柯萨奇病毒B感染和细胞内信号传导调控

近年来病毒性心肌炎在儿童中的发病率逐年上升,其中柯萨奇病毒B是引起病毒性心肌炎最主要的病原,随着研究的不断深入发现细胞内信号传导通路在病毒性心肌炎的发病机制中起重要作用。CVB感染宿主细胞后能对胞内多种信号传导通路进行调控,这些信号传导通路反过来又能影响CVB与CAR的结合,影响病毒在细胞内的增殖,改变被感染细胞的病理生理过程。     

PI3K-Akt-mTOR信号通路与病毒性心肌炎

PI3K-Akt-mTOR是细胞内重要的信号通路,在细胞凋亡、转录、翻译、代谢、血管新生及细胞周期等过程发挥着重要作用。柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CVB3)导致的病毒性心肌炎是小儿常见的后天性心脏病,大部分非由病毒直接破坏所致,而涉及免疫反应与细胞凋亡。阐明CVB3感染细胞后PI3K-Akt-mTOR信号通路的变化,有助于揭示病毒性心肌炎的发病机制,对心肌炎的治疗与预后起重要作用。     

汉黄芩苷对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎小鼠炎症反应的影响

目的:探讨汉黄芩苷对柯萨奇B3病毒(CVB3)诱导的病毒性心肌炎小鼠炎症反应的影响及其可能的调控机制。方法:用CVB3感染BALB/c小鼠构建病毒性心肌炎动物模型。取40只BALB/c小鼠将其随机分为4组:正常对照组、CVB3感染的病毒性心肌炎组、CVB3感染后给予汉黄芩苷处理的治疗组以及CVB3感染后同时给予汉黄芩苷和AKT激动剂处理的激动剂组,每组10只。于药物治疗7 d后处死各组小鼠。用HE染色检测前3组小鼠心肌组织内炎症细胞浸润情况。用ELISA检测前3组小鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6含量。用Western blot实验检测前3组小鼠心脏组织中炎症因子蛋白表达水平以及AKT/NF-κB通路的活化情况。最后,通过Western blot实验检测全部4组小鼠心肺组织中AKT/NF-κB通路的活化情况。结果:与正常组相比,病毒性心肌炎小鼠心脏组织内存在大量炎症细胞浸润,而汉黄芩苷治疗显著降低CVB3病毒诱导的心脏组织炎症细胞浸润(P<0.05)。CVB3病毒感染后小鼠血清中IL-1β和IL-6含量较正常组显著升高(P<0.05),而给予汉黄芩苷治疗后小鼠血清中IL-1β和IL-6含量较病毒性心肌炎组显著降低(P<0.05)。Western blot检测结果表明,与病毒性心肌炎组相比,汉黄芩苷治疗显著降低心肌组织内炎症因子(IL-1β和IL-6)蛋白表达水平以及AKT和NF-κB蛋白的磷酸化水平(P<0.05);而给予AKT激动剂处理后,汉黄芩苷对NF-κB蛋白磷酸化水平的抑制作用显著减弱(P<0.05),且汉黄芩苷对炎症因子的下调作用也显著受到抑制(P<0.05)。结论:汉黄芩苷可通过调控AKT/NF-κB通路减轻病毒性心肌炎小鼠的炎症反应。     

小鼠柯萨奇病毒性心肌炎模型的优化

在两种品系小鼠中建立、优化和规范B组3型柯萨奇病毒(CVB3)诱导的病毒性心肌炎小鼠模型。首先以100TCID50-10 000TCID50之间剂量的CVB3Nancy株病毒经腹腔感染易感BALB/c雄性小鼠,通过体重减轻率、死亡率和心脏病理及心肌CK-MB水平,评估建立最佳病毒性心肌炎的最佳剂量;而后摸索了在C57BL/6小鼠建立病毒性心肌炎的CVB3剂量。通过精细比较发现雄性BALB/c小鼠致心肌炎的最佳CVB3病毒滴度数量级在1000TCID50;进一步确定1500TCID50是在雄性BALB/c小鼠中诱导病毒性心肌炎的最佳剂量;C57BL/6小鼠不是易感小鼠,但在1500TCID50CVB3感染下也可诱导轻微可见的病毒性心肌炎,便于在多数基因敲除鼠内的病毒性心肌炎研究。本研究为规范病毒性心肌炎模型的建立、为后续病毒性心肌炎机制的深入研究奠定了重要的基础模型。     

