针对汉坦病毒S基因反义寡核苷酸抗病毒效应的研究

目的：研究反义寡核苷酸（asON）体外抗汉坦病毒（HV）的效应。方法：设计合成了分别针对HV S基因片段5′端手柄状结构区的asON1和针对mRNA翻译起始区的asON2，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测asON作用后HV感染细胞培养上清中HV核蛋白（NP）的表达水平，免疫荧光试验（IFA）检测asON作用后感染细胞膜上NP的表达水平，空斑减少中和试验（PRNT）测定asON作用和HIV感染细胞培养上清液中病毒滴度。结果：asON可抑制NP的合成以及病毒活恬。结论：asON具有一定的抗HV作用，有可能作为一种治疗人HV感染的新途径。     

c-fos反义寡核苷酸对谷氨酸神经毒性鼠脑损伤的防护

目的　探讨c-fos基因的表达在谷氨酸神经毒性中的作用。方法　在9只SD大鼠侧脑室注射c-fos反义寡核苷酸以阻断脑组织c-fos基因的表达,并用c-fos正义寡核苷酸为对照。观察脑组织中水、电解质含量和突触体内Ca2+浓度的变化,并采用细胞形态计量分析及免疫组织化学方法,观察大脑皮质、海马CA1区神经细胞数目、形态的变化及c-fos基因的表达。结果　c-fos反义寡核苷酸可有效地阻断脑组织c-fos基因的表达,降低脑组织c-fos阳性细胞率（9.4%±2.8%和74%±3%,P＜0.01）,抑制谷氨酸神经毒性所致的脑组织含水量（79.9%±0.4%和82.3%±0.8%,P＜0.01）、钠（5.05mg/g干重±0.39mg/g干重和5.98mg/g干重±0.50mg/g干重,P＜0.01）及细胞内Ca2+（176nmol/L±35nmol/L和344.12±50.13,P＜0.01）含量的增加,抑制谷氨酸所致大脑皮质（157±10和145±7,P＜0.01）及海马CA1区（297.64±18.3和210±19,P＜0.01）神经细胞的丢失,减轻神经细胞的形态学损伤。c-fos正义寡核苷酸无此效应。结论　c-fos基因的表达在谷氨酸神经毒性脑损伤的发生中起有重要作用,阻断c-fos基因的表达可以拮抗谷氨酸神经毒性。     

垂体瘤转化基因反义寡核苷酸抑制胶质瘤增殖的实验研究

目的 观察垂体瘤转化基因(pituitary tumortr ansforming gene,PTTG)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对恶性胶质瘤增殖的抑制作用.方法 将C6胶质瘤细胞接种于大鼠右侧尾状核.按照不同的PTTG反义寡核苷酸浓度在选定的时间点立体定向原位注射于肿瘤区域.3周后处死大鼠,取标本做GFAP、PTTG、PCNA免疫组化染色.结果 不同浓度的PTTG-ASODN对C6胶质瘤模型的增殖抑制呈时间、浓度依赖性,而且高浓度,早期应用,反复应用PTTG-ASODN抑制胶质瘤模型肿瘤增殖的效果明显.结论 PTTG-ASODN可以抑制胶质瘤的增殖,有望成为胶质瘤基因治疗的一种新策略.     

脂质体介导c-myc反义寡核苷酸诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

目的体外研究C-MYC反义寡核苷酸(ASODN)对人宫颈癌HELA细胞凋亡的影响,寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的方法。方法免疫组化、流式细胞术、半定量RT-PCR法鉴定ASODN的有效性;GIEMSA染色、流式细胞术检测凋亡指数(AI)、DNA LADDER检测细胞凋亡。结果转染后,免疫组化结果显示C-MYC蛋白表达降低;半定量RT-PCR结果显示C-MYC MRNA表达较空白对照组及阴性对照组明显减弱(P<0.05)。GIEMSA染色可见凋亡小体;流式细胞术结果显示转染后凋亡指数为(10.29±0.66)%,转染ASODN(C-MYC)联合放射的凋亡指数为(16.83±0.57)%,均明显高于空白对照组(1.79±0.19)%(P<0.05);DNA LADDER呈现具有凋亡特征的梯带。结论本实验所设计的ASODN能有效地抑制C-MYC基因的表达;转染ASODN(C-MYC)能够显著增加HELA细胞凋亡,从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。     

