RNA干扰Akt对食管癌细胞株Eca109生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰沉默Akt对人食管鳞癌细胞体外增殖、迁移及血管生成拟态(VM)形成的影响.方法:应用倒置荧光显微镜观察Akt的干扰质粒转染食管癌细胞Eca109后绿色荧光蛋白的表达;采用Western blot方法检测Akt蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染前后细胞增殖能力的变化;Transwell方法...     

RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞株TE13的生物学特性的影响

目的:探讨HIF-1α仅沉默后对食管癌细胞株TE13的生物学行为的影响.方法:应用倒置荧光显微镜观察HIF-1α的干扰质粒转染食管癌细胞TE13后绿色荧光蛋白的表达:采用、Western blot方法检测HIF-1α蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染前后细胞增殖能力的变化:Transwell方法检测干扰前后细胞迁移能力的变化;流式细胞术检测干扰前后细胞周期的变化.结果:TE13/12单克隆干扰效果好,Westernblot结果显示无HIF-1α表达.HIF-1α被干扰后,细胞增殖能力明显减弱(p<0.05),运动迁移能力显著下降,与未转染的细胞相比穿过人工基底膜的细胞数明显减少(18.2±3.7 VS 103.8±8.5,P<0.05).与未转染组相比,TE13/12的细胞周期发生变化,G2/M期细胞明显减少(5.99%±1.19% vs 20.47%±4.30%,P<0.05),S期增加(64.67%±1.98%VS 48.53%±3.89%,P<0.05).结论:RNA干扰可引起TE13中HIF-1α的沉默,而HIF-1α表达下调后食管癌细胞株TE13的增殖与迁移能力均减弱.推测阻断HIF-1α通路有可能成为治疗人食管鳞癌的新靶点.     

siRNA干扰PDCD4表达对人食管鳞状细胞癌细胞株Eca109的影响

背景:研究发现PDCD4是一种新的肿瘤抑制基因,其表达与多种肿瘤的恶性转化相关。然而,PDCD4在食管鳞状细胞癌中的作用尚未完全明确。目的:探讨沉默PDCD4表达对食管鳞状细胞癌细胞株Eca109体外增殖、迁移、凋亡能力的影响。方法:选择未转染的Eca109细胞(空白对照组)、转染无义序列的Eca109细胞(阴性对照组)和转染PDCD4 siRNA的Eca109细胞(si-PDCD4组),采用蛋白质印迹法检测PDCD4蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,平板单克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力。结果:与空白对照组、阴性对照组相比,si-PDCD4组细胞中PDCD4蛋白表达降低(P0.05),细胞增殖能力增强(P0.05),细胞克隆形成数目增多(P0.05),细胞凋亡率降低(P0.05),细胞迁移能力增强(P0.05)。结论:PDCD4 siRNA可在体外促进食管鳞状细胞癌Eca109细胞的增殖、迁移,并抑制细胞凋亡,为食管鳞状细胞癌的诊治提供了新的实验依据。     

RNA干扰SBF2对人口腔癌细胞株SCC15增殖、凋亡及侵袭的影响

目的探讨RNA干扰SET结合因子2(SBF2)表达对人口腔癌细胞株SCC15增殖、凋亡及侵袭的影响。方法根据SBF2的mRNA序列及siRNA设计原则,设计并合成3条靶向SBF2基因的siRNA(SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2、SBF2-siRNA3),以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体转染取对数生长期SCC15细胞,同时设转染不针对任何基因的随机序列(siRNA-NC)。转染48 h后采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SBF2干扰效率,分别于转染24、48、72 h采用WST-1法评价讨RNA干扰SBF2对SCC15细胞增殖的影响,分别于转染24、48 h后采用Annexin VFITC/PI双标流式细胞术和Transwell小室法检测SCC15细胞的凋亡率及穿膜细胞数以评价RNA干扰SBF2对凋亡和侵袭能力的影响。结果与仅行转染试剂Lipofectamine 2000处理的对照组相比,SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2和SBF2-siRNA3组SCC15细胞中SBF2 mRNA水平均降低(P<0.05),且干扰率由高至低依次为SBF2-siRNA2>SBF2-siRNA3>SBF2-siRNA1,故选取干扰效率最高的SBF2-siRNA2用于后续实验。与对照组和siRNA-NC组相比,SBF2-siRNA组的增殖抑制率和凋亡率均升高,而穿膜细胞数降低,以上差异均有统计学意义(P<0.05);对照组和siRNA-NC组以上指标的无统计学差异(P>0.05)。结论 RNA靶向干扰SBF2表达可抑制人口腔癌细胞增殖及侵袭能力并诱导其凋亡。     

