壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究**

背景：非病毒载体因其安全性好而在基因治疗领域赢得了广泛的关注,各种各样的非病毒载体处在不断的研究中,壳聚糖季铵盐作为一种新的生物材料,同样也具有作为基因递送载体的潜质。 目的：考察壳聚糖季铵盐体外基因转染活性,寻求一种新的非病毒基因载体递送系统。 设计、时间及单位：对比观察实验,于2008-04/12在浙江省医学科学院生物工程所完成。 材料：质粒pcDNA3.1-EGFP为浙江省医学科学院生物工程实验室保存。以3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵作为改性剂制备壳聚糖季铵盐,用复凝聚法制备载基因纳米粒。 方法：凝胶阻滞实验分析壳聚糖季铵盐包裹质粒的能力,DNase I的保护实验分析载基因纳米粒的抵抗核酸酶降解的能力,体外基因转染实验评价纳米粒的体外转染活性,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪测定转染结果。通过考察转染液中有无牛血清和递送不同剂量的基因对转染效率的影响,寻求本递送系统较好的转染条件。另外,用MTT法测定壳聚糖季铵盐的细胞毒性。 主要观察指标：壳聚糖季铵盐和pcDNA 3.1-EGFP以何种比例结合形成的纳米粒、转染液中有无牛血清,质粒的量为多少时对人胚肾T细胞的转染效率是最高的;不同浓度的壳聚糖季铵盐对细胞生长的影响。 结果：壳聚糖季铵盐纳米粒能转入人胚肾T细胞,虽然转染效率略逊于聚乙烯亚胺,但是细胞毒性明显小于聚乙烯亚胺。壳聚糖季铵盐纳米粒转染细胞72 h后效率较高,经综合分析,当pcDNA质量为2 μg,壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为5结合形成的纳米粒,在无血清条件下对人胚肾T细胞进行转染,转染效率是最高的。 结论：壳聚糖季铵盐纳米粒能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达。因此,壳聚糖季铵盐用做基因递送的载体系统值得进一步的研究。     

叶酸-壳聚糖介导survivin shRNA基因纳米载体的制备***★

背景：叶酸-壳聚糖纳米粒是一种新型的高靶向纳米载体，可进一步提高药物的靶向性，并进一步实现缓释和控释给药。 目的：探讨叶酸-壳聚糖纳米粒作为survivin shRNA重组质粒载体传递系统的可行性以及对大肠癌细胞(SW480)的转染效率。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2008-06/2009-01在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成。 材料：壳聚糖(脱乙酰度>90%)由上海伯奥生物科技有限公司提供，叶酸由国药集团化学试剂有限公司提供，survivin shRNA重组质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。 方法：首先制备粒径均匀的叶酸偶联壳聚糖纳米粒，然后将20 mg/L survivin shRNA重组质粒和10 mg/L 叶酸-壳聚糖混合制备基因纳米复合物，同时以阳离子脂质体基因复合物作为对照，将上述两者转染大肠癌细胞。 主要观察指标：基因纳米复合物的理化性质及转染效率；Western blotting检测转染后肿瘤细胞中survivin蛋白的表达。 结果：成功制备叶酸-壳聚糖介导的survivin shRNA重组质粒基因纳米复合物。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的效果强于阳离子脂质体基因复合物。且转染后大肠癌细胞中survivin蛋白的表达显著低于阳离子脂质体基因复合物。 结论：叶酸-壳聚糖纳米粒作为载体系统能将survivin shRNA重组质粒高效递送到大肠癌细胞，从而诱导人大肠癌细胞的凋亡。     

包裹pcDNA3.1（-）/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒的制备以及特性研究

摘要 背景：壳聚糖是生物可降解性天然多糖，其生物相容性好，安全无毒，故而在基因成为基因传递方面展现巨大潜力。 目的：采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒，观察研究其相关特性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2009-02/2009-08在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成。 材料：pcDNA3.1（-）/MAGE-3-HSP70由国家卫生部纳米生物技术重点实验室构建，壳聚糖 (批号060306，上海伯奥生物科技有限公司,脱乙酰度>90.0%,粘度<100cps) ，B16细胞由中南大学肿瘤研究所惠赠。 方法：采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒，将壳聚糖基因纳米粒转染B16细胞，利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测体外转染效果；应用噻唑蓝(MTT)评价壳聚糖基因纳米粒子的体外细胞毒性。 主要观察指标：激光粒度仪测定壳聚糖基因纳米粒径、Zeta电位；紫外分光光度计检测包封率；凝胶阻滞实验观察壳聚糖和质粒DNA的聚合；DNaseⅠ的保护试验分析壳聚糖基因纳米粒抗核酸酶降解能力。 结果：壳聚糖基因纳米粒的平均粒径约为223 nm,zeta电位为16mV; DNA包封率为92.3%，B16细胞转染实验显示其效率与Lipofectamine 2000相近, 而其毒性远低于Lipofectamine 2000。 结论：壳聚糖纳米粒子可高效装载质粒DNA转染B16细胞,而且对细胞基本无毒。     