硫化氢对柯萨奇病毒感染的病毒性心肌炎小鼠的保护作用

目的研究硫化氢对柯萨奇病毒B3（Coxsachievirus B3, CVB3）感染的病毒性心肌炎小鼠的保护作用以及胱硫醚γ-裂解酶（ CSE）/硫化氢（ H2 S）通路在其体内的表达情况。方法将110只5周龄的雄性BALB/c小鼠随机分为4组：正常对照组、病毒性心肌炎组、硫氢化钠（外源性H2 S供体）组和DL-炔丙基甘氨酸（ PAG,CSE不可逆抑制剂）组。以腹腔注射CVB3建立急性病毒性心肌炎模型,接种当天记为第0天,24 h后每组每日经腹腔分别注射相应干预药物。分别于接种后第4天和第10天从各组随机抽取10只处死,留取血清和心肌标本。观察心肌炎症病理改变,酶联免疫吸附法检测H2 S及IL-6、TNF-α等炎症因子含量,逆转录-聚合酶链反应法检测心肌组织CVB3、CSE的mRNA表达水平,免疫组化及蛋白质印迹法定性、定量检测CSE蛋白水平表达。结果与正常对照组比较,病毒性心肌炎组血清和组织H2 S浓度、CSE mRNA、CSE蛋白水平表达均明显下调,给予NaHS干预可明显上调H2 S水平,减轻心肌损伤、减轻炎症细胞浸润以及间质水肿,对病毒CVB3 mRNA的表达有抑制作用,而给予PAG干预,可明显抑制H2 S和CSE表达,加重心肌损伤、炎症细胞浸润及间质水肿,促进CVB3 mRNA的复制。结论在病毒性心肌炎中,CSE/H2 S通路表达明显受到抑制,给予PAG干预可明显抑制该通路的表达,加重心肌损伤,促进病毒复制,外源性供给硫化氢可对感染心肌起到保护作用,且可抑制病毒复制。     

CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠模型中CD4~+T细胞亚群格局及其作用

本研究主要关注BALB/c小鼠感染柯萨奇病毒B3型(CVB3)后CD4+T细胞亚群格局的变化及其对病毒性心肌炎发病的贡献度。CVB3腹腔感染小鼠后第7d,通过小鼠体重下降率、心肌损伤血清学指标肌酸激酶(CK)活性以及心肌组织病理学改变等多项指标证实小鼠心肌炎模型的成功建立。经Real-time PCR检测感染第7d脾脏CD4+T细胞亚群主要细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-17F及转录因子Foxp3表达情况;以流式细胞术检测了CD4+T细胞各亚群比例,并通过多元线性回归分析法评估了各T细胞亚群对病毒性心肌炎发病的影响。结果显示,与对照组相比,CVB3感染小鼠脾脏IL-17A、IL-17F、IFN-γ表达均显著上升(分别约为12、8.5、5倍),而IL-4和Foxp3表达无明显变化。CVB3感染小鼠脾脏中CD4+IL-17+Th17细胞的上调幅度最为明显,约2.75倍,其次为IFN-γ+Th1细胞,上调约2.27倍,而Th2和Treg细胞无明显变化。进一步统计学分析显示,Th17对病毒性心肌炎发病的贡献度最高(1.808),Th1次之,贡献度为1.581,而Th2和Treg对病毒性心肌炎发病无显著影响,提示CD4+T细胞亚群格局变化与病毒性心肌炎发病密切相关,其中以Th17对心肌炎发病的贡献度尤为显著。     