RNA干扰抑制cyclin E表达对食道癌细胞Eca-109增殖的影响

目的 探讨利用RNAi技术抑制cyclin E的表达,研究cyclin E在食道癌细胞Eca-109生长、增殖过程中的作用.方法 设计针对cyclin E基因的siRNA序列,合成并克隆入pGFU6/neo质粒中,用脂质体转染法将重组质粒转染Eca-109细胞.采用RT-PCR和免疫印迹试验检测稳定转染的Eca-109细胞中cyclin E的表达水平.台盼蓝排斥法、MTT法、3H-TdR掺人试验、平板克隆形成试验检测干扰cyclin E后对细胞活力以及增殖能力的影响,流式细胞仪测定细胞周期时相分布.Westem印迹检测细胞增殖有关蛋白PCNA、p21、bax和bcl-2表达变化.结果 台盼蓝排斥法、MTT法、3H-TdR掺入试验和平板克隆形成试验显示转染组细胞活力及增殖受到抑制;阻滞在G0/G1期细胞比例增加.Western印迹表明PCNA和bcl-2蛋白表达量下降;而p21蛋白和Bax蛋白表达量上升.结论 沉默cyclin E基因能明显抑制食道癌细胞Eca-109的活力及增殖能力,并且细胞周期被阻滞,机制可能与下调肿瘤细胞内PCNA以及上调p21的表达有关.     

腺病毒介导的COX—2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响

目的：验证环氧合酶（COX）－2在食管癌组织是否高度表达;构建表达人COX－2反义RNA的腺病毒载体,研究其对人食管癌细胞生长的抑制作用。方法：用免疫组织化学方法（SP法）,检测COX－1、COX－2在38例食管癌癌旁组织和癌组织中表达情况;并将人COX－2的cDNA片段反向构建于腺病毒载体并转染食管癌细胞EC9706,采用生长曲线、用^3H-TdR、^3H-Leucine掺入法及免疫细胞化学的方法,研究其对COX－2表达、及对食管癌细胞生长、DNA复制及蛋白合成的影响。结果：COX－2在食管癌中的阳性表达率为91．7％,主要为癌组织的表达,而在癌旁正常组织无表达或弱表达,而COX－1在食管癌正常组织和癌旁组织均有不同水平的表达。同时,我们构建的重组腺病毒感染肿瘤细胞后,COX－2表达水平与对照组比较明显降低,^3H-TdR和^3H-Leucine掺入量均明显减少,与对照组比较P＜0．001;同时发现食管癌细胞的生长细胞计数随时间递减,对照组生长细胞计数随时间而递增,Ad-LacZ组与空白对照组生长曲线几乎重叠。结论：COX－2可能与食管癌的发生发展有关;抑制COX－2的表达可能是治疗食管癌的一种新途径。     

siRNA沉默TPX2基因对食管癌细胞EC9706的增殖和TPX2基因表达的影响

目的:研究TPX2基因特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)对食管鳞癌EC9706细胞基因表达的抑制作用及对食管癌细胞生长的影响.方法:以食管鳞癌EC9706细胞为研究对象,利用Lipofectamine2000介导TPX2 siRNA分组转染EC9706细胞24,48,72,96 h(实验组),并设立阴性对照组和空白对照组.RT-PCR检测siRNA转染前后TPX2 mRNA的表达水平的变化:Western blot检测转染前后EC9706细胞中TPX2蛋白表达水平的变化;MTT法检测瞬时转染TPX2 siRNA对EC9706细胞增殖的影响.结果:导入有效siRNA后,PT-PCR及Western blot结果显示.TPX2 siRNA可使EC9706细胞中TPX2 mRNA水平及蛋白表达水平下降,至72 h时表达量最低,与空白对照组相比分别为0.31±0.08和0.39±0.12,差异有统计学意义(P<0.05);MTT实验显示细胞的生长增殖受到明显抑制,与对照组相比抑制率可达35.4%(P<0.05).结论:siRNA可以有效抑制EC9706细胞中TPX2的表达,并降低EC9706细胞的增殖能力.     

