抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。     

人端粒酶反转录功能区基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

 目的表达并纯化出包含所有功能基序的端粒酶催化亚基(hTERT)融合蛋白,为深入研究端粒酶作用机制、制备抗hTERT抗体和肽库筛选以端粒酶为靶的小分子抑制剂奠定基础.方法自行设计引物,以pLPC-hTERT为模板扩增出包括端粒酶发挥反转录功能所需的全部8个基序长为1 310 bp的基因片段,将PCR扩增的此片段克隆至带有6个连续组氨酸标签的原核表达载体pET-32a中,IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE和Western-Blot(WB)检测确定表达出端粒酶反转录酶功能区融合蛋白,以8 M尿素溶解以包涵体形式存在的目的蛋白,用金属鳌合层析柱纯化融合蛋白并对之进行复性.结果经PCR、酶切、测序、SDS-PAGE和WB鉴定证实成功构建了表达质粒pET32a-hTERT,鉴定和测序结果亦证实包含全部8个基序的基因片段,凝胶电泳和WB确认表达出特异性的目的蛋白条带.结论成功构建pET32a-hTERT表达质粒,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得特异性的hTERT重组蛋白.     

基于细胞表面特异识别的荧光标记小分子抗体的鉴定及其应用

 目的 建立基于细胞表面特异性识别的荧光标记小分子抗体的鉴定方法并应用于食管癌外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)检测。方法 本研究前期利用噬菌体技术高通量筛选富集到单链噬菌体抗体NFC 20b和NFC 70a,标记荧光后,观察在斑马鱼体内与食管癌细胞的聚集示踪,并用于检测食管癌患者的外周血CTCs;同时通过高通量蛋白组芯片对抗原蛋白表达谱进行分析。结果 荧光小分子抗体NFC 20b和NFC 70a于不同时间点,在斑马鱼的背主动脉、尾动脉和尾静脉中均能观察到抗体分布,与空白组和阴性抗体组相比,两抗体与移植瘤结合荧光更强;用蛋白芯片筛选抗原蛋白表达谱,初步确定NFC 20b结合的抗原蛋白为细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)。结论 荧光标记的小分子抗体可以通过血液循环分布到斑马鱼的卵黄囊,并能与移植瘤有明显的聚集结合效应,可以用于检测食管癌患者外周血CTCs;利用蛋白芯片技术可以辅助鉴定抗体所结合的抗原种类。     

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建包含人前列腺干细胞抗原(PSCA)的原核表达质粒,并进行诱导表达、蛋白纯化及鉴定.方法 通过PCR扩增人PSCA基因片段,与过渡载体pGEM-T Easy连接后进行测序鉴定,鉴定正确后,将PSCA基因片段酶切并插入含有谷胱甘肽s-转移本科GST标签的原核表达载体pET42a,得到重组质粒pET42a-PSCA.将pET42a-PSCA转化大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达GST-PSCA融合蛋白,用Glutathione-Sepharose 4B柱对融合蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 PSCA基因的PCR产物大小与预期相符,测序结果与GenBank 中的PSCA序列一致.pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western blotting检测显示融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43kD.结论 成功构建了人PSCA的原核表达质粒,能在BL21菌株中表达,且纯化后得到较高纯度的GST-PSCA融合蛋白,为后续抗前列腺癌基因疫苗研究奠定了基础.     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活基因2(FTP2)的原核表达载体并诱导其表达,制备多克隆抗体并探讨其在临床病理组织中表达的意义。方法通过PCR获得HCVFTP2基因,将其克隆至原核表达载体pET32a( )上,构建重组表达载体,在大肠埃希菌BL21中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blotting验证后进行大量表达并纯化。将纯化的重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,并将此抗体作为诊断试剂观察其在正常肝组织和临床病理组织中的表达情况。结果以pET32a( )-FTP2表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得大量重组蛋白,分子量约为25kD。将此重组蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,经抗体间接ELISA检测证明,多克隆抗体效价>1:128000,免疫组化显示多克隆抗体能够与丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等临床病理组织产生FTP2抗原反应。结论成功表达了HCV的FTP2蛋白并制备了其多克隆抗体,证实FTP2与丙型肝炎、肝硬化的发病机制密切相关。     

小鼠固醇载体蛋白2原核表达载体的构建与表达纯化

目的 构建小鼠固醇载体蛋白2(SCP-2)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化获得具有活性的融合蛋白,为进一步研究SCP-2的生物学功能提供基础.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到鼠SCP-2编码序列,然后将该编码序列克隆到带有His标记的载体pET14b上,重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性,然后切取分子量正确的条带用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确.融合蛋白表达纯化后获得了分子量约59kD的融合蛋白,符合预期大小,并经质谱分析证明该融合蛋白的表达正确.结论 成功构建了带His标签的SCP-2原核表达载体,并成功表达及纯化出该融合蛋白,为深入研究SCP-2的相关生物学功能提供了一个重要的工具.     

