三氧化矿物凝聚体对成人牙髓干细胞增殖和分化的影响

目的:研究不同浓度的三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)对成人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖和分化的影响。方法:体外培养hDPSCs,分别以不同浓度MTA浸提液作用于hDPSCs。采用四甲基偶氮噻唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)法测定MTA对hDPSCs增殖的影响;Von Kossa染色法检测hDPSCs钙化结节的形成;通过酶标仪法检测hDPSCs碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)的活性;运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphopro-tein,DSPP)基因的表达。采用单因素方差分析对数据进行统计学分析。结果:2 mg/mL MTA能促进hDPSCs增殖,其ALP活性也明显高于其他各组,并可见Von Kossa染色呈阳性,有钙化结节形成,且能明显促进牙髓干细胞表达DSPP;而20 mg/mL MTA则抑制hDPSCs的增殖,ALP活性明显低于其他各组,Von Kossa染色阴性;而0.2 mg/mL MTA组及氢氧化钙组未能表现出明显的增殖分化活性。结论:2 mg/mL MTA能促进hDPSCs的增殖,并能诱导hDPSCs向成牙本质细胞方向分化。20 mg/mL MTA抑制hDPSCs的增殖,并且抑制hDPSCs向成牙本质细胞方向分化。     

DLK1对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响

目的研究DLK1在人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖分化中的作用。方法用免疫组织化学分析法来检测小鼠上颌第一磨牙中DLK1的表达。构建重组慢病毒使DLK1在hDPSCs中稳定过表达,用CCK8法和Ed U核素渗入法分别检测hDPSCs的细胞活力和增殖;hDPSCs进行成牙本质细胞向分化诱导后,通过ALP活性分析、ALP和茜素红染色,以及ALP、DSPP、DMP1等矿化相关基因的表达,研究hDPSCs的成牙本质细胞向的分化。结果 DLK1在小鼠上颌第一磨牙的成牙本质细胞和牙髓细胞中高表达,而且正常hDPSCs在成牙本质细胞向分化诱导14 d后,ALP蛋白水平增长1.6倍,DSPP增长1.16倍,DMP1增长1.42倍,DLK1增长1.54倍。hDPSCs中过表达DLK1后,相比于对照组增加了1.7倍,显著促进了细胞增殖,却抑制了其成牙本质细胞向分化。结论 DLK1在牙齿发育中发挥重要作用,DLK1过表达促进hDPSCs的增殖,但抑制其成牙本质细胞向分化。     

血管生成素4对牙髓干细胞成牙本质向分化的作用

目的 探讨血管生成素4(angiopoietin 4,ANGPT4)对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响。方法 本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准,并获得患者知情同意。将人前磨牙进行固定、脱钙、脱水、包埋和切片,免疫荧光染色观察ANGPT4的表达及定位。体外分离培养人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）,于倒置相差显微镜下观察hDPSCs的生长状态及形态;流式细胞术检测细胞表面相关分子标志物的表达;碱性磷酸酶和茜素红S染色鉴定h DPSCs成牙本质向分化的潜能;油红O染色鉴定hDPSCs成脂向分化潜能。提取hDPSCs成牙本质向诱导后不同时间点的RNA,采用RT-qPCR分析hDPSCs体外成牙本质向分化过程中ANGPT4基因及成牙本质细胞相关基因的表达。采用siRNA基因沉默技术沉默hDPSCs中ANGPT4基因的表达,通过RT-qPCR和Western blot检测沉默效率;在hDPSCs中沉默ANGPT4基因表达24 h后进行成牙本质向诱导,在诱导的第7天和14天分别进行碱性磷酸酶和茜素红S染色,检测沉默ANGPT4后hDPSCs的...     

沉默整合素α6通过激活FOXO1信号通路促进人牙髓干细胞的成牙本质向分化

目的:探讨沉默整合素α6(integrinα6,ITGA6)是否通过激活FOXO信号通路影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)的成牙本质向分化。方法:利用课题组前期构建的ITGA6沉默慢病毒干扰hDPSCs,通过Real-time PCR和Western blot验证干扰效率,同时检测空载组(sh-NC)和ITGA6沉默组(sh-ITGA6)的FOXO信号通路活性。然后用AS1842856抑制FOXO1,经矿化诱导7 d后进行Western blot和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色来观察hDPSCs的成牙本质向分化情况。结果:Real-time PCR和Western blot结果显示构建的ITGA6沉默慢病毒能有效干扰hDPSCs中ITGA6的表达;与sh-NC组比,sh-ITGA6组FOXO1在mRNA水平表达上调(P<0.05),同时Western blot结果显示其在胞核表达量增加(P<0.05);Western blot检测成牙本质向分化标记物显示,sh-ITGA6组牙本质...     

