肺癌患者耶氏肺孢子菌的隐性感染研究

目的检查肺癌患者的耶氏肺孢子菌(Pneumocystisjiroveci,P.jiroveci)的隐性感染情况,为癌症患者的化疗、肺孢子菌肺炎的预防提供参考依据。方法收集了50份未接受化疗的肺癌患者的肺癌旁肺组织标本及其相关信息,采用Giemsa、GMS病原学染色法和PCR扩增技术检测该组患者P.jiroverci的自然隐性感染率。并对感染者的年龄及性别进行了相关性分析。结果Giemsa、GMS、PCR三种方法检测到P.jiroveci的隐性感染率分别为Giemsa法2%;GMS法10%;PCR法为16%。X2检验结果显示三种不同检测方法的检测结果具有显著性差异(P<0.05)。对患者的年龄及性别的相关性分析结果表明,该组患者的P.jiroveci隐性感染情况无性别及年龄相关性。结论肺癌患者携带P.jroveci病原体,感染率为16%,提示这类患者存在发生肺孢子菌肺炎和成为传染源的潜在危险。对比本实验采用的三种检测方法,以PCR技术较为敏感。     

检测肺孢子菌巢式PCR方法的建立及其敏感性和特异性研究

目的建立检测肺孢子菌基因的特异性mtLSU巢式PCR方法,研究其在实验动物肺孢子菌感染模型的检测效果及其敏感性和特异性,以期为临床提供检测肺孢子菌定植或感染的新方法。方法依据肺孢子菌线粒体大亚基保守序列设计巢式PCR内、外引物,建立并优化检测肺孢子菌基因的巢式PCR体系。以免疫抑制诱导肺孢子菌感染大鼠模型为检测对象,比较mtLSU巢式PCR与六亚甲基四胺银（GMS）染色法检测肺孢子菌的阳性率及符合率。对阳性标本进行DNA纯化,构建分子克隆,采用倍比稀释法检测mtLSU巢式PCR的敏感性;以呼吸道感染常见的8种病原体（光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌、克柔假丝酵母菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、支原体）为对照,检测方法的特异性。结果肺印片GMS染色镜检实验组大鼠,14只查到肺孢子菌包囊,检出率为70.0%（14/20）,对照组检出率为0（0/20）。用mtLSU巢式PCR均能检测实验组大鼠肺孢子菌基因,阳性率为100%（20/20）,对照组均为阴性。mtLSU巢式PCR法阳性率与GMS染色法比较差异有统计学意义（P〈0.05）。敏感性检验结果表明,mtLSU巢式PCR检测最小量为366fg的肺孢子菌基因。特异性检测显示,其他8种呼吸道常见病原体的mtLSU巢式PCR的扩增结果均为阴性。结论成功建立了检测肺孢子菌基因的mtLSU巢式PCR方法,动物模型检测结果表明该方法的敏感性高、特异性强,有望应用于临床患者标本中肺孢子菌的基因检测。     

大鼠感染肺孢子菌模型诱导方法的优化

目的通过对实验条件的优化,建立一种高感染率和低死亡率的肺孢子菌感染模型诱导方法。方法以免疫抑制剂诱导大鼠自然感染肺孢子菌为基本方法,对比不同剂量、不同预处理方法、不同季节等因素对诱导大鼠肺孢子菌感染模型的成功率、感染度及动物死亡率等的影响。结果每鼠每次腹膜下注射2.5mg地塞米松(每周两次)至第8周,诱导的肺孢子菌感染率为87.50%,死亡率为0,3mg地塞米松组第7周诱导的肺孢子菌感染率为87.50%,死亡率为37.50%,2.0和3.5mg组感染率、死亡率分别为12.50%、0和75.00%、75.00%,差异有统计学意义(P<0.05);乙醚麻醉组肺孢子菌感染率为100%,非麻醉组为50.00%,差异有统计学意义(P<0.05);4~6月期间诱导的大鼠肺孢子菌感染率为62.50%,7~9月期间诱导的大鼠肺孢子菌感染率为100%,11月~次年1月组感染率为37.50%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论地塞米松腹腔内注射诱导大鼠感染肺孢子菌,以每鼠每次2.5~3mg为最佳剂量;辅助乙醚吸入麻醉可提高肺孢子菌感染率;夏秋季节诱导的大鼠肺孢子菌感染率较高。     