内吗啡肽-1类似物HDAPC聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的镇痛活性

采用界面聚合法制备聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒，吸附药物内吗啡肽-1类似物HDAPC后孵育包衣聚山梨酯80。采用透射电镜观测纳米粒粒径为(150.00±9.75) nm，高效液相色谱法测定包封率为(87.64±3.02)%。静脉注射后小鼠甩尾镇痛法检测镇痛效果，包衣聚山梨酯80的HDAPC-NP-P80比HDAPC及未包衣聚山梨酯80的HDAPC-NP镇痛效果更有效，最大镇痛时间延后在12.5 min，最大可能效应百分数达100，剂量减半在同样时间点最大可能效应百分数也能达到76.64。结果提示纳米粒是一种有效的将肽类药物传递进入大脑的载体，空白纳米粒吸附药物后，必须包衣聚山梨酯80才有镇痛增强的效果。     

负载紫杉醇壳聚糖纳米粒的制备、表征与释药性能

背景：紫杉醇是一种天然抗肿瘤药物,但其水溶性极低。壳聚糖经接枝改性，生成的共聚物可在液相中生成纳米粒，可用于药物的缓释和控释。 目的：对制备的负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒进行表征，分析其体外药物释放能力。 设计、时间及地点：重复测量设计，于2008-01/07在华北煤炭医学院医学系实验室完成。 材料：壳聚糖，平均相对分子质量为2.0×105，脱乙酰度为92%，为浙江省玉环海洋生物化学有限公司产品。紫杉醇，批号082329802，为中国药品生物制品检定所产品。 方法：采用引发接枝效率高、引发反应条件温和的二羟基二过碘酸合镍钾为引发剂，在壳聚糖上接枝醋酸乙烯酯，该聚合物在水溶液中直接生成具有疏水核心、亲水表面的纳米粒，即壳聚糖纳米粒，再利用超声振荡技术将0.5~5.0 mg紫杉醇与上述纳米粒混合制成负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒。 主要观察指标：激光粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径大小、粒径分布及Zeta电位，透射电镜观察纳米颗粒的外观形态，高效液相色谱法分析负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒的包封率、载药量和释药性能。 结果：壳聚糖纳米粒和负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒，其粒径分别为196.2 nm和320.8 nm，粒径分布较窄，纳米粒表面均带正电荷，Zeta电位比较差异无显著性意义（F=0.818，F=3.38，P均>0.05）。稳定的纳米粒呈球形，粒径均匀。紫杉醇的加入量可影响纳米粒的包封率，紫杉醇的加入量为纳米粒的量2%时，达到最大包封率93.6%。体外模拟释药结果表明药物释放曲线分为两个阶段，突释阶段微球释药量在24 h内达48.3%，缓释阶段微球释药持续时间长，在175 h时释药量达75.9%，载药纳米粒的药物释放速率持续稳定。 结论：接枝共聚法制备壳聚糖纳米粒简便可靠，负载紫杉醇后纳米粒径明显变大，表面带有正电荷，且纳米粒对紫杉醇有很高的包封率，体外释药具有明显的缓释作用。     

