基因芯片技术检测慢性乙型肝炎肝硬化患者肝组织及血清HBVDNA研究

目的研究DNA芯片技术在检测乙型肝炎和肝硬化患者肝组织及血清中HBVDNA的应用，并与雅培试剂、免疫组织化学和原位分子杂交法比较。方法用点样仪将PCR扩增的HBVDNA探针制成基因芯片。对15例慢性乙型肝炎(下称慢乙肝)患者的血清及肝活检组织、99例乙型肝炎后肝硬化肝组织，分别用基因芯片、原位分子杂交法、免疫组织化学法、雅培试剂检测HBVDNA、HBcAg、HBsAg、HBeAg。结果15例慢乙肝HBsAg、HBeAg阳性患者的乙型肝炎血清基因芯片检测均阳性。15例肝组织标本中，免疫组化法HBcAg阳性15例，HBVDNA原位分子杂交阳性14例。基因芯片检测阳性14例。99例乙型肝炎后肝硬化肝组织标本中，HBcAg阳性67例、HBVDNA阳性53例，基因芯片检测阳性46例；32例HBcAg、HBVDNA阴性组织基因芯片检测均阴性。结论肝炎基因诊断芯片可以检测肝组织及血清HBVDNA，其诊断准确率高，假阳性率低。     

慢乙肝患者血清及肝组织HBVDNA表达及基因芯片检测研究

用点样仪将 PCR扩增的 HBVDNA探针制成基因芯片 ,对 15例慢性乙型肝炎 (下称慢乙肝 )患者的血清及肝活检组织 ,分别用基因芯片、原位分子杂交法、免疫组织化学法、雅培试剂检测 HBVDNA、HBc Ag、HBs Ag、HBe Ag。结果 15例患者的血清 HBs Ag、HBe Ag及基因芯片检测均阳性。15例肝组织标本中 ,免疫组化法HBc Ag阳性 15例 ,HBVDNA原位分子杂交法阳性 14例 ,基因芯片检测阳性 14例。认为肝炎基因诊断可同时检测乙肝患者血清及肝组织中的 HBVDNA。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV YMDD变异及基因芯片检测

建立乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测方法。设计特异性寡核苷酸探针数组 ,特殊处理芯片载体。用点样法制备乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片。在本院住院治疗病人中选择 3 0例服用拉米夫定后 ,可能出现YMDD变异的病人进行基因芯片杂交检测分析 ;同时用PCR直接测序法对上述 3 0例病人血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。 3 0例服药后HBVDNA反跳病人中 ,基因芯片测得HBVYMDD变异 2 1例 ,其中YVDD变异 11例。YIDD变异 10例。HBVDNAPCR直接序列测定结果与基因芯片检测结果完全一致。乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异 ,同PCR直接测序法比较 ,准确率达 10 0 % ,无假阳性     

肝炎肝硬化患者肝组织中HBcAg、HBVDNA表达的初步探讨

观察乙型肝炎引起的肝炎肝硬化患者组织中HBcAg和HBVDNA的表达。随机采取100例乙型肝炎 肝硬化患者，行肝活检术取肝组织，采用免疫组织化学和原位分子杂交，检测其中HBcAg和HBVDNA。肝组织中HBcAg、HBVDNA的检出率分别为64％和62％（P＞0．05）。血清HBV呈高复制时，肝组织中HBcAg和HBVDNA的阳性表达，有较好的一致性；HBcAg颗粒在肝呈弥漫的浆、膜型分布者，其肝组织中HBVDNSA呈高表达，其肝组织病变是活动的（P＜0．05）。乙型肝炎肝硬化患者肝组织中有较高的HBV复制率；肝组织中HBcAg和HBVDNA的分布类型与其中的HBV复制状况和组织病变的活动性有关。     

DNA芯片对乙型肝炎肝硬化患者肝组织中病毒的检测

我们从基因库中筛选出乙型肝炎病毒（HBV）高度保守序列片段,通过分子克隆操作,用芯片点样仪点到特制的玻片上,制成乙型肝炎基因诊断芯片,检测了99例乙型肝炎肝硬化患者肝组织标本,同时用免疫组织化学法、原位分子杂交法检测乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和HBV DNA。1.资料与方法:（1）芯片制备:玻片购自Sigma公司,HBV DNA靶基因和对照植物基因由博华公司提供,用通用引物进行PCR扩增,PCR产物用Cartesia7500点样仪进行点样制成芯片。（2）标本处理和DNA提取:采集本院病理科1995～2000年乙型肝炎后肝硬化肝活检     

