（t=6.17）和后肢区（t=7.48）等，细胞分布密集。胶质细胞形态亦与对照组不同：胞体肥大，突起粗而长，染色深。对照组大鼠大脑皮质内GFAP阳性细胞呈散在分布，阳性细胞的胞体小，突起细而短，染色浅淡。结论 吸氧预处理可以明显刺激大鼠大脑皮质GFAP的产生，使星形胶质细胞处于激活状态，与诱导脑缺血耐受的产生有关。     

党参皂苷L1对抗缺氧缺糖再给氧诱导大鼠星形胶质细胞损伤的作用

目的:观察扶正固本、益气类中药党参皂苷L1对缺氧缺糖再给氧所致大鼠大脑星形胶质细胞损伤是否有保护作用。方法:实验于2004-08/2005-05在北京中医药大学东直门医院中医脑病研究室完成。①选用出生1d的Wistar大鼠40只,雌雄不拘。②分离大脑星形胶质细胞进行原代培养。加入含连二亚硫酸钠10mmol/L的无糖Earle液,置37℃体积分数0.05CO2孵箱中孵育90min进行缺氧缺糖处理。然后吸弃Earle液,加入不含连二亚硫酸钠的无血清DMEM培养液,继续置37℃体积分数0.05CO2孵箱中孵育90min进行再给氧处理。③将在相同或不同细胞培养板中的不同培养孔中细胞按随机抽签法分为6组(每10孔或8孔细胞为1组):正常对照组(正常细胞培养),模型组(进行缺氧缺糖再给氧处理),尼莫地平组[在无糖Earle液和无血清DMEM培养液加入终浓度0.5mg/L尼莫地平[购自山东新华制药股份有限公司,生产批号:0211048,10mL(2mg)/支],其余处理同模型组],缺氧缺糖再给氧 党参皂苷L1高、中、低浓度组[在无糖Earle液和无血清DMEM培养液分别加入质量浓度1.3,0.13和0.013mg/L党参皂苷L1(由北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室采用高效液相色谱法制备法分离得到,含量为96.2%),其余处理同模型组]。测定乳酸脱氢酶漏出率时缺氧缺糖处理后直接测定,而不做再给氧处理。④四唑盐比色法测定细胞存活率,Hoechst33342和碘化丙啶原位双染法荧光显微镜观察细胞形态学变化和细胞坏死率、细胞凋亡率,比色法测定乳酸脱氢酶漏出率。结果:①荧光显微镜观察细胞形态:尼莫地平组和党参皂苷L1各浓度组与模型组比较均可见红染的坏死细胞数量明显减少,尼莫地平、党参皂苷L1各浓度组与模型组比较凋亡细胞数量无明显变化。②星形胶质细胞存活率:模型组明显低于正常组、尼莫地平组和党参皂甙L1中、低浓度组(F=42.464,P<0.01)。③细胞坏死率和乳酸脱氢酶漏出率:模型组明显高于其他5组(F=69.344,24.994,P<0.01)。④细胞凋亡率:模型组明显高于正常组(F=3.311,P<0.05),与尼莫地平组和党参皂苷L1各浓度组比较,差异不明显(P>0.05)。结论:中药党参皂苷L1对缺糖缺氧再给氧造成的星形胶质细胞损伤具有保护作用,可抑制细胞坏死,但对凋亡过程无保护作用。     