脐静脉内皮细胞与牙本质浸提液诱导的牙髓干细胞共培养成血管的研究

目的:探讨共培养牙本质浸提液(dentin extract, DE)诱导的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)在成血管方向的潜能。方法:制备人牙本质浸提液,分别诱导培养hDPSCs 7 d和14 d后,Real-time PCR和Western blot检测诱导后hDPSCs中牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达;血管形成实验共分为5组,分别是:HUVECs组、DE诱导后的hDPSCs组以及按5∶1、5∶5、5∶10比例共培养HUVECs和诱导后hDPSCs组,分别在第3、6、9h检测各组小管形成的相对长度和节点数目。结果:DE诱导的hDPSCs 在mRNA和蛋白水平上表达的DSP、DSPP和DMP-1显著提高(P＜0.05);体外小管形成实验结果示共培养组较早形成稳定的网状结构,在3 h时,HUVEc与诱导后hDPSCs比例为5∶1组形成的小管相对长度和相对分支点数明显高于HUVECs组(P＜0.05),而5∶5组和5∶10组低于HUVECs组(P＜0.05)。结论:牙本质浸提液诱导后的hDPSCs与HUVECs按一定比例共培养可促进血管结构的形成。     

人成牙本质细胞样细胞的原代培养

目的：培养人原代牙本质细胞。方法：取引产的8月龄死胎，剥离乳磨牙胚牙乳头，组织块法培养。然后采用滤纸片法挑取了3个与成牙本质细胞形态相似的细胞克隆，扩大培养。对培养细胞从形态学、矿化结节、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、人牙本质基质蛋白-1（human dentin matrix protein-1,hDMP-1）和人牙本质涎磷蛋白（human dentin sialophosphoprotein,hDSPP）在mRNA水平上的表达等方面进行鉴定。结果：有一个克隆来源的细胞呈梭形、有单侧较长细胞突起，未见核极化，同时它们具矿化功能，表达人成牙本质细胞特异性标志hDMP-1、hDSPPmRNA。结论：该培养细胞为人成牙本质细胞样细胞，为进一步的有关研究奠定了基础。     

尼古丁抑制成牙本质细胞增殖及作用机制的研究

目的观察尼古丁对成牙本质细胞增殖的抑制作用，并检测其对成牙本质细胞中Ca2+浓度的影响，以探讨尼古丁抑制成牙本质细胞的分子机制。方法体外培养成牙本质细胞系MDPC- 23细胞, 按每毫升2×104个接种，随机分为实验组和对照组，对照组不加任何刺激，实验组施加质量浓度为100 μg/mL尼古丁，并于8 h后加入浓度为10 μmol/L BrdU进行细胞周期标记，刺激24 h后固定细胞，行免疫荧光抗BrdU染色，碘化丙锭（PI）复染胞核，荧光显微镜下计数细胞总数与BrdU阳性细胞数，计算S期阳性细胞率并进行统计学分析。培养成牙本质细胞于特制培养皿中，施加质量浓度为100 μg/mL尼古丁刺激，激光共聚焦显微镜下检测成牙本质细胞中Ca2+浓度的动态变化。结果实验组、对照组S期阳性细胞率分别为36.3%、48.2%，实验组显著低于对照组。尼古丁刺激后，成牙本质细胞中Ca2+浓度迅速升高，在较高水平维持一段时间后缓慢下降。结论尼古丁可抑制成牙本质细胞增殖，这种作用同尼古丁升高成牙本质细胞中Ca2+浓度有关。     