乙型肝炎患者胃粘膜中HBcAg和HBVDNA表达分析

目的 探讨乙型肝炎患者胃粘膜中是否有HBcAg和HBVDN的存在。方法 随机选择120例乙型肝炎患者并对其行胃粘膜活检。采用ELISA法检测其静脉血HBVM，采用免疫组织化学SP法检测其胃粘膜中的HBcAg，采用原位分子杂交法检测其胃粘膜中的HBVDNA。结果 乙型肝炎患者胃粘膜中有HBcAg和HBVDNA的存在，主要呈胞浆型分布，少数在胃粘膜腺细胞胞核上表达。胃粘膜腺腔、胃小凹及间质中也可见HBcAg和HBVDNA颗粒。血清HSsAg合并HBeAg和抗HBc阳性、HBsAg和抗—NBe及抗—HBc均阳性与抗—HBc阳性或HBsAg阳性或抗HBe阳性，但HBeAg阴性者的乙型肝炎患者胃粘膜中HBcAg、HBVDNA阳性率比较，差异无显著性(P＞0．05)。结论 乙型肝炎患者胃粘膜中有HBcAg和HBVDNA的存在，与其血清中HBV复制状态不相关。     

慢性乙型肝炎患者肝组织HBsAg、HBcAg表达及临床意义

目的：探讨慢性乙型肝炎患者肝组织中HBsAg、HBcAg表达与血清乙肝病毒载量及肝组织损伤程度之间的关系。方法：对90例慢性乙型肝炎患者进行肝组织活检，进行病理诊断及乙肝病毒HBsAg、HBcAg免疫组化染色．同时荧光定量检测血清HBVDNA含量，并分析其相关性。结果：血清HBVDNA定量、肝组织炎症程度及纤维化程度与肝组织HBsAg表达强度无相关性，而与肝组织HBcAg表达强度有明显的关联性；血清HBVDNA定量与肝组织炎症程度及纤维化间无明显的相关性。结论：在慢性乙型肝炎的免疫损伤过程中，HBcAg是靶抗原，血清HBV DNA结合肝组织病毒抗原的表达可作为抗病毒治疗的指标。     

乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片制备的初步实验研究

目的 制备联合检测乙型、丁型肝炎病毒基因芯片并进行杂交验证。方法利用Primer 5.0软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计多对PCR引物，纯化PCR扩增产物，扩增后的产物克隆至pMD18-T载体，提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。用芯片点样仪将PCR产物点到玻片上制备成基因芯片。样品标记采用限制性显示技术，样品标记后进行杂交。结果运用PCR技术，得到多个乙型、丁型肝炎病毒特异性基因片段。序列分析表明，所扩增的片段均属于HBV、HDV特异基因。杂交结果显示，样品和乙型、丁型肝炎诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳。结论利用PCR扩增产物制备乙型、丁型诊断基因芯片是一种快速、简便的实用方法，有着广阔的应用前景。另外，利用限制性显示技术标记样品可为进一步更多种肝炎病毒的混和检测奠定基础。     

隐匿性乙型肝炎:免疫组织化学和S基因序列分析

目的　了解不明原因慢性肝病中隐匿性乙型肝炎所占比例 ,隐匿性乙型肝炎的发病机制及临床、病理特点。方法　给予 2 0例不明原因慢性肝病患者肝穿刺病理检查 ,应用免疫组织化学方法检测肝组织内的乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)、核心抗原 (HBcAg) ,丙型肝炎病毒NS3、NS4抗原。采用荧光定量PCR方法对血清HBVDNA进行定量 ,用套式PCR方法扩增HBVS基因 ,对PCR产物进行直接测序 ,比较S基因的核苷酸和推导出的氨基酸序列的差异。结果　 5例患者经肝脏病理检查表现为慢性炎症 ,3例在肝组织内HBsAg、HBcAg同时阳性 ,2例仅HBcAg阳性。S基因的氨基酸序列分析显示 ,1例患者S基因的 74位密码子发生终止变异 ,另 1例在HBsAg的“a”决定簇内有 2个氨基酸发生变异 (T13 1N ,M 13 3S) ,其他 3例患者HBsAg的“a”决定簇内未发现变异。 结论　在我国隐匿性乙型肝炎是不明原因肝病的主要原因之一 ,低水平的血清HBVDNA可以引起慢性肝炎。部分隐匿性乙型肝炎HBsAg阴性的原因是S基因变异引起的 ,而有些患者则可能因为血清HBsAg水平过低 ,导致HBsAg检测阴性。     

乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA检测分析

探讨乙型肝炎患者血清和肝组织中HBVDNA的相关性。采用免疫荧光定量聚合酶链和原位分子杂交技术分别检测随机选择的 4 0例乙型肝炎患者血清和肝组织中HBVDNA。乙型肝炎患者血清和肝组织中HBVDNA水平呈正相关 ,但不呈直线相关 (re =0 2 4 ,t=1 0 9,P >0 0 5 )。乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV -DNA水平有相关性。可以通过检测乙型肝炎患者血清HBV -DNA来判断其肝组织中HBV复制水平     