反义寡核苷酸治疗白血病的研究现状

反义核酸技术是近十年来肿瘤治疗研究的热点,它包括反义寡核苷酸(又称反义DNA,Antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)、反义RNA、核酶及RNA干扰等技术.其中反义寡核苷酸技术的主要作用原理是根据碱基互补配对原则,利用合成的寡核苷酸选择性地与靶基因mRNA互补结合,干扰或阻止其基因产物的形成,从而达到治疗肿瘤的目的.     

噪声暴露对豚鼠耳蜗c-fos基因表达的影响

目的:观察噪声暴露后豚鼠耳蜗c-fos基因表达的变化.方法:选用健康雄性白色豚鼠32只,随机分为4组,1组为正常对照组,另3组为实验组.实验组在120 dB spL的4kHz窄带噪声中暴露4 h,分别测试噪声暴露后2,48,168 h及对照组豚鼠听性脑干反应(ABR).用免疫组织化学染色分析c-fos 基因在耳蜗的表达情况,用计算机图像分析系统测量耳蜗c-fos蛋白的平均吸光度值.结果:噪声暴露后豚鼠ABR阈值及耳蜗中c-fbs蛋白的平均吸光度值较正常组均增大;随着时间的延长ABR阈值及c-fos蛋白的平均吸光度值均逐渐恢复,168 h组的ABR阈值及c-fos蛋白的平均吸光度值均低于2 h组和48 h组.结论:噪声暴露后耳蜗c-fos基因表达增高,可能与噪声暴露后耳蜗毛细胞、螺旋神经节等结构的损伤修复有关.     

乳腺癌反义寡核苷酸治疗的研究进展

反义寡核苷酸技术(ASODN)作为一种新的分子生物学工具及新型药物受到医疗界越来越多的关注.许多反义药物作为抗肿瘤药物已进入临床试验,并取得了令人欣喜的效果.     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌SGC7901细胞株凋亡的实验研究

目的 观察Survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞株（SGC7901）增殖、凋亡的作用。方法 人工合成Survivin硫代ASODN，通过脂质体转染胃癌细胞株（SGC7901）后，用MTT法检测细胞毒作用；用荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡；用RT-PCR、免疫组化技术检测SurvivinmRNA及蛋白的表达。结果 （1）Survivin ASODN抑制胃癌SGC7901细胞增殖呈时间和剂量依赖性；（2）Survivin ASODN处理组SGC7901细胞24h后凋亡率为33．6％，正义寡核苷酸（SODN）组为10．7％，2组相比，有显著性差异（P〈0．05）；（3）SurvivinASODN处理组SGC7901细胞Survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降。结论 Survivin ASODN能够抑制增殖、诱导凋亡，推测可能通过下调Survivin mRNA及蛋白表达而起作用。     

CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响

目的：通过研究CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增残活性的影响,探讨CRKL基因在Ph^ 慢性粒细胞性白血病（CML）发病中的作用,方法： 脂质体为载体,CRKL基因反义寡核苷酸转染K562细胞,通过活细胸记数,H^3-TdR掺入,RT－PCR等方法观察K562细胞的增殖活性及基因表达的变化,结果,CRKL反义寡核苷酸对K562细胞的增殖有抑制作用,结论：CRKL基因在Ph^ CML的发病中可能有重要作用,可作为CML治疗的新靶点。     

stathmin基因反义寡核苷酸对Eca109细胞系生长的抑制作用

目的:研究stathmin基因反义寡核苷酸(ASODN)对Eca109细胞增殖及stathmin基因表达的抑制作用,探讨ASODN用于食管癌基因治疗的可行性.方法:实验设ASODN转染组、SODN转染组和未转染组.分别应用stathmin ASODN、SODN转染食管癌Eca109细胞.倒置显微镜观察转染细胞的形态变化,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖能力,RT-PCR方法检测stathmin基因的表达,采用流式细胞仪分析细胞增殖周期.结果:stathmin ASODN转染Eca109细胞后,胞体凝缩,增殖能力减弱,细胞生长及目的基因表达明显受抑(P<0.05),其抑制作用具有序列特异性.细胞分裂阻滞在分裂期的中期,G2/M期细胞数由(12.2±1.0)%升至(36.5±5.8)%.结论:stathmin基因反义寡核苷酸对Eca109细胞增殖及stathmin基因表达具有明显抑制作用,有望成为食管癌基因治疗药物.     