p38β在矿化诱导液诱导的人牙髓细胞成牙本质向分化中的作用

目的研究p38β丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)对矿化诱导液诱导的人牙髓细胞(h DPC)成牙本质向分化的影响。方法体外培养hDPC,Western blot检测hDPC矿化诱导0、3、7、14 d后p38β蛋白表达情况;构建3条慢病毒载体p38β鄄shRNA并分别转染hDPC,Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p38β蛋白及基因表达;设立空白对照组、矿化诱导(OM)组、OM+空载体(NC)组、OM+sh鄄p38β组共4组。成牙本质向矿化诱导1、7、14 d,实时荧光定量PCR检测成牙本质向分化指标牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)的基因表达;Western blot检测成牙本质向分化指标DSPP蛋白的表达;成牙本质向矿化诱导14 d,茜素红染色检测矿化结节的形成情况。结果 Western blot结果表明正常牙髓组织中存在p38β蛋白;成功构建p38β稳定低表达的hDPCs(实时荧光定量PCR显示三条序列干扰效率分别为55.4%、68.3%、54.2%);实时荧光定量PCR显示沉默p38β的hDPCs经矿化诱导后,成牙本质向分化指标DSPP、ALP基因表达水平显著降低,Western blot结果显示成牙本质向分化指标DSPP蛋白表达水平显著降低;茜素红染色结果显示,矿化诱导+sh鄄p38β组与空白对照组较另外两组的矿化结节数量明显减少。结论 p38β在OM诱导的h DPC成牙本质向分化中发挥作用。     

KEAP1-NRF2/HO-1通路介导LED红光促高糖诱导下人牙周膜干细胞成骨分化及减轻氧化损伤

目的 探讨Kelch样ECH相关蛋白1-核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(Kelch-like ECH associated protein 1-nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1,KEAP1-NRF2/HO-1)通路介导发光二极管(light-emitting diode,LED)红光对高糖诱导下人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化和氧化损伤的影响,为LED红光在细胞抗氧化损伤中的应用提供依据。方法 流式细胞术、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和茜素红染色鉴定hPDLSCs;高糖预处理hPDLSCs 48 h,用1、3、5 J/cm2LED红光照射细胞,CCK-8实验选择促细胞增殖率高的辐射曝光量进行后续实验。将hPDLSCs分为对照组、高糖组、高糖+光照组;ALP染色、ALP活性检测、茜素红染色和半定量分析检测成骨分化能力,qRT-PCR和Western blot检测细胞成骨相关...     

组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响研究

目的研究组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质向分化的影响。方法原代分离培养DPSCs,用流式细胞术和茜素红染色鉴定DPSCs。体外诱导DPSCs成牙本质向分化不同时间(0、3、5、7、14 d),qRT-PCR检测Jmjd3及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达情况。用不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3抑制剂GSK-J4处理DPSCs 14 d,q RT-PCR检测DSPP、DMP1的表达情况。结果原代培养的DPSCs表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD146,体外诱导培养具有成骨分化潜能。DPSCs成牙本质向分化过程中,Jmjd3、DSPP、DMP1表达水平均上调(P<0.05),且可能具有时间依赖性。10μmol/L GSK-J4处理DPSCs可明显抑制DSPP、DMP1的表达(P<0.05)。结论Jmjd3在DPSCs成牙本质向分化过程中发挥正调节作用,且与其去甲基化酶活性相关。     

TNF-α影响鼠根尖乳头干细胞成骨/成牙本质能力的实验研究

目的研究肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对鼠根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)增殖及成骨/成牙本质能力的影响。方法分离大鼠根尖乳头组织,采用酶消化法结合组织块法获得SCAP并通过免疫荧光法进行细胞鉴定;将细胞分为实验组(TNF-α浓度5、10、15、20、30、40、50μg/L)和对照组(TNF-α浓度0μg/L),CCK-8法检测细胞增殖能力;采用碱性磷酸酶活性、茜素红染色及实时定量PCR检测TNF-α对SCAP成骨/成牙本质能力的影响。结果体外培养SCAP符合间充质干细胞来源的特征且具有多向分化能力;细胞增殖能力结果显示:各浓度组均能促进SCAP增殖(P<0.05);ALP活性结果显示:各浓度TNF-α均能明显降低ALP活性(P<0.05);茜素红染色结果显示:随着TNF-α的浓度的增加,染色逐渐变浅,红色结节逐渐变小,形成数量逐渐减少;qRT-PCR结果显示:3 d时,实验组OC、DMP-1表达量明显降低(P<0.05),牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达量降低(P>0.05),骨涎蛋白(BSP)表达量稍有增加(P<0.05)。7 d时,OC、DSPP表达量明显降低(P>0.05),DMP-1表达量明显降低(P<0.05),BSP表达量与对照组相比仍稍有增加(P>0.05);14 d时,BSP、OC、DMP-1表达量均明显降低(P<0.05),DSPP表达量稍有增加(P>0.05)。结论炎性因子TNF-α对SCAP的增殖有促进作用同时不同程度抑制SCAP成骨/成牙本质向分化能力。     