用PCR诊断不同虫荷量的大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的价值

目的　评价在不同虫荷量条件下用 PCR诊断大鼠卡氏肺孢子虫肺炎 (PCP)的价值。　方法　将 PCP大鼠随机分为药物治疗组及未治疗组 ,测定其肺虫荷量 ,收集其支气管灌洗液 (BAL F)和血清标本 ,用 PCR和半套式 (Sn) PCR检测标本中的卡氏肺孢子虫基因 ,比较 PCR和环六亚甲基四胺银 (GMS)染色结果 ,及与病鼠肺虫荷量的关系。　结果　虫荷量高的未治疗组病鼠的 BAL F标本 PCR、Sn PCR及 GMS染色阳性率分别为 10 0 %、10 0 %和 92 .6 % ,差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;而虫荷量低的治疗组的 PCR(88.1% )、Sn PCR(94 .9% )阳性率均显著高于 GMS染色镜检阳性率 (30 .5 % ) (P<0 .0 5 )。肺虫荷量 >5 0 0个 /mg肺的 PCP大鼠 ,血清 PCR阳性率显著高于≤ 5 0 0者 (分别为 4 2 .9%和 1.7% )。　结论　PCR可用于虫株负荷量较低时的 PCP诊断 ,对判断 PCP病情及疗效考核亦有一定的帮助。     

1341例疑似肺孢子菌肺炎非HIV阳性患者病原学诊断分析

目的探讨六亚甲基四胺银(gomori’s methenamine silver,GMS)染色镜检法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测肺孢子菌肺炎(pneumocystis pneumonia,PCP)患者标本的阳性率,为临床提供更有利的实验室支持依据。方法采集1341例疑似PCP患者的深部诱导痰或支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)标本,GMS镜检法和PCR法相结合检测肺孢子菌,任何一种方法检测阳性,即判断为PCP。结果共285例诊断为PCP,其中114例为GMS染色镜检法阳性,282例为PCR法检测阳性,111例为2种检测方法双阳性,3例为GMS染色镜检法单独阳性(均为肾移植术后BALF样品),171例为PCR方法单独阳性。深部诱导痰标本中,GMS染色镜检法和PCR法阳性检出率分别为5.1%和16.2%(P<0.05);而BALF标本二者的阳性检出率分别为23.3%和42.2%(P<0.05)。未知原因发热合并肺炎患者和器官移植后接受免疫抑制剂治疗者有更高的阳性检出率。结论 PCR法检测PCP阳性率高于GMS染色镜检法,PCR法检测与GMS染色镜检法结合诊断PCP对临床具有较高指导价值。     

肺孢子菌动物模型的建立及病原学和分子生物学检测技术研究

目的 目的 建立肺孢子菌动物模型, 并对肺孢子菌病原学和分子生物学检测技术进行研究。方法 方法 SD和Wistar大 鼠随机分为实验组和对照组, 实验组大鼠皮下注射地塞米松, 对照组皮下注射生理盐水。诱导8周后处死全部大鼠, 收 集其支气管肺泡灌洗液 （BALF） 和肺组织, 分别做涂片和肺印片, 染色后镜检。用FTA卡采集所有大鼠的BALF进行PCR 检测。对PCR产物进行测序, 利用BLAST软件将测序结果与GenBank数据库中的鼠源性肺孢子菌进行比对, 确定菌 种。结果 结果 共采集肺组织标本和BALF 各34份, 病原学检测显示实验组总感染率为29.2% （7/24）, 对照组感染率为0; 其 中SD和Wistar大鼠实验组感染率分别为25.0% （3/12） 和33.3% （4/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.31）; 实验组SD大鼠肺印 片和BALF 肺孢子菌阳性检出率分别为25.0% （3/12） 和16.7% （2/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.34）。实验组Wistar大鼠 肺印片和BALF 肺孢子菌阳性检出率分别33.3% （4/12） 和16.7% （2/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.24）。用PCR方法共检 测28份大鼠BALF样本, 实验组阳性检出率为91.7% （26/28）, 对照组均为阴性。对PCR产物进行测序分析, 发现其与 GenBank 已登录的大鼠源肺孢子菌 （JX499145、 GU133622、 EF646865） 的同源性均为100%。结论 结论 通过皮下注射地塞米 松可以建立肺孢子菌动物模型, SD大鼠与Wistar大鼠在作为肺孢子菌动物模型的选择上无显著差别。在早期感染阶 段, 适宜用PCR法进行肺孢子菌检测, 病原形态学检测漏检率高。     