普朗尼克P85修饰的苯妥英钠纳米粒对颞叶内侧癫痫大鼠模型的脑靶向作用

目的观察普朗尼克P85修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯构建的苯妥英钠纳米粒能否避开颞叶内侧癫痫大鼠模型脑中P糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)的外排作用将苯妥英钠靶向输送到脑组织中。方法锂-匹罗卡品诱导大鼠形成慢性颞叶内侧癫痫模型。免疫组化检测脑组织中Pgp的表达水平。界面聚合法制备苯妥英钠纳米粒,与普通苯妥英钠比较,观察两组不同给药的模型鼠(苯妥英钠纳米粒组6只,普通苯妥英钠组7只)在给药后30、60、120、180、240、300 min时其脑组织中苯妥英钠的药物分布情况。采用立体定向活体微透析技术采集脑微透析液,高效液相色谱法检测待测标本中苯妥英钠的药物浓度。结果两组不同给药的模型鼠的脑/血浆的时间药物浓度曲线的曲线下面积比值差异有统计学意义[即苯妥英钠纳米粒组(0.37±0.10,n=6)明显高于普通苯妥英钠组(0.19±0.06,n=7),P0.05]。与正常大鼠相比,模型鼠海马CA1、CA3及DG区Pgp表达上调。结论普朗尼克P85修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒可显著地提高抗癫痫药物苯妥英钠靶向进入Pgp高表达的颞叶内侧癫痫模型鼠脑中的浓度。     

紫杉醇-聚氰基丙烯酸二乙酯纳米胶束载体材料的可接受效应

背景：目前研究使用的聚氰基丙烯酸烷基酯,在降解过程中生成了醛类化合物,易导致一定程度的毒性与刺激作用。课题组在氰基丙烯酸酯单体中引入乙二醇取代基,合成一种新的与人体细胞结构更相容的纳米胶束载体材料—聚氰基丙烯酸乙二酯聚合物,作为脂溶性药物载体具有光明的应用前景。 目的：以聚氰基丙烯酸乙二酯聚合物为载体,制备紫杉醇-聚氰基丙烯酸二乙酯纳米胶束,验证其用于小鼠乳腺癌治疗的可接受性。 方法：超声乳化法制备不同粒径紫杉醇-聚氰基丙烯酸二乙酯纳米胶束并进行表征;建立BablC小鼠乳腺癌动物模型,分为生理盐水组和空白纳米胶束组,紫素阳性对照组,高、中、低3个紫杉醇-聚氰基丙烯酸纳米胶束剂量治疗组。对瘤体进行局部注射给药,检测紫杉醇-聚氰基丙烯酸二乙酯纳米胶束对肿瘤的抑制效果。 结果与结论：紫杉醇-聚氰基丙烯酸二乙酯纳米胶束平均粒径70 nm,药物含量为19.89%,药物体外释放能够持续达到2周以上时间。动物实验表明,在相当紫杉醇总量为30,60,90 mg/kg的3种剂量下,紫杉醇-聚氰基丙烯酸二乙酯纳米胶束给药组与生理盐水组相比具有明显的抑瘤效果(P < 0.001),抑瘤率分别为68.49%,77.03%和81.87%。提示紫杉醇-聚氰基丙烯酸二乙酯纳米胶束作为小鼠乳腺癌治疗的缓释制剂治疗效果显著,具有良好的可接受性。 关键词：紫杉醇;聚氰基丙烯酸二乙酯;纳米胶束;乳腺癌动物模型;缓释制剂;药物控释系统及其载体材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.08.015     

两亲性壳聚糖衍生物负载及缓释醋酸曲安奈德的性能

背景：醋酸曲安奈德是一种长效肾上腺糖皮质激素，具有较强的抗炎作用。近年来在眼内疾病的治疗中取得了较好的效果，但同时带来一些不良反应，且需多次注射，以防止疾病复发。壳聚糖经接枝改性，生成的共聚物可在水溶液中生成纳米粒，用于药物的缓释载体，延长药物作用时间，降低不良反应，提高生物利用度。 目的：合成含脱氧胆酸基团的两亲性壳聚糖衍生物作为醋酸曲安奈德的载体材料，制备具有缓释功能的载药纳米胶束，研究其负载和缓释醋酸曲安奈德的性能。 方法：通过酰胺化反应在壳聚糖上偶联脱氧胆酸基团，合成两亲性壳聚糖衍生物。透射电镜观察纳米粒的外观形态和粒径，Zeta电位分析仪测定纳米粒的Zeta电位，体外释放实验检测负载醋酸曲安奈德的壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒的包封率、载药量和体外释药性能。 结果与结论：合成出含脱氧胆酸基团的两亲性壳聚糖衍生物，它能与醋酸曲安奈德形成载药纳米胶束，载药量可高达82%。随着载药量的增加，载药纳米胶束的粒径逐渐增大，而Zeta电位则呈下降的趋势。体外释放的结果表明载药纳米胶束能起到72 h缓释醋酸曲安奈德的作用。提示以两亲性壳聚糖衍生物为载体的载药纳米胶束显示出较好的缓释醋酸曲安奈德性能，将有希望提高醋酸曲安奈德的治疗效果。 关键词：醋酸曲安奈德；两亲性壳聚糖衍生物；脱氧胆酸；纳米胶束；体外药物释放 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.29.013     