形觉剥夺性近视豚鼠视网膜中脑源性神经营养因子的表达

目的:研究视网膜脑源性神经营养因子(BDNF)在豚鼠形觉剥夺性近视(FDM)形成中的作用。方法:出生3d豚鼠以半透明眼罩遮盖右眼2个月制备FDM动物模型,左眼作为对照。遮盖前后,检影验光检测双眼屈光度,A超测量双眼眼轴长度。遮盖后免疫组织化学法分析视网膜BDNF的表达,RTPCR检测BDNFmRNA的表达。结果:形觉剥夺使眼轴增长,近视屈光度增加,遮盖眼与对照眼相比屈光度差异有统计学意义(P<0.01)。遮盖眼BDNF免疫活性降低,BDNFmRNA表达下调。结论:BDNF可能参与调控FDM的形成。     

虾青素对凹透镜所致的豚鼠近视模型屈光状态及病理组织形态的影响

目的：探讨虾青素对凹透镜所致的豚鼠近视模型屈光状态及病理组织形态的影响,阐明虾青素对近视屈光状态的改善作用。方法：48只健康豚鼠随机分为空白对照组（n=12）和模型组（n=36）,模型组以远视性光学离焦法制备豚鼠右眼近视模型（左眼作为对照）后随机分为模型对照组、低（25 ig·kg^-1）和高剂量虾青素组（50 ig·kg^-1）,给药干预4周,于2和4周分别检测各组豚鼠双眼屈光度和眼轴长度,并于4周检测完成后,对右眼进行病理组织形态学检查。结果：模型组豚鼠在实验2周后实验眼球屈光度较作为对照的左眼低（P < 0.05）,与空白对照组右眼比较也明显降低（P < 0.05）,4周后更加明显（P < 0.01）;模型组豚鼠在实验2周后实验眼球的眼轴长度较对照的左眼及空白对照组增加（P < 0.05）,4周后增加更为明显（P < 0.01）。与模型组比较,虾青素组豚鼠眼屈光度及眼轴长度明显增加（P < 0.05）,用药时间长且效果较好;其病理组织形态学上也呈现出明显的改善,胶原断裂现象明显减少且排列较整齐。结论：虾青素在改善近视眼屈光度及眼轴长度方面有良好的效果,还有助于恢复近视眼球巩膜的组织形态。     

MMP-2和TIMP-2在激光诱导形觉剥夺的高度近视豚鼠脉络膜新生血管中的表达变化

 目的  构建高度近视豚鼠脉络膜血管新生(choroidal neovascularization,CNV)模型,探讨基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor-2 of metalloproteinase,TIMP-2)在高度近视CNV形成中的作用。方法  72只2周龄三色豚鼠随机分为实验组(n=36)和对照组(n=36),实验组右眼行6周形觉剥夺诱导高度近视。两组各选取30只豚鼠右眼行532 nm激光光凝视网膜诱导CNV。于激光前和光凝后7、14、21、28、35天进行免疫组化观察光凝区域MMP-2和TIMP-2的表达,real-time PCR检测视网膜色素上皮层(retinal pigment epithelium,RPE) 脉络膜/巩膜复合物中的MMP-2和TIMP-2 mRNA表达对MMP-2和TIMP-2免疫组化阳性表达的积分光密度值(integral optical desnsity,IDO)及mRNA相对表达水平进行统计学分析。结果  激光光凝后实验组和对照组MMP-2和TIMP-2表达均明显上调,MMP 2于光凝后21天、TIMP-2于光凝后28天时表达高峰。激光前及光凝后各观察时间点,实验组MMP-2阳性表达和mRNA相对表达量均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而激光前实验组TIMP-2表达较对照组明显减少(P<0.05),光凝后各时间点两组TIMP-2表达差异无统计学意义。结论  MMP-2和TIMP-2与高度近视CNV形成密切相关,MMP-2与TIMP-2表达平衡紊乱可能参与高度近视CNV的发生发展。     