炎症微环境下可溶性环氧化物酶抑制剂对人根尖牙乳头干细胞增殖及分化的影响

目的:探讨在炎症微环境下,可溶性环氧化物酶抑制剂(TPPU)对人根尖牙乳头干细胞(hSCAPs)增殖和分化的影响.方法:采用流式细胞仪以及成骨诱导后茜素红染色鉴定hSCAPs;1 mg/mL脂多糖(LPS)处理hSCAPs模拟炎症微环境,然后用10μmol/L TPPU作用于hSCAPs,分别在第1、3、5、7天,通过CCK-8法观察TPPU对hSCAPs增殖能力的影响;在第24小时,实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测炎症相关因子表达.在成骨诱导后的第7、12天,通过qRT-PCR检测成骨分化相关基因的表达;第8天通过碱性磷酸酶染色来分析碱性磷酸酶活性,第21天用茜素红染色观察矿化结节形成.结果:流式细胞仪结果与茜素红染色鉴定实验细胞为hSCAPs.用1 mg/mL LPS处理hSCAPs后,在第1、3、5、7天时,TPPU+LPS组、LPS组和vehicle组细胞增殖无差异(P>0.05).在用LPS处理hSCAPs 24 h后,相对于vehicle组,LPS组白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)表达显著上调(P<0.05),LPS+TPPU组IL-1β、IL-6的表达明显低于LPS组(P<0.05).成骨诱导液培养hSCAPs一定时间后,检测发现相对于LPS组,LPS+TPPU组碱性磷酸酶(ALP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达显著上调(P<0.05).且TPPU处理组较LPS组碱性磷酸酶染色和茜素红染色均加深.结论:在体外炎症微环境下,TPPU可以抑制hSCAPs炎性因子的表达.其次,在炎症微环境下TPPU对hSCAPs的增殖可能并没有明显的促进作用,但TPPU可在一定程度上促进hSCAPs的成牙/成骨分化.     

短期高浓度氟对小鼠磨牙胚中牙本质涎蛋白表达的影响

目的:研究短期高浓度氟对小鼠磨牙成牙本质细胞形态及牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)表达的影响,探讨氟对牙本质发育的作用机制.方法:选择4 d龄的ICR小鼠共32 只,随机分为2 组,每组16 只,各组中实验动物和对照动物各半.实验动物单次腹腔注射剂量分别为10 mg/kg体重和20 mg/kg体重的NaF,对照动物单次腹腔注射等剂量的NaCl,注射量均为10 μl/g, 24 h后处死动物.采用HE染色、免疫组化染色观察高浓度氟对小鼠磨牙不同分化阶段成牙本质细胞形态及DSP的表达,采用SPSS 13.0软件对数据进行分析.结果:实验组分泌期成牙本质细胞形态紊乱,正常的高柱状形态丧失,DSP的表达明显强于对照动物,差异有统计学意义(P<0.01),而成熟期成牙本质细胞未见明显变化.结论:短期高浓度氟能增强分泌期成牙本质细胞中DSP的表达,抑制成牙本质细胞的增殖分化及随后的基质合成与分泌,从而影响牙本质的发育.     

