巢式MS-PCR法检测恶性血液病细胞株APC基因启动子甲基化状态

本研究旨在应用巢式甲基化特异性PCR（nMS—PCR）法检测10种恶性血液系统肿瘤细胞株APC基因启动子的甲基化状态,并探究其在肿瘤发生发展中的作用,同时筛选出APC基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,将其作为研究基因甲基化与表达关系的细胞模型。采用nMS—PCR扩增亚硫酸盐修饰后的10种肿瘤细胞株基因组DNA,检测其APC基因启动予区CpG岛的甲基化状态。结果表明,CA46、U266、Molt4、K562、HL-60、CEM、AKR、U937、Raji细胞的APC基因启动子区均未甲基化,而Jurkat细胞的APC基因启动子区出现甲基化。结论：用nMS—PCR可以准确地检测出恶性血液病细胞株APC基因的甲基化状态,该方法操作简便,可用于检测各种肿瘤细胞基因的甲基化状态。     

抑癌基因APC启动子甲基化检测及其在肺癌诊断中的应用

目的　建立抑癌基因APC启动子部位甲基化的检测方法 ,并对肺癌临床样品进行初步检测研究。方法 :对肺癌组织提取的DNA及转甲基后的脐带血DNA进行化学修饰 ,以甲基化特异性引物进行基因扩增 (methylationspecificPCR ,MSP)和甲基化序列分析 (methylationsequencing ,MS)。结果 :经转甲基的人脐带血DNA样品MSP检测为阳性 ,其序列与预期相符 ,未经转甲基样品为阴性。 17例肺癌患者的肿瘤及其正常肺组织APC甲基化检测阳性率分别为 4 7% (8/ 17)和 18% (3/ 17) ,1例肺部良性肿瘤及其正常肺组织的检测结果均为阴性 ;对MSP检测为阴性的 9例肺癌患者肿瘤及其正常肺组织进行MS检测分析 ,有 4例APC启动子部位存在CpG甲基化。结论 :利用MSP和MS两种甲基化检测分析手段 ,对 17例临床确诊肺癌组织的检测总阳性率可达 71% (12 / 17)。MSP操作简便 ,价格低廉 ,可适合于大规模肿瘤患者样本的筛查 ;而对于MSP检测为阴性的临床样品 ,可以利用MS进行进一步的确认 ,为临床肺癌诊断提供更准确的信息。     

不同甲基化检测技术对模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化的检测

目的 研究模拟肺癌患者血浆DNA中APC基因甲基化最低检测限,确定不同甲基化检测技术在早期肺癌诊断中的价值.方法 用普通甲基化特异性基因扩增（methylation specific PCR,MSP）方法检测肺癌细胞株NCI-H460细胞APC基因,以酚-氯仿经典方法提取NCI-H460细胞DNA,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入相同的健康人血浆200μl中去,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟血浆样本中提取血浆DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以Sybr-Green Ⅰ为染料进行实时荧光定量MSP检测,同时进行普通MSP检测.结果 NCI-H460细胞中的APC基因启动子1A区719位点存在甲基化,实时荧光定量MSP检测模拟肺癌患者血浆APC基因甲基化的最低检测限为在200 μl血浆中能检测出10^2个肿瘤细胞的DNA,而以普通MSP检测,200 μl血浆中需投入10^3个以上肿瘤细胞的DNA才有弱阳性条带.实时荧光定量MSP检测技术比普通MSP检测的敏感性至少高出10倍.结论 实时荧光定量MSP比普通MSP检测灵敏度高,该技术用于肺癌患者血浆DNA甲基化检测,可能有助于肺癌早期诊断.     

血浆中APC基因甲基化检测在早期肺癌诊断中的应用

目的 研究血浆DNA中APC基因启动子甲基化与肺部实体瘤良、恶性的关系,确定血浆中APC基因甲基化检测对早期肺癌诊断的意义.方法 以92例CT检查发现肺部实体瘤(直径≤2 cm),并在CT引导下行肺部穿刺患者和23例健康人作为研究对象,收集血浆样本,利用磁珠法提取DNA,行亚硫酸氢盐化学修饰后,采用针对APC基因启动子区的甲基化引物和探针,以荧光定量MSP法(TaqMan探针)检测APC基因的甲基化.结果 92例肺部实体瘤患者经病理诊断,有58例确诊为肺癌、31例为肺部良性疾病、3例未明确诊断.58例肺癌患者中有11例(19%)测出APC基因启动子区甲基化阳性,31例肺部良性疾病、3例未明确诊断和23例健康对照组均为阴性.结论 检测血浆DNA中APC基因启动子甲基化有助于早期肺癌的诊断.     