RNA干扰沉默STAT3基因对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的影响

肝细胞癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一,其发生、发展过程受诸多因素的影响.近年研究发现,信号转导和转录激活因子(STAT)具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演变,其中以STAT3尤为活跃.本研究利用RNA干扰(RNAi)技术,用短发夹样RNA(shRNA)设计并构建RNAi-DNA质粒,筛选稳定表达小干扰RNA(siRNA)的肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株,体外研究siRNA稳定和特异性诱导肝癌STAT3基因转录后沉默并逆转其恶性表型的能力,从而探索肝癌治疗的新方法.     

过表达AnnexinA2抑制食管癌Eca109细胞增殖和迁移

目的探讨AnnexinA2的表达对人食管癌细胞Eca109增殖、迁移、细胞周期和凋亡的影响。方法采用基因过表达技术上调Eca109细胞中AnnexinA2的表达,qRT-PCR和Western blot技术检测AnnexinA2 mRNA和蛋白水平变化;赛唑蓝(MTT)比色法研究其对Eca109细胞的存活、增殖能力的影响;采用划痕实验观察其对细胞迁移能力的影响;流式细胞术检测其对Eca109细胞周期及细胞凋亡的影响。结果 qRT-PCR和Western blot检测提示Eca109细胞转染AnnexinA2过表达质粒后mRNA和蛋白质表达水平均显著增高;MTT实验表明AnnexinA2过表达组细胞的增殖能力明显低于对照组(P0.05),同时细胞迁移能力也显著下降(P0.05);AnnexinA2在Eca109细胞中高表达将细胞阻滞于G2/M期,对细胞凋亡没有影响。结论 AnnexinA2在食管癌细胞中呈低表达,上调AnnexinA2蛋白水平可以明显抑制食管癌细胞的增殖、迁移能力。     

RNA干扰环氧化酶-2基因表达对A549细胞体外恶性增殖的影响

目的研究不同靶点对环氧化酶-2（COX-2）基因表达的抑制及其对A549细胞体外恶性增殖的影响。方法以COX-2第3、7和10外显子为靶点，构建3个带有人U6启动子的COX-2小干扰RNA（siRNA）表达载体。用脂质体lipofectamine介导，分别将3个siRNA表达载体及2个空载体转染到cox-2表达阳性的A549细胞，建立转染细胞株。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成试验研究COX-2不同干扰靶点对A549细胞体外增殖的影响。结果3个siRNA和u6启动子序列正确并准确克隆到pEGFP载体。转染细胞株分别命名为A549—3，A549—7、A549—10、A549-p和A549-pU6。转染后24、48、72h，A549-p细胞均有绿色荧光表达，而A549-pU6、A549-3、A549—7和A549—10细胞均未观察到绿色荧光。RT—PCR和Western blot结果显示，以COX-2第3、7和10外显子作为靶点进行干扰，COX-2表达均受到抑制。与A549细胞比较，A549—3、A549-7、A549-10细胞的COX-2 mRNA表达量分别降低10．6％、33．4％和61．2％，COX-2蛋白表达量分别降低26．7％、44．7％和56．2％。细胞生长曲线、集落形成试验的结果显示，A549—10细胞生长减慢，集落形成率减少，而3外显子和7外显子两个干扰靶点对A549细胞生长没有明显的影响。结论以COX-2第10外显子为靶点干扰效果最好，对A549细胞的体外恶性增殖有明显的影响。     