何首乌苷对奥沙利铂诱导大鼠星形胶质细胞凋亡的影响

目的探讨何首乌苷保护大鼠星形胶质细胞免于奥沙利铂诱导凋亡的作用及可能机制。方法原代培养大鼠星形胶质细胞,并利用流式检测所培养细胞胶质纤维酸性蛋白的表达情况。利用10μmol/L奥沙利铂处理胶质细胞24 h建立凋亡模型,加入浓度梯度的何首乌苷预处理胶质细胞24 h后与奥沙利铂共同作用24 h,台盼蓝染色法观察细胞存活。随后通过Annexin V-FITC/PI双染法流式检测各组凋亡率和检测Caspase-3的活性水平。进而利用JC-1染色法流式检测细胞线粒体膜电位,并利用实时定量RT-PCR与免疫印迹检测BAX与BCL2的m RNA水平和蛋白表达量。结果培养的大鼠星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白率达95%以上。奥沙利铂处理诱导凋亡24 h后,对照组胶质细胞凋亡率及Caspase-3活性上升并降低线粒体膜电位,加何首乌苷处理后凋亡率及Caspase-3活性下降而线粒体膜电位上升。相对于对照组,加入何首乌苷处理后BAX基因的m RNA及蛋白表达水平降低,BCL2基因的m RNA及蛋白表达水平上升。结论何首乌苷能恢复凋亡相关基因BAX与BCL2的平衡,保护大鼠皮质星形胶质细胞的线粒体膜电位,并使胶质细胞免于奥沙利铂诱导的凋亡作用。     

IκBα突变型基因提高过氧化氢处理后永生化星形胶质细胞的存活率

目的:探讨IκBα突变型基因对永生化星形胶质细胞株(IAST)NF-κB的活性及过氧化氢损伤后细胞存活率的影响。方法:通过脂质体法将携带IκBα突变型基因及对照载体转入IAST,通过Western Blot检测IκB蛋白的表达,用荧光素酶报告基因检测细胞中NF-κB的活性,用MTT法分别检测0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L过氧化氢处理2 h、4 h后转IκBα突变型基因及对照载体IAST的细胞存活率,免疫细胞化学法检测0.4 mmol/L过氧化氢处理4 h前后两组细胞中p65的表达。结果:转IκBα突变型基因的IAST中可见突变型IκBα表达,荧光素酶催化底物所发出的荧光强度较低(P<0.05)。各浓度过氧化氢处理4 h后转IκBα突变型基因的IAST细胞存活率较转对照载体的IAST高(P<0.05)。0.4 mmol/L过氧化氢处理4 h后转IκBα突变型基因及对照载体IAST中p65的表达出现核内移。结论:IκBα突变型基因可降低IAST中NF-κB的活性,提高过氧化氢处理后该细胞株的存活率。     

应用组织芯片技术研究COX-2、c-erbB-2和Ki-67在星形胶质细胞增生和星形胶质细胞瘤中的表达及意义

目的研究COX-2、c-erbB-2、Ki-67在星形胶质细胞增生及星形胶质细胞瘤中的表达,并探讨三者在鉴别反应性与肿瘤性星形胶质细胞方面的作用.方法利用组织芯片技术及PV6000通用型二步法免疫组化方法检测COX-2、c-erbB-2、Ki-67在正常脑组织、星形胶质细胞增生、低/高级别星形胶质细胞瘤中的表达.结果正常组织中COX-2、c-erbB-2、Ki-67表达均为（-）;增生组中阳性表达率分别为28.9%、37.8%和22.2%,与正常组比较,COX-2、Ki-67表达差异不显著,c-erbB-2差异显著（P＜0.05）;低级别肿瘤组中三者阳性表达率分别为68.1%、63.8%和70.2%,与增生组比较,均差异显著（P＜0.05）;高级别肿瘤组中三者阳性表达率分别为88.1%、83.3%和95.2%,与低级别肿瘤组比较,均差异显著（P＜0.05）.COX-2、c-erbB-2与组织学分级密切相关（r值分别为0.989和0.988）.结论COX-2、c-erbB-2、Ki-67有可能成为鉴别星形胶质细胞增生与低级别星形胶质细胞瘤的客观指标,且COX-2、c-erbB-2在星形胶质细胞瘤的发生、发展过程中有重要作用.     