甲基化特异性基因扩增检测过程中的质量控制

目的构建adenomatous polyposis coli(APC)基因启动子1A的甲基化阳性质粒标准品,对甲基化特异性基因扩增(meth-ylation specific PCR,MSP)的检测灵敏度进行质量控制.方法对脐血淋巴细胞DNA转甲基并化学修饰,制备甲基化阳性和阴性模板,MSP后获得目的片段,克隆到pMD18-T质粒载体,测序筛选阳性和阴性质粒标准品,紫外分光法对标准品定量,对10倍梯度稀释的质粒进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR来获得弱阳性质控品,对36份组织样本进行MSP检测.结果将MSP后电泳能显示的质粒(105拷贝/ml)作为弱阳性质控品.在加入弱阳性质控品后,2例阴性的样本最终定为阳性;11例未定结果的样本最终7例定为阳性,4例定为阴性.36例样本无质控品前的甲基化阳性率为25%,有质控品后的阳性率为50%,两次结果差异显著(P=0.001).结论构建了携带甲基化阳性的APC基因启动子的质粒标准品并制备了低拷贝的弱阳性质控品,可以对MSP检测灵敏度进行质量控制,降低了检测的假阴性率.     

APC、P16基因甲基化与肝细胞癌关系的Meta分析

目的应用Meta分析的方法评价APC基因和P16基因甲基化与肝细胞癌(HCC)的关系。方法检索1978～2011年在Medline、Pubmed等数据库及1994～2011年在中国知网和万方数据库收录的所有有关P16、APC基因甲基化与HCC病例对照研究文献,按纳入与排除标准筛选文献,并用RevMan 5.0软件进行统计分析。结果纳入国内外标准的16篇数据合并结果显示,APC基因甲基化病例组488例,对照组HCC患者肿瘤组织434例,其中HCC癌旁组织390例,非肿瘤肝病患者组织21例,健康人组织23例;HCC组与癌旁组织组合并的有效率的比值比(OR)=5.91,95%CI为4.20%～8.31%;HCC肿瘤组与正常组织组OR=35.19,95%CI:6.00%～206.33%。P16甲基化病例组HCC患者肿瘤组织400例,对照组共437例,其中HCC癌旁组织398例,非肿瘤肝病患者组织21例,健康人组织18例。HCC组与癌旁组织组的OR=5.69,95%CI:3.96%～8.19%,HCC肿瘤组与正常组织组OR=12.18,95%CI:2.56%～58.03%。结论 APC、P16基因的高甲基化导致了该基因的失活,与HCC的发生和发展有密切关系。     

ID4基因甲基化定量PCR检测在急性白血病中的临床意义

尽管治疗的进步极大地改善了急性白血病患者的预后和生存,但时至今日多数类型的急性白血病没有特异性的生物标记,因此对于多数白血病患者,影响生存的复发这一重要因素缺少有效的预警机制。删基因启动子区甲基化广泛发生于各类型急性白血病。本研究在前期建立的甲基化定量PCR体系的基础上,用该方法检测患者骨髓样本,探讨ID4甲基化定量指标（percentageofmethylatedreference,PMR）的临床意义。采集我院门诊及住院确诊的初治、完全缓解、复发3个阶段的急性白血病患者骨髓样本及正常对照者骨髓样本。应用ID4甲基化定量PCR体系对样本进行检测。按初治、完全缓解、复发分组比较PMR值。比较相同病例不同疾病状态的PMR的动态变化。结果表明,初治组PMR最高,其次为复发组,而完全缓解组最低。初治组PMR与完全缓解组比较存在统计学差异。4例随访病例的PMR值波动与病情变化一致。在1例复发病例中,PMR升高早于骨髓细胞学检查确认复发1．7个月。结论：本研究通过1／94基因启动子区甲基定量检测的方法初步验证：甲基化水平的量化指标PMR值与急性白血病患者肿瘤细胞负荷关系密切。PMR动态监测波动与疾病变化一致,可能具有预测复发的作用,但IIM甲基化定量指标的临床价值还有待进一步研究证据的支持。     

Syk基因启动子甲基化与肿瘤

随着表遗传学的发展，人们认识到肿瘤不仅仅是遗传性疾病，同时也是由DNA甲基化作用引起的转录沉默的表遗传性疾病。肿瘤中的表遗传改变主要包括普遍性低甲基化、个别基因的低甲基化、区域性CpG岛的高甲基化以及印记丢失。     

实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的 建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法.方法 以肺癌细胞株NCI-H460作为RAssF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200 μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆.用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测.以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量.结果 实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆).15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%).5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml.结论 实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强.     