柯萨奇B组3型、5型病毒在人脐静脉血管内皮细胞中持续感染模型的建立

柯萨奇B组病毒 (groupBcoxsackieviruses ,CVB)可引起人类多种疾病。如病毒性心肌炎 ,有的患者可转为慢性 ,晚期形成扩张型心肌病 ,导致心衰 ,预后不良。目前认为扩张型心肌病的病因与病毒在心肌组织中的持续存在有关〔1〕。CVB可形成病毒血症 ,侵入血管内皮细胞或经血管内皮细胞穿越内皮屏障 ,感染相应靶组织。ECV30 4为一株自发突变为可传代的人脐静脉内皮细胞 ,其主要生物学特性与原代细胞相似。本研究在ECV30 4细胞中建立CVB3、CVB5持续感染的细胞模型 ,通过对病毒、细胞各种指标的检测 ,印证病毒长期存在于感染细胞中。为病毒…     

三参饮对病毒性心肌炎慢性期TGF-β-Smad通路的干预

<正>目的:研究转化生长因子-β(TGF-β)-Smad传导通路在病毒性心肌炎(VMC)慢性期心肌纤维化形成中的作用及三参饮治疗机制。方法:110只健康雄性Balb/c小鼠中的30只采用间断多次腹腔注射柯萨奇病毒B3(CVB3)的方法     

中药心康口服液抗柯萨奇B3病毒RNA复制作用的研究

目的研究探讨中药心康口服液对感染心肌中柯萨奇B3病毒RNA复制的影响。方法小鼠感染柯萨奇病毒B3(CVB3)诱发急性病毒性心肌炎,于急性期治疗后提取鼠心肌总RNA,用逆转录-聚合酶链反应技术检测心肌CVB3RNA含量,经琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像系统下观察。结果中药心康口服液能明显降低心肌CVB3-RNA的含量,与病毒对照组比较差异有统计学意义,P<0.01;感染期不同阶段心肌病毒RNA含量的检测显示,心康口服液2个治疗组的病毒含量的检出,并没有随着用药时间的延长而显著降低。结论中药心康口服液能有效地影响心肌CVB3RNA的复制,其对病毒的作用是抑制复制而非杀灭。     

RIP3/CaMKⅡ信号通路对重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响

目的:观察RIP3/CaMKⅡ信号通路对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响,并探讨CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93对心肌损伤的作用。方法:将60只雄性BALB/c小鼠分为正常对照组、CVB3组、CVB3+KN-93组和CVB3+KN-93+Ti(活性氧簇特异性抑制剂)组,以上小鼠腹腔及尾静脉注射药物连续7 d。采用双抗体夹心免疫法检测小鼠心肌细胞坏死标志物,心脏超声技术检测小鼠心脏结构和功能,绘制Kaplan-Meier生存曲线,观察KN-93对小鼠心肌的保护作用。结果:CVB3+KN-93组小鼠心肌细胞坏死较CVB3组显著减轻,心脏功能和生存曲线改善(P<0.01);CVB3+KN-93组小鼠心肌组织H2O2含量较CVB3组显著下降(P<0.01);加入Ti后,CVB3+KN-93+Ti组H2O2含量较CVB3+KN-93组轻度下降(P<0.05),但无论是心脏功能还是生存曲线均无显著差异。结论:RIP3/CaMKⅡ信号通路在CVB3诱导的急性重症病毒性心肌炎小鼠心肌细胞损伤中起到主导作用;KN-93能阻断这种作用并可能产生新的治疗方式,其效果可能是通过对CaMKⅡ的直接抑制和对活性氧簇的间接抑制而实现的。     

柯萨奇B组病毒致病性的分子生物学研究

柯萨奇B组病毒(coxsackievirus group B,CVB)是微小RNA病毒科肠道病毒属成员,病毒性心肌炎的病例中大约有20%~25%是由柯萨奇B组病毒引起.CVB的致病机制十分复杂,病毒基因组以及病毒蛋白均在病毒致病过程中发挥重要作用.因此,对柯萨奇B组病毒的基因组、结构蛋白以及某些非结构蛋白与靶细胞内分子间相互作用生物信息的认识是阐述该病分子机制的基础.     