外泌体诱导3D纳米纤维小管中牙髓干细胞成骨/成牙本质向分化的作用研究

目的    探究基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α）诱导的根尖牙乳头干细胞来源外泌体（exosomes derived from stem cells from apical papilla,SCAP-Exo）对3D纳米纤维小管中牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）增殖和成骨/成牙本质向分化的影响。方法    提取SDF-1α诱导的SCAP-Exo,采用透射电镜、纳米粒子跟踪技术及Western Blot进行鉴定。将DPSCs培养于3D纳米纤维小管中,扫描电镜观察DPSCs的形态与黏附状态。使用不同质量浓度（0、50、100 μg/mL）的SCAP-Exo刺激3D纳米纤维小管中的DPSCs,分别记为对照组、50 μg/mL SCAP-Exo组和100 μg/mL SCAP-Exo组,并对细胞增殖活力和碱性磷酸酶（ALP）活性进行检测;实时RT-PCR和Western Blot分别检测成骨/成牙本质向分化相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果    SCAP-Exo形态呈茶托状,具有双层膜结构,平均粒径为126.4 nm,能够表达外泌体标志蛋白CD9和CD81。扫描电镜观察显示DPSCs在3D纳米纤维小管中的黏附状态良好。50 μg/mL SCAP-Exo组和100 μg/mL SCAP-Exo组DSPCs的增殖活力和ALP活性均高于对照组,且100 μg/mL SCAP-Exo组较50 μg/mL SCAP-Exo组的ALP活性升高更显著（均P < 0.05）。100 μg/mL SCAP-Exo组成骨/成牙本质向分化基因（ALP、DMP-1、BSP和OCN）的mRNA和蛋白表达水平均高于对照组（均P < 0.05）。结论    DPSCs可在3D纳米纤维小管中维持良好的增殖活力。SDF-1α诱导的SCAP-Exo可增强3D纳米纤维小管中DPSCs的增殖活力和ALP活性,以及促进其向成骨/成牙本质向分化。     

猪牙本质基质蛋白提取物的分离纯化及其活性检测

目的:从猪牙胚中获得牙本质基质蛋白提取物(Dentin Matrix Protein Components,DMPCs)并检测其生物活性.方法:用4 mol/L盐酸胍和0.5 mol/L EDTA提取6月龄猪第二磨牙牙胚,获得DMPCs,用蛋白质液相色谱法分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测分子量,MTT法测定DMPCs对人牙髓干细胞(human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs)生长的影响,同时测定DMPCs对hDPSCs碱性磷酸酶(ALP)活性的影响.结果:牙本质基质蛋白分子量为94×103、38×103、20×103以及一些小分子.体外实验证实,细胞培养1 d,100 μg/mL上调hDPSCs ALP活性(P<0.05);培养3 d,100、150μg/mL组均可促进细胞增殖以及上调ALP活性(P<0.05).结论:牙本质基质蛋白提取物可以促进hDPSCs的增殖,提示混合蛋白组分相互作用可以促进细胞增殖分化.     

敲低F-ATPase促进变形链球菌感染人牙髓成纤维细胞成骨/成牙本质分化的研究

目的:研究敲低耐酸因子F-ATPase促进变形链球菌感染人牙髓成纤维细胞(human dental pulp fibroblasts,HDPFs)成骨/成牙本质分化的作用。方法:培养HDPFs并采用免疫荧光染色、流式细胞术进行鉴定,而后分为对照组、感染组、感染+si-NC组、感染+si-F-ATPase组、感染+si-F-ATPase+NLR家族PYRIN域蛋白3(NLRP3)激动剂(NIG)组。比较各组间白介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(Runx2)以及成骨诱导分化后茜素红染色OD540nm值、碱性磷酸酶(ALP)活力的差异。结果:感染组HDPFs中IL-1β、IL-18、TNF-α的含量,NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1的表达量均高于对照组,OCN、Runx2表达量及成骨诱导后的OD540nm水平、ALP活力均低于对照组;感染+si-F-ATPase组HDPFs中IL-1β、IL-18、TNF-α的含量,NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1的表达量均低于感染组,OCN、Runx2表达量及成骨诱导后的OD540nm水平、ALP活力均高于感染组;感染+si-F-ATPase+NIG组HDPFs中IL-1β、IL-18、TNF-α的含量,NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1的表达量均高于感染+si-F-ATPase组,OCN、Runx2表达量及成骨诱导后的OD540nm水平、ALP活力均低于感染+si-F-ATPase组。结论:敲低F-ATPase能够促进变形链球菌感染HDPFs的成骨/成牙本质分化,抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应是可能的分子机制。