妊娠期大鼠对卡氏肺孢子菌的易感性研究

目的研究妊娠期大鼠对卡氏肺孢子菌（Pneumocystiscarinii,PC）的易感性,为妇女孕期保健及优生优育提供参考。方法采用皮下注射地塞米松的方法建立大鼠肺孢子菌肺炎（pneumocystispneumonia,PCP）模型,作为环境中Pc的感染来源。于实验的第6周处死2只PCP大鼠,取肺组织印片,用改良四胺银（GMS）染色,镜检Pc的感染情况。妊娠组、非妊娠组大鼠各取10只,于实验的第6周末将鼠笼置于PCP模型大鼠的鼠笼两侧,实验第7、8、9周分别取3只、3只和4只妊娠组及非妊娠组大鼠,乙醚麻醉下处死并取肺组织,提取DNA,PCR扩增Pc的mtI。SUrRNA。结果PCP模型组大鼠肺印片GMS染色后油镜下观察,可见大量Pc包囊,证明PCP模型建立成功。PCR扩增妊娠组8只大鼠Pc阳性,感染率为80．00％（8／10）;非妊娠组6只大鼠Pc阳性,感染率60．O¨0％（6／10）。经Fisher确切概率法检验,两组大鼠的Pc感染率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论健康妊娠期大鼠对外源性Pc普遍易感,但感染率与非妊娠女鼠无明显善别．     

卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型的比较研究

目的　比较用SpragueDawley(SD)大鼠和Wistar大鼠建立卡氏肺孢子虫肺炎 (PCP)模型的差异。 方法　选用SD大鼠和Wistar大鼠 ,随机分为实验组和对照组 ,免疫抑制诱导建立动物模型 ;收集肺组织和支气管肺泡灌洗液 (BALF) ,分别制成肺印片和BALF涂片 ,作Giemsa染色 ,镜检卡氏肺孢子虫滋养体和包囊。结果　共收集实验组SD大鼠和Wistar大鼠的肺组织及BALF标本各 2 8份 ,经Giemsa染色后 ,在肺印片中查见Pneumocystiscarinii(Pc)虫体的阳性率分别为 89.2 9%和10 0 % ,两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;BALF阳性率分别为 6 0 .71%和 78.5 7% ,两者之间亦无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而同种大鼠的肺印片与BALF涂片 ,其阳性率之间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,且肺印片的检出率均显著高于BALF涂片。同种大鼠不同肺叶的肺印片 ,其阳性率之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　SD大鼠与Wistar大鼠作为PCP模型动物无明显差别     

PCR-ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA的研究

目的　建立卡氏肺孢子虫 (P.c )DNA的聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)方法 ,并探讨其应用价值。　方法　实验组患卡氏肺孢子虫肺炎的SD大鼠和Wistar大鼠各 2 8只 ,采用PCR法扩增大鼠肺组织DNA和支气管肺泡灌洗液 (BALF)DNA ,用PCR ELISA检测其扩增产物。 2 8只患病大鼠分别制作肺组织印片及BALF涂片 ,姬姆萨 (Giemsa)染色镜检 10 0个视野中有无P .c包囊 (或滋养体 ) ,与PCR ELISA检测扩增产物结果比较。　结果　两种方法检测大鼠肺组织DNA阳性率及BALFDNA阳性率 ,结果相同 ,均分别为 96.4% (27/28)和100% (28/28)。Giemsa染色镜检P.c包囊 (或滋养体 ) ,结果为阳性的大鼠 ,PCR ELISA检测扩增产物结果也均为阳性。阴性对照组 ,两种大鼠的肺组织和BALF各10份标本 ,均有1只大鼠阳性。　结论　PCR ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA ,敏感性较高 ,特异性较好 ,操作简便 ,具有实用价值。     

肺孢子虫感染大鼠模型的建立及ITS巢式PCR检测敏感性研究

目的 建立肺孢子虫感染大鼠模型并探讨ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫DNA的敏感性. 方法 大鼠分为实验组和对照组,实验组从第1周开始用每周2次每次每只皮下注射地塞米松1 mg的方法诱导,共8周,并分别在首次注射后第2、4、6、8周解剖大鼠制作肺印片、肺组织匀浆液及支气管肺泡灌洗液(BAL)涂片,并进行六亚甲基四胺银(Gomori's methenamine silver,GMS)染色镜检;对照组不作激素注射,并分别在0周和第10周剖杀染色检查.同时分别提取大鼠BAL和肺组织的肺孢子虫DNA进行巢式PCR扩增,比较GMS法和ITS巢式PCR检测的敏感性. 结果 实验组从第6周开始染色镜检,可见少量肺孢子虫包囊,第8周肺印片、肺组织匀浆液均检测到包囊,检出率为100%(10/10),BAL的检出率为80%(8/10),对照组则均未检出.用ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR法均能检测出实验组第8周大鼠BAL和肺组织卡氏肺孢子虫DNA,阳性率为100%(10/10),对照组均为阴性.比较BAL标本、肺印片和肺组织匀浆液GMS染色法的检出率,BAL最低,肺组织匀浆液最高.其中20%(2/10)大鼠的BAL标本用GMS染色法未能检出,但用巢式PCR方法均能成功扩增.结论成功用地塞米松诱导法建立了肺孢子虫大鼠感染模型;ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫敏感性高、特异性强,可推广应用于临床诊断肺孢子虫肺炎.     

聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本对卡氏肺孢子虫肺炎的诊断价值

目的 评价聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本中卡氏肺孢子虫DNA对卡氏肺孢子虫肺炎（PCP）的诊断意义。方法 分别用姬姆萨和六胺银（GMS）两种染色方法和mt-rRNA-PCR方法检测痰液中的卡氏肺孢子虫。结果 化学染色法检测16例临床拟诊PCP的患者痰标本。结果 8例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,化学染色方法的敏感性和特异性分别为50％和100％。PCR方法检测16例临床拟诊PCP患者痰液中卡氏肺孢子虫,14例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,mt-rRNA-PCR方法的敏感性和特异性分别为88％和100％。结论 姬姆萨和GMS两种细胞化学染色方法联合检测痰标本卡氏肺孢子虫,特异性高,但敏感性偏低。mt-rRNA-PCR检测痰标本中卡氏肺孢子虫DNA方法敏感性高于化学染色法且特异性高,更适于临床应用。     

艾滋病合并肝脏肺孢子虫病一例病理观察

目的　观察艾滋病合并播散性肺孢子虫病的肝脏改变。　方法　用 HE、PAS、吉氏、六胺银和抗酸染色观察 1例艾滋病患者肝穿刺组织病理改变。　结果　肝组织有肉芽肿形成 (抗酸阴性 ) ,血窦中见大量病原体(PAS阳性 )。吉氏、六胺银染色和电镜所见证实为肺孢子虫 (PC)感染。　结论　本例肝脏病变是肺外肺孢子虫病引起 ,为全身性播散的表现。     

PCR检测大鼠卡氏肺孢子虫的研究

目的探讨PCR技术检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值。方法SD大鼠和Wistar大鼠均随机分成实验组和对照组,实验组每周两次皮下注射醋酸可的松,诱导产生卡氏肺孢子虫;8week后,收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF),用PCR技术检测卡氏肺孢子虫DNA,并与Giemsa染色法比较。结果实验组两种大鼠肺组织卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为9643%和100%,BALF阳性率亦分别为9643%和100%,它们之间均无显著性差异(P>005);BALF的PCR阳性检出率显著高于Giemsa病原染色法,肺组织的两种方法检出率无显著性差异。结论PCR是一种检出率较高的方法,可作为早期诊断PCP的常规方法,特别适用于BALF检测卡氏肺孢子虫DNA。     

The estimation of Pneumocystis carinii in HIV-infected patients occurrence based on three different methods

The frequency of Pneumocystis carinii occurrence in BAL of 38 HIV-infected patients was determined with three different method. BAL sediments were stained with Giemsa method, silvered according to Gomori-Grocott method and studied with indirect immunofluorescence assay. Using Giemsa method staining Pneumocystis carinii was diagnosed in 81.6% of patients, in Gomori-Grocott method--in 31.6% of patients, but results of indirect immunofluorescence assay were positive only in 23.,7%. In our study staining BAL sediments with Giemsa method allowed to detect Pneumocystis carinii in the highest percentage of examined patients.     

卡氏肺孢子虫PCR方法敏感性研究

目的从3种PCR方法中选择出一种检测卡氏肺孢子虫(Pc)敏感性最高的PCR方法,供以后的实验中应用。方法Wistar大鼠30只,皮下注射地塞米松,每周二次,制备PCP动物模型,8周后全部剖杀作大鼠肺印片,六亚甲基四胺银染色。各鼠取肺组织02g,均浆后提取DNA,用三种PCR方法作PCR试验。选取六亚甲基四胺银染色和三种PCR检测均为阳性的大鼠DNA标本20份,对每份标本作对倍稀释1/2、1/4、1/8、1/16……至1/2048,同时用三种PCR方法做扩增试验直到某一稀释度时PCR试验阴性为止,选择出最为敏感的一组PCR方法,并做统计学分析。结果三种方法最低稀释度的均数DHFR-PCT为1/7879±174;TS-PCR为1/4371±207;MT-PCR为1/10975±136。结论三种检测Pc的PCR方法中以MT-PCR方法最为敏感。