柯萨奇病毒B组3型感染胰岛细胞的体外研究

目的 观察柯萨奇病毒B组3型(Coxsackie virus B3,CVB3)对体外培养胰岛细胞的感染情况,初步探讨CVB3损伤胰岛细胞的机制.方法 分离并培养骨髓间充质干细胞,用尼克酰胺和β-巯基乙醇进行胰岛细胞诱导并鉴定.用CVB3感染胰岛细胞,RT-PCR检测胰岛细胞内的CVB3特异性片段.结果 骨髓间充质干细胞经药物诱导后,呈半悬浮状并聚集成用.双硫腙特异性染色后细胞变成红棕色,RT-PCR也证明诱导细胞内具有表达胰岛素的mRNA.CVB3感染胰岛细胞,细胞出现皱缩,折光性下降等典型病变,RT-PCR法成功扩增出胰岛细胞内的CVB3特异性片段.结论 CVB3可以在体外直接损伤胰岛细胞,最终引起胰岛细胞的裂解.     

柯萨奇病毒B组3型感染胰岛细胞的体外研究

目的 观察柯萨奇病毒B组3型(Coxsackie virus B3,CVB3)对体外培养胰岛细胞的感染情况,初步探讨CVB3损伤胰岛细胞的机制.方法 分离并培养骨髓间充质干细胞,用尼克酰胺和β-巯基乙醇进行胰岛细胞诱导并鉴定.用CVB3感染胰岛细胞,RT-PCR检测胰岛细胞内的CVB3特异性片段.结果 骨髓间充质干细胞经药物诱导后,呈半悬浮状并聚集成用.双硫腙特异性染色后细胞变成红棕色,RT-PCR也证明诱导细胞内具有表达胰岛素的mRNA.CVB3感染胰岛细胞,细胞出现皱缩,折光性下降等典型病变,RT-PCR法成功扩增出胰岛细胞内的CVB3特异性片段.结论 CVB3可以在体外直接损伤胰岛细胞,最终引起胰岛细胞的裂解.     

C家族趋化因子XCL1增强CVB3基因疫苗的抗病毒免疫应答及保护作用

为提高以往构建的基因疫苗pcDNA3.1-VP1的抗B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染的免疫效果,以编码C家族趋化因子XCL1的质粒pcDNA3.1-XCL1共注射,观察诱导的CVB3特异性免疫应答及CVB3病毒性心肌炎预防效果。将两种质粒各50μg混合后分别于0、2、4、6周肌注免疫小鼠4次,末次免疫后4周分别以5×LD50剂量CVB3攻击小鼠观察保护率,或以3×LD50剂量CVB3感染小鼠观察病毒性心肌炎的诱生。结果显示,与单纯pcDNA3.1-VP1质粒相比,XCL1质粒共注射可增强血清CVB3特异性IgG以及特异性CTL应答。5×LD50病毒攻击后,共注射组体重降低7.28%,而pcDNA3.1-VP1组体重降低10.97%;共注射组28 d保护率达40%,高于pcDNA3.1-VP1组的30%。3×LD50病毒感染后心肌组织病理显示,共注射组心外膜下仅有轻微炎症,心肌内未见炎症细胞浸润,而pcDNA3.1-VP1组除心外膜下有较多淋巴细胞聚集外,心肌内有少量炎症浸润和坏死灶。提示XCL1质粒共注射可增强CVB3特异性体液和细胞免疫应答及抗病毒保护,可有效预防病毒性心肌炎的发生。     