实时荧光定量PCR检测人肺癌p16基因启动子异常甲基化阳性参比物的研究

我国肺癌发病率较高，且5年生存率仅有6％～16％，早期发现和治疗可使5年存活率提高到60％-90％。研究证明，p16基因启动子区域的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸岛（CpG岛）异常甲基化在肿瘤发生组织增生和化生阶段已出现，故对肺癌的早期诊断具有很大价值。因此，本研究用实时荧光定量PCR方法检测p16基因甲基化，以寻找敏感、特异的肺癌诊断标志，这对肺癌早期诊断和预后观察以及高危人群筛查都有重要意义。     

非小细胞肺癌组织中抑癌基因APC表达的研究

目的探讨非小细胞肺癌组织中APC基因mRNA转录水平。方法采用RT-PCR技术,以SybrgreenⅠ为荧光染料,beta-actin基因为内参照,对17例临床确诊的非小细胞肺癌病例的正常肺组织和肿瘤组织的APC基因mRNA进行实时荧光定量检测。计算每份标本Ct(APC)/Ct(beta-actin)比值,比较每份病例正常肺组织和肿瘤组织比值之间的差值(d),配对t检验。结果在17例病例中,APCmRNA在肺癌组织中的表达较正常肺组织明显降低(d=-0.29,P<0.05)。结论肺癌患者正常肺组织和肿瘤组织APC基因转录存在明显差异,肺癌组织APC基因转录水平降低。     

上皮卵巢癌细胞系LncRNAs、mRNAs表达谱基因芯片分析

目的通过基因芯片分析上皮卵巢癌细胞系中差异表达的Lnc RNAs、m RNAs表达谱,为研究上皮卵巢癌相关Lnc RNAs的功能提供实验依据。方法采用基因芯片分析上皮卵巢癌细胞系A2780、HO8910、SKOV3与卵巢上皮细胞系HOSEpi C中Lnc RNAs和m RNAs的表达差异;对差异表达的m RNAs进行KEGG通路富集分析;用q RT-PCR在上皮卵巢癌细胞系及卵巢上皮细胞系中验证差异明显的6条Lnc RNAs的表达水平。结果基因芯片结果发现在3个肿瘤细胞系中上调的Lnc RNAs有227条,下调的有483条;3个上皮卵巢癌细胞系中差异表达的m RNAs主要富集在PI3K-AKT、m TOR及TNF-α等肿瘤相关通路中(P0.05);PTPRG-AS1、CCNT2-AS1、XLOC_009869、LINC01138在上皮卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、和OVCR3中表达上调(P0.05);RP11-252P19.2、RP11-744I24.2在上皮卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、HO8910、OVCR3和3AO中表达下调(P0.05)。结论基因芯片筛选出在上皮卵巢癌细胞系中差异表达的Lnc RNAs和m RNAs,差异表达m RNAs与PI3K-AKT、m TOR及TNF-α等肿瘤通路有关,有望为卵巢癌的诊断及治疗提供新的靶点。     

APC、P53基因突变与内镜下早期大肠癌分型的关系

目的　探讨内镜下早期大肠癌的分型与APC、P5 3基因突变的关系。方法　应用PCR SSCP方法对本院内镜下及病理诊断的5 4例早期大肠癌患者的APC及P5 3基因突变进行检测,并对内镜下的不同形态大肠早期癌分组进行比较。结果　隆起型(Ⅰ型)和表面隆起型(Ⅱa型)组与表面平坦型(Ⅱb型)、表面凹陷型(Ⅱc型)、还有混合型(Ⅱa Ⅱc和Ⅱc Ⅱa型)组进行比较,APC基因的突变率明显增高,存在显著差异(P <0 . 0 5 ) ,而P5 3基因的突变率在两组间没有显著差异。结论　我们推测平坦及凹陷型的表浅型早期大肠癌与隆起型有不同的基因突变途径。     