霍乱弧菌外膜蛋白W的原核表达及抗原性分析

目的在大肠杆菌中表达霍乱弧菌种特异性外膜蛋白（Omp）W,纯化后制备检测用OmpW抗体。方法采用PCR法以霍乱弧菌基因组为模板扩增ompW基因,插入表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-32a-ompW;重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导获得目的蛋白,纯化后免疫新西兰大耳白兔,制备OmpW的多克隆抗体并进行鉴定。结果扩增得到ompW基因片段,并成功构建pET-32a-ompW原核表达系统,重组蛋白OmpW以包涵体形式高效表达;制备的OmpW抗体能与天然的O1群和O139群霍乱弧菌结合。结论霍乱弧菌OmpW可由原核系统高效表达,免疫获得的抗体具有较好的效价,为进一步制备霍乱弧菌检测用抗体奠定基础。     

胰高血糖素样多肽-2的重组表达及鉴定

目的:构建胰高血糖素样多肽 - 2(GLP - 2)原核表达载体,在大肠杆菌BLR(DE3)中表达,为胰GLP - 2的作用机制的探究奠定基础.方法:人工合成GLP - 2序列,磷酸化后连接到质粒pET31b(+),构建成功的质粒GLP - 2/pET31b(+)转化至BLR(DE3)进行诱导表达,优化条件获得最大表达产量;纯化重组蛋白,溴化氰裂解蛋白获得单体蛋白,SDS - PAGE、Western blotting鉴定重组蛋白.结果:成功合成GLP - 2序列,与Genebank收录序列一致;构建原核表达质粒GLP - 2/pET31b(+),测序成功;37℃,OD600 nm为0.8时,加入1 mmol/L的IPTG诱导表达获取较纯的GLP - 2重组蛋白产量较高,溴化氰裂解获得了蛋白的单体.结论:成功构建GLP - 2原核表达载体,该蛋白具有生物活性.确定了优化表达条件,获得了具有生物活性的GLP - 2单体蛋白,为进一步研究奠定基础.     

无POU域八聚体结合蛋白基因的克隆及其在Hepa1-6细胞内的表达

目的构建小鼠无POU域八聚体结合蛋白(non-POU-domain-containing,octamer binding protein,NonO)真核表达载体并在小鼠Hepa 1-6肝癌细胞内表达,观察NonO胞内表达、定位及脂多糖(LPS)对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA,RT-PCR扩增小鼠NonO基因的蛋白编码序列。采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中,将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞,通过细胞免疫荧光方法观察NonO的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;细胞免疫荧光可见NonO在Hepa 1-6细胞内表达、分布于细胞核,LPS刺激后NonO分布无明显变化。结论成功构建NonO真核表达载体,为研究NonO在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体。进一步证实NonO为定位于细胞核的核蛋白。     

大鼠严重烧伤早期血浆TM/PC/PS的动态变化

目的　旨在初步探讨大鼠严重烧伤早期 (伤后 2 4小时 )血栓调节蛋白、蛋白C和蛋白S的动态变化。方法　采用大鼠TBSA 3 0 %III度烧伤模型 ,随机分为烧伤组和正常对照组 ,观察大鼠烧伤后 1,3 ,6,12 ,2 4小时血栓调节蛋白、蛋白C和蛋白S血浆水平的变化。结果　大鼠烧伤后 1小时血浆血栓调节蛋白水平开始升高 ,于伤后 3小时达到峰值 ,以后逐渐下降 ,至伤后 2 4小时仍高于正常对照组。大鼠烧伤后血浆蛋白C水平在伤后 3小时有一短暂上升过程 ,此后逐渐下降 ,至 2 4小时降至最低水平。大鼠烧伤后 2 4小时内总蛋白S血浆水平持续低于正常对照组。结论　大鼠严重烧伤早期血栓调节蛋白 蛋白C 蛋白S抗凝途径发生显著变化 ,它不仅是烧伤早期血管内皮受损的标志 ,而且可能参与了严重烧伤后血栓和DIC的形成。     

脑蛋白水解物动物长期毒性实验

目的观察脑蛋白水解物对动物的毒性作用。方法按常规方法用犬和大鼠进行长期毒性实验。结果用药动物体重、主要器官重量、血液学指标均在正常范围内,血液生化学指标及组织病理学检查与对照组无明显差异。结论脑蛋白水解物无毒副作用。     