乙型肝炎患者血清HBV DNA负荷和肝组织超微结构损伤的相关性

探讨乙型肝炎患者血清HBV DNA负荷和肝组织超微结构损伤的相关性。采用免疫荧光定量聚合酶链和超微病理学技术,分别检测随机选择的40例乙型肝炎患者血清HBV DNA负荷和其肝组织超微结构损伤。血清 HBV DNA水平和肝组织某些超微结构损伤(线粒体肿胀、溶酶体增多、汇管区淋巴细胞浸润、Kupffer细胞增生、肝细胞淤胆和间质纤维组织增生)呈正相关,但不呈直线相关(re=0．21,t=1．12,P>0．05);血清HBV DNA水平和肝组织某些超微结构损伤(内质网增生扩张、高尔基体扩张、贮脂细胞增生、毛细胆管扩张淤胆、毛细血管增生)无相关性(P>0．05)。乙型肝炎患者血清HBV DNA负荷和其肝组织某些超做结构损伤有相关性。     

慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA负荷与其肝组织炎症活动度的相关性研究

探讨慢性乙型肝炎患者血清ＨＢＶＤＮＡ水平与其肝组织炎症活动度的相关性。随机选择８２例慢性乙型肝炎患者，检测其血清ＨＢＶＤＮＡ和ＡＬＴ水平，肝穿刺活检，光镜多视野观察其肝组织炎症活动度。随着慢性乙型肝炎患者血清ＨＢＶＤＮＡ水平升高，其血清ＡＬＴ和肝组织炎症活动度明显升高（Ｐ＜０．０５）。慢性乙型肝炎患者ＨＢＶＤＮＡ负荷与其肝组织炎症活动度有相关性。     

慢性乙肝患者血清病毒载量、肝组织病毒抗原表达及炎症分级的关系

为探讨慢性乙肝患者血清病毒载量、肝组织病毒抗原表达与肝组织炎症分级的关系,对113例慢性乙肝患者进行了血清HBVDNA定量检测、肝组织活检进行病理诊断及乙肝病毒表面抗原、核心抗原免疫组化染色,并分析其相关性。结果显示肝组织病毒抗原的表达与血清HBVDNA水平显著相关;血清HBVDNA水平与肝组织炎症分级无显著相关性;肝组织炎症分级与HBcAg表达显著相关,但与HBsAg表达无显著相关性。     

死胎大脑组织中HBVDNA表达的临床和病理研究

观察死胎大脑组织中HBVDNA表达的情况 ,探讨通过产妇传播到死胎大脑组织中的HBV是否存在复制。采集 4 0例乙型肝炎产妇产下的死胎 ,常规尸检 ,取大脑组织。采用原位分子杂交法 ,检测其中的HBVDNA ;回顾产妇产前静脉血HBV的检测结果。死胎大脑组织中HBVDNA的检出率为 13/ 4 0 (33% )例。产妇产前静脉血HBV呈高、低和无复制状态时 ,大脑组织中HBVDNA的检出率分别为 1/ 4 (2 5 % )例、5 / 2 0 (2 5 % )例和 7/ 16 (44 % )例 ;三者之间相互比较 ,差异不显著 (P >0 0 5 )。HBVDNA颗粒在大脑胶质细胞浆、血管中呈点、灶状分布 ,大脑胶质细胞核不着色。死胎大脑组织中有HBV复制 ;死胎大脑组织中HBVDNA表达与产妇血清中HBV复制状态无关     

乙肝病毒血清学指标与肝组织病毒存在状况的关系

研究乙肝病毒血清学指标与肝组织病毒存在状况的关系。用聚合酶联反应和免疫组织化学方法分别检测了不同就诊者肝组织ＨＢＶＤＮＡ和乙肝病毒核心抗原的存在状况,同时分析了肝组织病理学变化。在部分血清ＨＢｓＡｇ阴性而仅检测出病毒抗体的就诊者肝组织内检惭肝病毒ＤＮＡ和核心抗原。其中一部分就诊者肝组织病理学表现为慢活肝和早期肝硬化。不少患者仅检测出血清中乙肝病毒抗体,但体内仍有乙肝病毒的存在,肝组织有不同程度的慢     

乙型肝炎患者血清HBVDNA负荷与其肝功能及肝组织损害的关系研究

探讨乙肝患者血清HBVDNA含量与其肝功能及肝组织损害的关系。检测 380例未经治疗的乙肝患者血清HBVDNA、肝功能 ,其中 71例进行了肝活检。乙肝患者血清HBVDNA含量与其病情的严重程度不一致 ;临床各型乙肝中HBVDNA阳性组与阴性组间ALT、TBil均无显著差异 (P >0 0 5 ) ;肝组织炎症分级Gi～G4和纤维化分期S1～S4各组间HBVDNA值均无明显差异 (P >0 0 5 )。乙肝患者血清HBVDNA含量不能反映其病情的临床严重程度 ,与肝组织炎症和纤维化程度无关