电刺激促进脑梗死大鼠星形胶质细胞与神经元可塑性的重建

背景：对实验性卒中模型有目的进行瘫痪肢体的功能训练后脑组织修复过程中组织结构变化需借助相应方法观察其特征。目的：用易卒中型肾血管性高血压鼠复制大脑中动脉闭塞模型，探讨电刺激在脑梗死康复中对星形细胞与神经元可塑性的修复。设计：随机对照实验。单位：中山大学动物中心和电镜室。材料：实验于2002-01／2004-12在中山大学中山医学院动物中心和附属第一医院神经科实验室完成。健康雄性SD大鼠200只，3个月龄，体质量90-110g。所选的易卒中型肾血管性高血压鼠的收缩压必须达到180mmHg（1mmHg=0．133kPa）以上，复制的大脑中动脉闭塞模型经走横木试验评分为1分者。选出180只随机分为电刺激组和对照组，各90只。方法：电刺激组在瘫痪肢体取4个穴位，进行电刺激，6d为1个疗程，在电刺激治疗第1，3，6，9个疗程末对大鼠进行运动功能评分及取脑梗死灶边缘区组织进行以下检测：①走横木试验评分法（1分为严重障碍，7分为正常）。②电镜观察。③胶质酸性蛋白及神经丝蛋白和微管相关蛋白2测定采用免疫组织化学染色．两组标本的每张切片随机选5个视野，统计阳性细胞数；选取30个胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，测其阳性胞浆平均吸光度（A值）。④观察神经元凋亡采用原位末端标记法。⑤脑微血管扩张标准为视野下为完整的微血管记数1个。主要观察指标：①大鼠运动功能评分。②大鼠脑神经元与星形胶质细胞的超微结构。③大鼠脑胶质酸性蛋白、神经丝蛋白和微管相关蛋白2表达情况。④大鼠脑神经元凋亡结果。⑤大鼠脑微血管舒张情况。结果：大鼠进入结果分析180只，余20只在随机分组时超过1分退出实验。①两组大鼠走横木试验结果：从3-9个疗程末瘫痪肢体功能恢复电刺激组均好于对照组，第9疗程达6。分大鼠电刺激组显著多于对照组（42，26，x^2=15．4,P〈0．01）。②大鼠脑胶质纤维酸性蛋白阳性吸光度值：第3，6，9个疗程电刺激组显著高于对照组[（52．97&;#177;0．59）％比（46．40&;#177;0．56）％；（49．44&;#177;0．80）％比（46．40&;#177;0．56）％：（43．25&;#177;0．48）％比（34．20&;#177;0．50）％，P〈0．05]。③大鼠脑神经丝蛋白测定结果：第6和第9个疗程电刺激组显著高于对照组[（22．9&;#177;2．7）％比（11．9&;#177;2．3）％；（26．5&;#177;1．7）％比（11．7&;#177;1．5）％，P〈0．05]。④大鼠脑微管相关蛋白2测定结果：第6和第9个疗程电刺激组显著高于对照组[（21．7&;#177;1．3）％比（11．3&;#177;1．1）％；（24．4&;#177;2．1）％比（11．9&;#177;2．3），P〈0．05]。⑤大鼠脑神经元凋亡数：两组无显著差别。⑥大鼠脑微血管开放数目检测结果：第1，3，6，9个疗程电刺激组显著多于对照组（33比19；48比31；45比25；46比23，Z=2．309，P〈0．05）。结论：电刺激治疗可以促进瘫痪肢体功能恢复。可能是电刺激治疗可使星形胶质细胞的缺血性水肿消退，增强神经元活性，激发了脑微血管的舒张，从而改善脑循环。     