脑蛋白水解物的一般药理研究

目的：对脑蛋白水解物进行一般药理学研究。方法：按常规药理学研究方法观察脑蛋白水解物对动物精神活动，神经系统，心血管系统，呼吸系统的影响。结果：在小鼠腹腔和大鼠静脉注射人临床等效剂量的脑蛋白水解物后，动物的精神，神经系统，心血管系统均无影响。结论：脑蛋白水解物对动物无任何毒副作用。     

腹膜透析中的蛋白质丢失

观察了腹膜透析患者33例的蛋白质丢失情况,发现个体差异较大。所丢失蛋白质的多少与透析方式、透析时间、透析液含糖浓度、是否应用血管活性物质以及是否合并有腹膜炎等因素有关;而与患者的年龄、性别、体表面积、血浆蛋白浓度以及大多数基础病因关系不大。此外还发现,各种蛋白质丢失的量与该蛋白质分子量的大小密切相关:即蛋白质的分子量越小,则该蛋白进入透析液内的量越多。     

早期复发性流产患者血浆D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、蛋白S活性变化及分析

目的探讨早期复发性流产患者血浆D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、蛋白S活性变化情况。方法选择稽留流产且既往无流产史的患者70例为稽留流产组;稽留流产且既往有2次以上稽留流产史的患者50例为复发性流产组;选择同期行人流术且既往无流产史的患者60例为正常早孕组。对3组患者的血浆D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、蛋白S活性进行检测并比较。结果稽留流产组与正常早孕组比较,血浆D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、蛋白S活性无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);复发性流产组与稽留流产组及正常早孕组比较,D-二聚体水平明显升高,抗凝血酶Ⅲ活性、蛋白S、蛋白C明显降低,组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论复发性自然流产患者存在血栓形成倾向,血浆D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、蛋白C和蛋白S检测可预测其血栓形成事件的可能性,改善妊娠结局。     

染料结合法测定脑脊液蛋白的实验研究

 目的建立一种简便、快速、准确的分光,测定脑脊液蛋白.方法在非离子去垢剂Brij-35存在下,用伊红Y溶液作显色剂与蛋白质结合呈色.结果颜色复合物的最大吸收峰为540 nm,呈色时间10 min,显色稳定,可达2 h,线性范围可达1 000 mg/L,回收率平均值为97.4%,精密度良好,批内精度CV%为0.92%～3.35%,批间精度CV%为1.37%～3.26%.结论该法与磺基水杨酸-硫酸钠比浊法相比要简便、快速,且所需样本量小,不需特殊试剂和仪器,适宜临床常规测定.     

飞行员加速度耐力与Gz暴露后眼房水蛋白含量变化的关系

目的查明飞行员离心机加速度负荷前后眼前房蛋白含量的变化与加速度耐力之间的关系。方法歼击机飞行员42例，男性，20－35岁。采用63型载人离心机检测其加速度耐力，耐受＋Gz值＞4．25G，峰值恒速时间＞10s为加速度耐力良好；低于此限者为加速度耐力不良。眼前房蛋白含量检测采用日本产KowaFC－1000型激光蛋白细胞检测仪。加速度负荷前后各检测一次。结果加速度耐力不良的飞行员，加速度负荷后房水蛋白含量（6．20±0．52Photoncount／ms）较加速度负荷前（4．36±0．65photoncount／ms）升高（P＜0．05）。而加速度耐力良好的飞行员，加速度负荷前后服房水蛋白含量无显著性差异（P＞0．05）。结论眼前房蛋白含量的变化，在加速度耐力检测中出现较早也较敏感，利用这项指标可能有助于客观判定加速度耐力。     

SELDI蛋白指纹技术检测脑损伤大鼠海马差异蛋白

 目的 分析大鼠脑损伤后海马中蛋白质表达谱的变化. 方法采用弱阳离子交换芯片(WCX-2)和金属亲和吸附芯片(IMAC3)结合表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术分析大鼠闭合性脑损伤后4、8、12、24、48 h海马中蛋白质表达谱的改变.结果 WCX-2芯片在海马中共获得364个蛋白质峰;IMAC-Cu芯片共获得345个蛋白质峰.与手术对照组相比,脑损伤后两种芯片共检测到163个蛋白质表达增高,17个蛋白质表达降低.在WCX-2芯片上,损伤组共有37个蛋白质峰的相对强度与手术对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);在IMAC-Cu芯片上,损伤组共有12个蛋白质峰的相对强度与手术对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论脑损伤可引起海马中蛋白质表达谱发生变化.