甲基化在肺癌中的意义

目的探讨基因T-钙黏蛋白(CDH13)在40例癌组织,40例的癌旁组织标本和非肺癌良性肺切除组织标本15例作为对照的表达的临床意义,进一步研究其基因异常甲基化与肺癌的相关性。方法采用特异性甲基化PCR(MSP)检测该基因在肺癌组织中异常甲基化的水平。结果 1.在肺癌组织中CDH13基因甲基化率明显高于癌旁组织和非肺癌良性肺切除组织,甲基化率分别为32.5%、7.5%、6.7%,有统计学意义(P<0.05)。2.CDH13基因异常甲基化和CDH13的表达水平呈负相关性(r=-0.520).3.CDH13基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性率在肺癌组织中显著高于癌旁组织和非肺癌良性肺切除组织,CDH13基因启动子区5’CpG岛甲基化导致了CDH13的表达下调。结论在肺癌组织中CDH13基因异常甲基化率明显升高且有临床诊断意义,CDH13基因在癌组织中的异常甲基化水平将有望成为肺癌新的治疗靶点。     

358例肺癌患者K-ras基因的突变分析

目的分析358例肺癌患者K-ras基因突变的突变情况,为肺癌患者的个体化治疗提供指导。方法通过嵌套和低变性温度下的复合PCR(COLD-PCR)-测序法分析358例肺癌患者K-ras基因突变状态。结果在358例肺癌患者中,K-ras基因总体突变率为8.10%。94份血浆标本、250份肿瘤组织标本、14份胸腔积液及腹水标本中的突变率分别为2.13%、9.60%、7.14%。突变类型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H,3种不同标本之间K-ras基因的突变率比较,差异无统计学意义(P=0.064 8);男性与女性患者的突变率分别为6.96%、8.59%,差异无统计学意义(P=0.574 0);30~45岁、45~60岁、大于或等于60岁患者中的突变率分别为4.76%、5.34%、9.22%,不同年龄段患者K-ras基因的突变率比较,差异无统计学意义(P=0.250 3)。结论肺癌患者K-ras基因突变类型主要为G12C、G12D、G12V、G13D,K-ras基因在不同标本类型、不同性别、不同年龄之间的突变率无明显差异。     

非小细胞肺癌血清8个抑癌基因启动子CpG岛甲基化的联合检测及意义

目的：探讨非小细胞肺癌患者血清中8个抑癌基因启动子C pG岛甲基化的联合检测在诊断非小细胞肺癌患者中的意义,以期提高非小细胞肺癌早期无创检出率,提升治愈率。方法选取62例非小细胞肺癌患者设为肺癌组,选取30例肺部良性疾病患者作为对照组,选取16例健康者作为健康组,取3个组研究对象的血清采取癌基因测序法检测8种基因启动子区域甲基化情况,比较3个组研究对象的上述指标,分析上述指标的变化和3个组研究对象不同临床状态的相关性。结果肺组结肠腺瘤性息肉病基因（A PC ）、钙粘蛋白13（CD H 13）、死亡相关蛋白激酶基因（DAPK）、人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）、RAS相关区域家族 F2（RASSF2）、人类Runt相关转录因子3（RUNX3）、RAS相关区域家族1A （RASSF1A）和TMS1/ASC基因甲基化检出率均明显高于对照组,组间比较差异具有统计学意义（P＜0．05）,非小细胞肺癌患者血清中抑癌基因8个指标联合检测敏感性达到93．54％,特异性达到90．3％,敏感性明显高于所有单项检测和4个指标联合检测。结论 A PC、CD H 13等8个抑癌基因异常甲基化状态的联合检测可以明显提高非小细胞肺癌患者抑癌基因甲基化的检出率。该8个基因异常甲基化有望成为非小细胞肺癌辅助诊断和预后判断的分子标记,并有可能成为非小细胞肺癌治疗的新靶点,从而提高临床对非小细胞肺癌患者的诊治水平。     

骨髓增生异常综合征降钙素基因甲基化的定量研究

目的：探讨降钙素（ＣＴ）基因高甲基化能否作为骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）向白血病转化的分子标志。方法：采用设有内、外参照的多聚酶链反应（ＰＣＲ），结合限制性内切酶和激光扫描技术，检测２７例ＭＤＳ和６例由ＭＤＳ转化的急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）患者骨髓细胞的ＣＴ基因５′端甲基化率（ＣＴＭＲ）。结果：ＭＤＳ患者ＣＴＭＲ为３３．６５％±２３．３７％，显著高于对照组（８．０１％±４．２５％，Ｐ＜０．００１），其中ＲＡＥＢｔ组显著高于对照组和ＲＡ组，已随访３～１０年的ＲＡ患者５例均在正常范围，且无白血病转化。９例ＲＡＥＢｔ的ＣＴＭＲ均＞３０％，随访８例中７例于２个月内转化为ＡＭＬ。结论：ＣＴＭＲ对早期预测ＭＤＳ向白血病转化可能是一个有用的指标。