柯萨奇B3病毒VP1基因在原核中的表达及其临床意义

目的：研究柯萨奇B3病毒（CVB3）VP1基因在大肠杆菌中的表达及其临床意义。方法：将柯萨奇B3病毒中国分离株VP1基因克隆入PQE-30载体,转导入大肠杆菌（Ml5）中,使CVB3的VP1基因在大肠杆菌中得到稳定的表达,采用NAT亲和方法纯化,间接ELISA方法做免疫学活性鉴定。结果：表达的VP1产物与抗柯萨奇B3病毒的兔抗CVB3（多克隆抗体）血清产生较强的免疫反应,与天然的CVB3蛋白抗原（病毒组织培养抗原）的抗原性近似。应用无关兔抗体对照呈阴性反应。应用表达的VP1产物作为抗原,对临床急性病毒性心肌炎患者血清进行了特异性IgM酶联免疫吸附试验检测,其结果与组织培养的CVB3制备的细胞蛋白抗原对上述患者血清的特异性IgM检测结果基本一致。结论：采用基因工程方法制备出的CVB3-VP1蛋白抗原产量高,纯化后免疫反应原性基本没有变化。试用表达CVB3的VP1基因工程抗原代替目前实验用有感染危险的病毒培养抗原的方法,快速、特异地检出CVB3的感染,为急性心肌炎的早期诊断和及时的临床治疗提供可靠的实验室诊断指标。     

鸢尾素irisin对病毒性心肌炎小鼠的免疫调节作用

目的通过体内外实验研究鸢尾素irisin对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其免疫调节作用。方法体外分离培养乳鼠心肌细胞,并经柯萨奇B3病毒(CVB3)感染诱导心肌细胞凋亡,利用流式细胞术检测各组心肌细胞经10、50、100μg/L的irisin作用后细胞凋亡情况。构建CVB3接种感染Balb/c小鼠的体内病毒性心肌炎模型,并分成空白对照组、模型组和10、50、100μg/kg irisin蛋白治疗处理的irisin作用组,利用流式细胞术检测各组小鼠外周血中相关免疫细胞(NK、CD4~+T、CD8~+T、CD4~+/CD8~+)和淋巴细胞中Treg和Th17细胞比例变化;ELISA方法检测各组小鼠心肌组织中炎性相关细胞因子水平的变化。结果与对照组相比,模型组心肌细胞凋亡率显著上升,而各低、中、高浓度irisin作用组心肌细胞凋亡率逐渐下降(P0.05);与对照组相比,模型组小鼠的NK、CD4~+T细胞比例、CD4~+/CD8~+比值均显著下降(均P0.05),CD8~+T、Treg、Th17细胞比例和相关炎性细胞因子水平则均显著上升(均P0.05);经过不同浓度irisin治疗作用后,各组病毒性心肌炎小鼠的NK、CD4~+T细胞比例、CD4~+/CD8~+比值逐渐上升,且CD8~+T、Treg、Th17细胞比例和相关炎性细胞因子水平均逐渐下降(均P0.05)。结论鸢尾素irisin能够抑制CVB3病毒诱导的病毒性心肌炎心肌细胞凋亡,并可通过调控Treg/Th17细胞比例来改善病毒性心肌炎机体的免疫反应。     