豚鼠形觉剥夺性近视视网膜组织中神经生长因子受体p75NTR和Caspase-3的表达

目的:探讨豚鼠形觉剥夺性近视视网膜神经生长因子受体p75NTR、Caspase-3表达的变化.方法:出生1周的豚鼠30只随机分为2组,正常组10只,实验组20只.实验组右眼为遮盖眼,通过单眼遮盖法建立豚鼠形觉剥夺性近视模型,左眼为自身对照眼,正常对照组取双侧眼球.检影验光检测屈光度,A超测量双眼眼轴长度.免疫组织化学法检测视网膜p75NTR与Caspase-3蛋白的表达,RT-PCR检测视网膜p75NTR mRNA的变化,TUNEL法检测视网膜神经细胞凋亡.结果:实验结束,遮盖眼屈光度加深、眼轴长度延长,可见凋亡细胞核.正常对照眼与自身对照眼屈光度与眼轴长度无明显变化,视网膜外核层及内核层几乎无p75NTR、Caspase-3阳性染色,无凋亡细胞.遮盖眼视网膜可见p75NTR、Caspase-3阳性表达、p75NTR mRNA增加和凋亡细胞.结论:形觉剥夺性近视视网膜p75NTR和Caspase-3的表达增加可能与视网膜神经细胞凋亡有关.     

近视豚鼠视网膜超微结构改变及环磷酸鸟苷的表达

目的:建立豚鼠形觉剥夺性近视动物模型,观察豚鼠视网膜超微结构变化,研究环磷酸鸟苷(cyclic guanine monophosphate,cGMP)在近视豚鼠视网膜组织上的表达变化,探讨其发病机制.方法:3周龄的三色豚鼠随机分为未遮盖组(Ⅰ组)、单眼遮盖2周组(Ⅱ组)和单眼遮盖3周组(Ⅲ组),其中右眼遮盖为实验眼,左...     

Changes of nitric oxide synthase and cyclic guanosine mono- phosphate in form deprivation myopia in guinea pigs

Background  The form deprivation (FD) reduces spatial contrasts and induces myopia.  Nitric oxide and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) are involved in visual signal transmission. This study investigated changes in nitric oxide synthase (NOS) activity and cGMP concentration in ocular tissues in acute and chronic form deprivation myopia.
Methods  Guinea pigs had one eye covered by translucent glass for 7, 14 or 21 days. Untreated litter mates were used as controls. NOS activity and cGMP concentrations in the retinal, choroidal and scleral tissues of FD eyes and control eyes were analyzed by radioimmunoassay after various durations of FD. The expression of NOS subtypes was identified by immunohistochemistry.
Results  Myopia was successfully induced in FD eyes after 14 days. Compared with control groups, the retinal NOS activity and cGMP concentrations in the FD eyes significantly increased after 14 and 21 days while the retinal NOS activity in the FD eyes was transiently suppressed by 7 days of FD. The NOS activity and cGMP concentrations of choroid and sclera in the FD eyes were higher than in the control groups at 21 days. The three isoenzymes of nitric oxide synthase were detected in the ocular tissues of guinea pigs.
Conclusions  The NOS activity and cGMP concentrations were upregulated after chronic FD and the retinal NOS activity was transiently suppressed at acute FD. The function of elevated NOS activity may be mediated by cGMP.

     

改良的豚鼠灌胃给药方法

 目的 改良豚鼠灌胃给药的方法。方法 选取清醒豚鼠40只,使其后肢站立、腹侧紧贴支持物,体位垂直不能前移,后拉两耳颊部皮毛并轻抵项部使其头后仰颈伸直,插入1 mL注射器、越过上下臼齿并压住舌根灌药;另选40只全身麻醉的豚鼠,使其侧卧头高臀低位,插入直径2 mm小儿吸痰管至胃内灌药。结果 对清醒及全麻豚鼠,连续灌胃给药7 d,80只豚鼠均顺利实现灌胃,仅需一人独立操作,无一例因操作不当引起豚鼠消化道损伤或误灌入气道死亡,成功率达100%。结论 成功改良了豚鼠的灌胃给药方法,使经口给药途径的动物实验不需因技术问题而局限于大鼠、小鼠,为进一步的药物和营养学等研究奠定了基础。     