差速贴壁技术对大鼠脑皮质星形胶质细胞纯化率的影响

目的:观察差速贴壁技术对星形胶质细胞纯化率的影响,旨在建立一套可靠的大鼠脑皮质星形胶质细胞的取材分离、纯化培养技术。方法:实验于2006-06/08在泰山医学院生命科学研究所完成。实验材料:出生2～3d的Wistar大鼠,雌雄不拘,由泰山医学院生命科学研究所实验动物中心提供。实验方法:选用出生二三天的Wistar大鼠进行脑皮质星形胶质细胞原代培养。实验分两组培养:常规培养组和差速贴壁培养组。差速贴壁培养组分别于15,30min取出,轻轻翻转培养瓶,将上清液移至另一培养瓶中,放入培养箱中继续培养。7～10d后传代,待细胞分层生长后,置于37℃摇床中250r/min振荡18h,倒掉上清液,D-Hank’s液洗3次后,加入0.25%胰酶消化,倒置显微镜下观察,待细胞突起回缩后加入含血清的培养基终止消化,用吸管反复吹打使细胞从瓶壁上脱落,细胞悬液1000r/min离心5min后,弃上清液,加入含体积分数为0.2血清的DMEM培养基混悬沉淀,接种入预先涂有L-多聚赖氨酸的培养瓶中继续培养。采用双重免疫荧光法鉴定星形胶质细胞纯度,测定积分吸光度值判断星形胶质细胞的生长状况。结果:①应用差速贴壁技术培养星形胶质细胞可明显提高星形胶质细胞纯度[常规培养组:(82±3)%,差速贴壁培养组15min:(94±2)%,差速贴壁培养组30min:(95±2)%,P<0.01]。差速贴壁需要充分的时间,15min组和30min组在提高星形胶质细胞纯度方面无明显差别。②差速贴壁培养组星形胶质细胞积分吸光度值高于常规培养组(常规培养组:528±25,差速贴壁培养组15min:972±17,差速贴壁培养组30min:996±35,P<0.05)。结论:①差速贴壁技术可明显提高星形胶质细胞纯化度,并且星形胶质细胞生长状态明显优于常规培养方法。②最佳差速贴壁时间为15min,过长差速贴壁时间对提高星形胶质细胞纯度无明显影响。     

olomoucine对星形胶质细胞增殖的影响及机制研究

目的:观察细胞周期抑制剂olomoucine对培养星形胶质细胞(AS)机械损伤后增殖的影响,并探讨其作用机制。方法:建立体外培养大鼠纯化的AS物理损伤模型(划痕损伤模型),随机分为对照组、划痕组和干预组,划痕组和干预组均继续培养,干预组给予olomoucine干预。利用免疫荧光细胞化学方法观察损伤后BrdU表达;利用Westernblot印迹分析损伤后PCNA、p27的表达。结果:划痕损伤刺激12h开始出现损伤边缘区AS胞体肥大、数目增加,BrdU阳性细胞比率和PCNA表达水平较对照组增高(P<0.05),p27表达水平较对照组下降(P<0.05);干预组的BrdU阳性细胞比率和PCNA表达水平较划痕组明显减少(P<0.05),p27表达上调(P<0.05)。结论:损伤刺激可促使AS发生反应性胶质增生,CDK选择性细胞周期抑制剂olomoucine可以通过调控细胞周期抑制其反应性增生。     

昼夜节律紊乱对星形胶质细胞功能的影响

星形胶质细胞是中枢神经系统分布最广泛的一类细胞,具有神经支持、维持血脑屏障稳定、调节脑脊液循环及参与神经炎症等功能。研究表明,星形胶质细胞具有极强的昼夜节律,并参与自身功能的调节。本文总结了昼夜节律紊乱对星形胶质细胞功能的影响,重点讨论昼夜节律紊乱情况下,内淋巴循环障碍、神经元氧化应激与炎症、神经递质代谢异常以及突触功能改变,及其与神经退行性疾病之间的可能存在的联系。     

次声作用后大鼠海马星形胶质细胞的变化

目的 研究8Hz,90dB和130dB次声作用后不同时间点，大鼠海马中胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）表达的变化。方法 Hz,90dB和130dB次声作用于大鼠，2h/d，分别作用于1，7，14，21，28d后采用免疫组织化学方法，观察大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的时程改变。结果 130dB组从作用1d开始大鼠海马中GFAP阳性星形胶质细胞数量开始增加，14d达到高潮，21d开始下降，但仍然维持较高水平90dB组大鼠各时间点GFAP反应均比130dB组弱。结论 8Hz,90dB和130dB次声作用可以激活海马大量星形胶质细胞，对神经元具有保护作用。