载表皮生长因子/壳聚糖纳米粒纤维蛋白胶胶联羊膜的制备及体外释药评价

背景：纤维蛋白胶胶联羊膜作为一种无需缝合生物移植材料还无法有效地在局部长时间缓释药物,特别是对于一些不稳定的生物活性蛋白药物。 目的：构建新型的能有效缓释蛋白药物的载表皮生长因子壳聚糖纳米粒纤维蛋白胶羊膜复合体。 方法：制备表皮生长因子/壳聚糖载药纳米粒并考察其表征,然后将载药纳米粒掺入纤维蛋白胶,再将载纳米粒的纤维蛋白胶和羊膜胶联黏合,制备出负载表皮生长因子/壳聚糖纳米粒纤维蛋白胶胶联羊膜,并进行形态学和体外释药观察,检测释放出的表皮生长因子生物活性。 结果与结论：表皮生长因子/壳聚糖纳米粒的粒径为(275.7±6.8) nm,Zeta电位为(32.7±0.6) mV,包封率为(67.03±1.22)%,多分散指数为0.23±0.04,形态圆形均一,载纳米粒纤维蛋白胶能够很好地与羊膜胶联黏合,表面呈网状结构,纳米粒充斥其中。载表皮生长因子/壳聚糖纳米粒纤维蛋白胶胶联羊膜体外释药可达14 d,释放的表皮生长因子生物活性可保持7 d以上。说明制备的载重组人表皮生长因子/壳聚糖纳米粒纤维蛋白胶胶联羊膜作为一种无缝合生物移植材料可在局部缓慢释放表皮生长因子。     

人转铁蛋白修饰载阿霉素海藻酸钠纳米粒的制备与评价

摘要 背景：对抗肿瘤药物靶向治疗和肿瘤细胞多药耐药产生的问题,载阿霉素海藻酸钠纳米粒经改性,偶联人转铁蛋白,生成的人转铁蛋白修饰载药纳米粒,可用于靶向肿瘤药物载体。 目的：制备人转铁蛋白修饰的载阿霉素海藻酸钠纳米粒并进行表征鉴定,检测其表面蛋白活性。 方法：采用优化的微乳化-离子交联方法制备包覆阿霉素的海藻酸钠复合纳米粒,以水溶性碳二亚胺为交联剂,将载阿霉素海藻酸钠纳米粒与人转铁蛋白连接,制备出人转铁蛋白修饰载阿霉素海藻酸钠纳米粒。透射电镜观察纳米粒的外观大小、形态;高效液相色谱法分析纳米粒的包封率和载药量;流式细胞仪检测其表面人转铁蛋白的活性。 结果与结论：人转铁蛋白修饰载阿霉素海藻酸钠纳米粒呈球形,平均粒径为170 nm。阿霉素的加入量可影响纳米粒的包封率,当阿霉素的加入量为纳米粒的10%时,包封率和包裹量均最佳。每毫克载药纳米粒可与约65 μg人转铁蛋白连接。人转铁蛋白修饰的载药纳米粒在流式细胞仪上除去非特异性吸附后还有67.3%荧光显示,说明人转铁蛋白修饰的载药纳米粒大部分都偶联上了人转铁蛋白抗体并能保持抗体活性,从而为载药纳米粒特异性靶向肿瘤细胞提供了足够的靶向动力。微乳化-离子交联方法制备方法简便可靠,制得的人转铁蛋白修饰载阿霉素海藻酸钠纳米粒有望成为具有潜在价值的一种特异性靶向药物载体。 关键词：海藻酸钠;阿霉素;人转铁蛋白;纳米粒;靶向;生物材料与纳米技术 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.21.014     