正常豚鼠声刺激诱发的耳蜗基底膜振动

目的：研究正常听力豚鼠耳蜗基底膜的振动模式．方法：对１８只正常听力豚鼠采用激光多普勒测速仪测定经短纯音和宽带噪声诱发的基底膜振动的振幅、速度，并进行输入－输出函数曲线和频率传递函数分析．结果：短纯音诱发的基底膜振动曲线为正弦曲线．在振动曲线起始部有０．３ｍｓ的无反应期，这是声波从声源传到内耳所需时间．３１ｄＢＳＰＬ短纯音诱发的基底膜振动平均速度为（３４．１２±６．８２）μｍ／ｓ，平均振幅为（０．１２±０．０２）ｎｍ．输入－输出函数曲线在测试点最佳频率（ＢＦ，约１８ｋＨｚ）曲线呈压缩非线性．而在低于最佳频率的曲线呈线性．频率传递函数曲线显示高声强时高于ＢＦ的频率为一个陡峭的斜坡，而在ＢＦ低频侧呈一缓慢的斜坡．这一现象符合行波学说．而低声强时，仅在ＢＦ附近基底膜有反应．这一现象又符合部位共振学说．结论：短纯音诱发的正常豚鼠耳蜗基底膜振动为一与声刺激频率相同的正弦运动．输入－输出函数曲线示正常豚鼠基底膜振动的非线性特性．频率传递函数提示，在高声强刺激时，基底膜振动模式符合行波学说，在低声强刺激时又符合部位共振学说．     

白化豚鼠高度近视眼的发生与视网膜超微结构的关系

目的:观察白化豚鼠与有色豚鼠眼球屈光状态及视网膜形态结构,探讨白化豚鼠高度近视眼的发生与黑色素合成的联系.方法:随机选取220～250g(5～6周龄)的白化豚鼠与有色豚鼠各12只,行视网膜镜检影验光以检测屈光度,A超和游标卡尺测眼轴长度,光镜和电镜观察视网膜结构.结果:白化豚鼠的平均屈光度为-19.17D,有色豚鼠的屈光度为 0.63D,白化豚鼠较有色豚鼠眼轴延长,差异有统计学意义(P＜0.05).形态学观察发现,白化豚鼠视网膜变薄,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)层细胞色素颗粒稀少,所含膜盘吞噬体减少,膜盘间隙变窄.有色豚鼠视网膜较厚,RPE细胞含大量色素颗粒、内含较多膜盘吞噬体,膜盘间隙较宽.结论:白化豚鼠为高度近视眼,有色豚鼠为低度的远视眼或正视眼.白化豚鼠与有色豚鼠的视网膜存在着结构差异.白化豚鼠RPE的结构异常,为其高度近视眼提供了光学基础和结构基础.     

褪黑素对豚鼠老年性聋的拮抗作用

目的:观察褪黑素对豚鼠老年性聋的拮抗作用.方法:80只豚鼠随机分为4组:正常对照组(A组),老年性聋模型组(B组),褪黑素治疗的老年性聋模型组(C组0.3 mg/(kg·d和D组1.0 mg/(kg·d).以腹腔注射D-半乳糖制作老年性聋模型,4周后测量各组ABR、耳蜗组织谷胱甘搿-过氧化物酶(GSH-Px)含量,耳蜗铺片观察毛细胞变化情况.结果:与A组比较,B、C组ABR阈值、Ⅰ波潜伏期、Ⅲ波潜伏期及Ⅰ、Ⅲ波间期均升高,GSH-Px含量降低(P＜0.05或0.01).D组上述各指标与A组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).耳蜗铺片结果,B组耳蜗基底膜各周外毛细胞排列紊乱,大小不一,胞内颗粒染色变浅,可见细胞点状缺失;A、D组外毛细胞排列整齐,无缺失;C组介于B、D组之间.结论:褪黑素对老年性聋豚鼠听力及耳蜗毛细胞有保护作用,且与剂量有关.