短双链RNA对CVB3病毒细胞内清除作用的可行性研究及其机制探讨

目的 通过观察短双链RNA(Short interfering RNA,siRNA)体外转染HeLa细胞评价siRNA抗CVB3病毒感染的可行性和抑制作用机制.方法 通过细胞病变作用保护实验,选择合适的siRNA剂量.Western Blot、RT-PCR等方法在体外检测siRNA抗CVB3病毒复制作用及作用途径.结果siRNA-3753通过脂质体转染试剂能高效转入HeLa细胞,转染效率可达98.77%,在细胞内可稳定长达48 h.siRNA-3753的浓度为0.6 μmol/L对病毒抑制率高同时对细胞不会产生毒性作用,该浓度作为本次研究的实验剂量.siRNA-3753抗CVB3病毒感染作用是通过siRNA直接降解病毒基因得到的,而不是通过激活PKR或干扰素等其他未知因素起效的.结论 siRNA可以高效、较长时间的转染入HeLa细胞内,在低剂量时即产生较好的抗病毒感染作用,通过直接降解病毒基因组的途径特异性抑制CVB3病毒的复制及感染.     

柯萨奇病毒B组5型感染的人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系lncRNA表达谱分析

目的探索柯萨奇病毒B组5型(CVB5)感染人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系(RD)中差异长链非编码RNA(lncRNA)表达谱,为研究CVB5与宿主之间相互作用分子机制提供参考。方法 CVB5按感染复数(MOI)为1接种RD细胞24 h后提取总RNA。采用转录组测序技术获取细胞中lncRNA差异表达谱;通过聚类分析、GO分析和KEGG通路富集对差异表达转录本进行了生物信息学分析。同时,利用RNAfold软件对lncRNA进行了二级结构预测。结果与对照组相比,CVB5感染RD细胞后,共有1 754个mRNAs和508个lncRNA呈上调表达,3 106个mRNAs和760个lncRNA呈下调表达。差异表达lncRNA的共表达基因主要富集在分子结构活性、蛋白质分子结合和体液免疫反应等生物过程;lncRNA靶基因主要参与嗅觉传导途径、细胞因子受体相互作用和神经活性配体受体相互作用等通路。此外,实时荧光定量PCR验证的7个差异表达lncRNA与测序结果一致。结论 CVB5感染RD细胞后,差异显著性lncRNA主要参与了免疫相关过程,为充分理解lncRNA在CVB5感染中的调控作用奠定了基础。     

NF-κB蛋白在柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌细胞焦亡过程中的调控作用

目的:探讨NF-κB蛋白对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌细胞焦亡的调控作用.方法:将编号后的45只雄性BALB/c小鼠根据随机数表法平均分为3组,分别为对照组(normal组)、病毒性心肌炎组(CVB3组)和NF-κB蛋白抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)处理组(CVB3+PDTC组),每组各...     

小干扰RNA在心肌细胞中对柯萨奇病毒B3复制的抑制作用研究

目的 通过在原代心肌细胞培养上研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的基因干扰对病毒增殖的抑制和细胞内免疫清除作用,评价siRNA在治疗病毒性感染中的可能性.方法 体外制备BALB/c乳鼠心肌细胞,利用脂质体和电穿孔转染方法转染siRNA后感染病毒,流式细胞术、中性红染色和病毒致细胞病变作用(CPE)保护实验评价转染效率和细胞生长状态,空斑形成减少实验、RT-PCR等方法检测抑制病毒程度.结果 通过在HeLa细胞上的筛选,针对病毒不同区域的siRNA呈现出不同的抗病毒作用,靶序列位于2B区的siRNA-3753能显著抑制柯萨奇病毒B3(CVB3)感染.在原代培养的心肌细胞中,转染siRNA-3753后同样显示出很好的抗病毒效果,心肌的搏动、心肌细胞的生长状况保持着较好的状态.而病毒对照和非特异性siRNA-non感染24 h后,细胞停止搏动,逐步变圆,皱缩死亡.测定培养上清和细胞内的病毒滴度,电转siRNA-3753对病毒抑制率可以达到98.1%,脂质体转染siRNA-3753对病毒抑制率为78.2%.电穿孔转染效率可以达到56.03%,脂质体为9.0%.结论 针对CVB3基因组2B区的siRNA在保护心肌细胞抵抗CVB3病毒感染实验中具有抑制病毒复制作用.