Denervation study of synapses of organ of corti of old world monkeys

Fine structural characteristics of synapses in the spiral organ of Corti were examined, with reference to differences between inner and outer haircell systems, and to location of neurons of origin of efferent axons. Surgical interruption of crossed olivocochlear bundle, of vestibular nerve, of facial nerve, and excision of superior cervical ganglia were used to determine the pathways of efferent axons. Interruption of the vestibular nerve near the brainstem results in degeneration of all efferent terminals on outer hair cells. Mid-line lesions at, and caudal to, the facial colliculus result in degeneration of about half of these efferent terminals. Efferent synaptic bulbs to the inner hair-cell system are small, of the order of one micron, and form type 2 junctions with afferent dendrites. They tend to have more large dense-core vesicles (about 80 nm) than the large efferent terminals of the outer hair-cell system, and appear to be the terminals of axons in the habenula perforata, which exhibit varicosities laden with large dense core vesicles. The varicosities are unaffected by excision of the superior cervical ganglia. So far as our material can reveal, it appears that the varicosities in the habenula perforata do not survive vestibular root interruption, nor do the efferent processes in the internal spiral bundle or at the base of inner hair cells. Most interestingly, the afferent processes of the inner hair-cell system, as identified for example by their relation to pre-synaptic bodies in the inner hair cells, are subject to a trans-synaptic reaction after severance of the vestibular root. They undergo a dramatic cytological transformation, characterized by increase of volume, engorgement with microtubules, microfilaments, microvesicles of various sizes, and clusters of lysosomes. Thus, both the efferent and afferent terminals of the inner hair-cell system show marked cytological differences from the corresponding terminals of the outer hair cell system.     

Mechanism of action of tubocurarine on nicotinic cholinoreceptors of neurons of the sympathetic ganglia of rats

Tubocurarine (Tc) effect on membrane currents elicited by acetylcholine (ACh) was studied in isolated superior cervical ganglion neurons of rat using patch-clamp method in the whole-cell recording mode. The "use-dependent" block of ACh current by Tc was revealed in the experiments with ACh applications, indicating that Tc blocked the channels opened by ACh. Mean lifetime of Tc-open channel complex, tau, was found to be 9.8 +/- 0.5 s (n = 7) at -50 mV and 20-24 degrees C. tau exponentially increased with membrane hyperpolarization (e-fold change in tau corresponded to the membrane potential shift by 61 mV). Inhibition of the ACh-induced current by Tc (3-30 microM/1) was completely abolished by membrane depolarization to the level of 80-100 mV. Inhibition of ACh-induced current was augmented at increased ACh doses. It is concluded that the open channel block produced by Tc is likely to be the only mechanism for Tc action on nicotinic acetylcholine receptors in superior cervical ganglion neurons of rat.     

The effect of age of onset of PD on risk of dementia

Background Dementia occurs in the majority of patients with Parkinson’s disease (PD). Late onset of PD has been reported to be associated with a higher risk for dementia. However, age at onset (AAO) and age at baseline assessment are often correlated. The aim of this study was to explore whether AAO of PD symptoms is a risk factor for dementia independent of the general effect of age. Methods Two community-based studies of PD in New York (n = 281) and Rogaland county, Norway (n = 227) and two population-based groups of healthy elderly from New York (n = 180) and Odense, Denmark (n = 2414) were followed prospectively for 3–4 years and assessed for dementia according to DSM-IIIR. All PD and control cases underwent neurological examination and were followed with neurological and neuropsychological assessments. We used Cox proportional hazards regression based on three different time scales to explore the effect of AAO of PD on risk of dementia, adjusting for age at baseline and other demographic and clinical variables. Findings In both PD groups and in the pooled analyses, there was a significant effect of age at baseline assessment on the time to develop dementia, but there was no effect of AAO independent of age itself. Consistent with these results, there was no increased relative effect of age on the time to develop dementia in PD cases compared with controls. Interpretation This study shows that it is the general effect of age, rather than AAO that is associated with incident dementia in subjects with PD. Received in revised form: 22 December 2005     

Limits of deinstitutionalization--perspectives of relatives of psychiatric patients

After a hopeful beginning, the social process of the reintegration of those with severe mental illness has come to a standstill. I am led to wonder whether "the community" really wants to live together with people suffering from severe mental illness, and if so, how closely? As long as the medical treatment of mental illness provided by the general practitioners is fundamentally deficient, as they are not able to prescribe the necessary interventions--such as out-patient psychiatric nursing, and service providers in the out-patient sector are content with offering increasingly intensive forms of care for the less seriously ill at the cost of the Social Welfare System--the reintegration of those with serious mental illness remains an illusion--which is mainly to the benefit of providers of residential care in homes and hostels.