磁性纳米控释紫杉醇对食管癌Eca109细胞株生长的影响

目的:观察不同浓度磁性纳米控释紫杉醇对食管癌细胞Eca109的影响及与不同化疗药物的对比.方法:取对数生长期的食管癌Eca109细胞作细胞增殖抑制实验,实验组分别给予不同浓度的磁性纳米控释紫杉醇和5-氟尿嘧啶、泰素,同时设立二甲基亚砜(DMSO)和RPMI1640液对照,测定24,48,72h三个时间段的吸光度值,计算抑制率.经不同浓度的磁性纳米控释紫杉醇作用72h后,用电镜观察细胞超微结构,同时用流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡.结果:MTT实验显示磁性纳米控释紫杉醇可抑制食管癌细胞增殖,与5-氟尿嘧啶,泰素相比,具有缓释性(P<0.01);电镜可发现药物作用组细胞核固缩、解聚以及凋亡小体;流式细胞仪检测显示G1峰前有明显的凋亡峰;细胞周期分析提示磁性纳米控释紫杉醇可将Eca109细胞阻滞于G2-M期,且与浓度相关.结论:磁性纳米控释紫杉醇对人食管癌细胞Eca109的生长有明显的抑制作用,使细胞分裂阻滞于G2-M期,并诱导细胞凋亡,且具有缓释效果.     

启膈散及其拆方对食管癌细胞Eca109 PLC-γ1介导的细胞信号转导的影响

目的:观察启膈散及其活血和化痰两个拆方对人食管癌细胞株Eca109细胞磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)介导的细胞信号转导的影响,以研究启膈散治疗食管癌的作用机制.方法:用启膈散(W)及其活血(P)和化痰(R)两个拆方的水提物处理体外培养的人食管癌细胞株Eca109细胞,测定细胞PLC-γ1、表皮生长因子受体(EGFR)和PKCα蛋白表达水平、蛋白酪氨酸磷酸化(PY99)水平和豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物(MARCKS)(Ser152/156)磷酸化水平、细胞内游离钙离子[Ca~(2 )]i浓度及蛋白激酶C(PKC)活性.结果:1mg/L的启膈散及其拆方明显抑制Eca109细胞PLCγ1蛋白表达(0.31%,0.42%,0.20%),随着药物浓度增加其抑制作用分别增强,启膈散及其拆方对体外培养的食管癌细胞PLC-γ1、EGFR和PKCα表达、PLC-γ1和EGFR酪氨酸磷酸化、MARCKS磷酸化、[Ca~(2 )]i浓度(169.65±30.54 nmol/L,145.84±24.12 nmol/L.214.94±37.14 nmol/L vs 231.86±51.10 nmol/L,P>0.05,P<0.05,P>0.05)及PKC活性均有不同程度的抑制作用,以P组作用最强.结论:启膈散及其拆方通过不同程度的抑制食管癌细胞PLC-γ1介导的信号转导而抑制肿瘤细胞的生长.     

RNA干扰体外抑制人食管鳞癌细胞Eca-109缺氧诱导因子-1α的表达

目的:观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人食管鳞癌细胞系Eca-109中 HIF-1α基因的沉默效应,筛选有效干扰靶点．方法:设计合成干扰缺氧诱导因子-1α RNA 寡核苷酸片段,经退火、连接等步骤克隆至线性化的PGCsi真核表达载体上,测序鉴定．应用LipofectamineTM2000将该质粒分别转染Eca-109细胞和293T细胞,其中Eca-109抗性细胞又经2-4 wk的G418筛选．荧光显微镜评估转染效率,荧光定量RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达情况,western blot检测HIF-1α蛋白表达情况．结果:成功构建了3个靶点的重组质粒pGCsi- H1-shHIF,293T细胞平均转染效率为约85．4％, Eca-109细胞的平均转染效率约73．2％．荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染这3种重组质粒的293T细胞和筛选2 wk的Eca-109 细胞HIF-1 α mRNA和蛋白表达均较对照组有不同程度的下降,其中2号和3号靶点的干扰效应尤为明显．在瞬时转染72 h后的293T 细胞中,其抑制率分别达到了78．5％、86．9％ (P=0．000,P=0．000 vs 72 h空白对照组),筛选2 wk的Eca-109细胞中,3号靶点对HIF-1α mRNA的抑制率也达到了69．7％(P=0．000 vs 2 wk空白对照组)．结论:重组质粒pGCsi-shHIF能有效抑制食管鳞癌细胞Eca-109中HIF-1α基因的表达,经不同细胞中的瞬时和稳定转染筛选出了有效干扰靶位．     

Role of stress-activated MAP kinase P38 in cisplatin- and DTT-induced apoptosis of the esophageal carcinoma cell line Eca109

AIM: To study the role of P38 kinase in esophageal cancer cell apoptosis induced by genotoxin, cisplatin and the unfolded protein response (UPR) inducer, dithiothreitol (DTT). METHODS: Esophageal carcinoma cell line Eca109 was cultured in RPMI 1640 medium to 70% confluency and treated with either cisplatin, DTT, or cisplatin plus DTT in the presence or absence of P38 inhibitor, SB203580. The untreated cells served as the control. The esophageal carcinoma cell apoptosis was detected by agarose gel DNA ladder analysis and quantified by flow cytometry. The P38 phosphorylation was detected by immunohis-tochemistry using antibodies specific to phosphorylated P38 protein. RESULTS: (1) Both cisplatin and DTT induced apoptosis in the esophageal cancer cell line Eca109 as shown by DNA ladder formation; (2) As detected by antibodies specific for the phosphorylated P38 protein (p-P38), both cisplatin and DTT treatments activated the stress-activated enzyme, MAP kinase P38. The number of positive cells was about 50% for the treatment groups, comparing to that of 10% for untreated group. DTT treatment, but not cisplatin treatment, induces nuclear localization of p-P38; (3) As measured by flow cytometry, inhibition of P38 activity by SB203580 blocks DTT- and cisplatin-induced apoptosis. The rates for DTT, cisplatin, and DTT plus cisplatin-induced apoptosis were 16.8%, 17.1%, and 21.4%, respectively. Addition of the SB compound during the incubation reduced the apoptotic rate to about 7.6% for all the treatment groups, suggesting that P38 activation is essential for cisplatin- and DTT-induced apoptosis in Eca109 cells. CONCLUSION: (1) Both DTT and cisplatin were able to induce apoptosis in esophageal cancer cell line Eca109; (2) P38 MAP kinase is essential for DTT- and cisplatin- induced apoptosis in Eca109 cells; (3) P38 activation may be the common signaling component relaying the multiple upstream signaling events to the downstream cell death program.     

Mitochondrial pathway of the lysine demethylase 5C inhibitor CPI-455 in the Eca-109 esophageal squamous cell carcinoma cell line

BACKGROUNDEsophageal cancer is a malignant tumor of the digestive tract that is difficult to diagnose early. CPI-455 has been reported to inhibit various cancers, but its role in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is unknown.AIMTo investigate the effects and mechanism of the lysine demethylase 5C inhibitor, CPI-455, on ESCC cells.METHODSA methyl tetrazolium assay was used to detect the inhibitory effect of CPI-455 on the proliferation of Eca-109 cells. Apoptosis, reactive oxygen species (ROS), and mitochondrial membrane potential were assessed by flow cytometry. Laser confocal scanning and transmission electron microscopy were used to observe changes in Eca-109 cell morphology. The protein expression of P53, Bax, lysine-specific demethylase 5C (KDM5C), cleaved Caspase-9, and cleaved Caspase-3 were assayed by western blotting.RESULTSCompared with the control group, CPI-455 significantly inhibited Eca-109 cell proliferation. Gemcitabine inhibited Eca-109 cell proliferation in a concentration- and time-dependent manner. CPI-455 caused extensive alteration of the mitochondria, which appeared to have become atrophied. The cell membrane was weakly stained and the cytoplasmic structures were indistinct and disorganized, with serious cavitation when viewed by transmission electron microscopy. The flow cytometry and western blot results showed that, compared with the control group, the mitochondrial membrane potential was decreased and depolarized in Eca-109 cells treated with CPI-455. CPI-455 significantly upregulated the ROS content, P53, Bax, Caspase-9, and Caspase-3 protein expression in Eca-109 cells, whereas KDM5C expression was downregulated.CONCLUSIONCPI-455 inhibited Eca-109 cell proliferation via mitochondrial apoptosis by regulating the expression of related genes.