嗅鞘细胞体外CFSE染色的标记方法研究

目的:建立荧光活性染料CFSE以适宜终浓度标记体外培养的嗅鞘细胞的染色方法。方法:CFSE以2、5、10μM 3种不同终浓度标记原代培养的嗅鞘细胞,通过流式细胞术、台盼蓝染色和荧光显微镜,检测和观察CFSE染色的阳性细胞率、细胞活力、生长形态特点和增殖情况。结果:3种终浓度CFSE标记嗅鞘细胞的阳性标记率均>99%;2μM CFSE标记的细胞活力最高(P<0.05),细胞生长增殖较快,但随时间推移荧光强度明显减弱。结论:CFSE可用于标记嗅鞘细胞,本研究条件下,2μM的终浓度较为适宜。     

比较不同浓度CFSE荧光标记脐血细胞后存活率的实验研究

目的比较使用CFSE作为荧光标记物标记脐血细胞后各组细胞存活率的实验研究。方法使用5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L浓度的CFSE工作液对脐血细胞进行标记并计算每组细胞的细胞存活率,进行统计分析。结果 6组不同CFSE终浓度之间的细胞存活率存在显著性差异(P<0.05),且随着CFSE终浓度的增加,细胞存活率有一定程度的下降。不同时间之间的细胞存活率存在显著差异(P<0.01),随着时间的推移,细胞存活率不断下降,且时间差异要比浓度之间的差异显著。结论 CFSE标记的脐血细胞随培养时间延长存活率下降,而浓度对细胞存活率影响较时间小。     

纳米荧光染料C—dots标记细胞的应用

目的探讨一种新型纳米荧光染料C-dots作为细胞标记物的应用。方法不同直径的C-dots和B16小鼠黑色素瘤细胞共同培养,用激光共聚焦荧光显微镜观察C-dots被摄取及在细胞内分布情况。利用MTT比色法测定C-dots标记的细胞及未标记细胞的增殖情况;用台盼蓝染色法检查标记细胞活性。结果直径10 nm和5 nm C-dots可用于标记细胞。在共聚焦显微镜下,可见C-dots标记细胞的细胞膜带有近红外荧光。利用MTT比色法测定标记及未标记细胞的A值无显著差异,C-dots标记细胞的活性与对照组相比也无显著差异。结论C-dots可作为细胞内的标记物,用于细胞示踪、增殖试验等研究。     

氯甲基苯甲酰氨荧光染料标记大鼠骨髓间质干细胞的体内示踪

背景：目前广泛应用于骨髓间质干细胞的标记方法主要为绿色荧光蛋白标记法，但标记与固定程序复杂，操作繁琐，易出现偏差。氯甲基苯甲酰氨（Chloromethyl—benzamidodialkylcarbocyanine，CM-Dil）是亲脂性膜荧光染料，能够与含有肽和蛋白质的硫氢基结合进而标记整个细胞。目的：探讨CM—Dil对大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的可行性。设计、时间及地点：体内外细胞学观察，于2007—05／12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学动物实验中心完成。材料：SPF级Wistar大鼠40只，由中山大学实验动物中心提供。CM—Dil为美国Sigma公司产品。方法：在体外，以标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为实验组，以未标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为对照组，比较两组细胞生长与增殖情况，MTT法检测细胞生长增殖情况。在体内，分别将标记CM—Dil的骨髓间质干细胞经门静脉移植及肝内培养，于移植后第7，15，21，30天制备肝脏切片。主要观察指标：骨髓间质干细胞CM—Dil标记率，标记细胞在肝内定植、生长与分布。结果：体外培养结果显示，两组骨髓间质干细胞在细胞生长、增殖、分裂以及形态学上均基本相似，在绿色光激发下，CM—Dil发出红色荧光，24h后细胞标记率为100％，21d后CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭。体内实验中，经门静脉移植的骨髓间质干细胞在肝脏内主要位于间质，呈椭圆形或不规则形的分化细胞；肝内培养的骨髓间质干细胞在培养孔内呈“贴壁生长”，为椭圆形分化细胞，未发现骨髓间质干细胞进入并定植于肝组织内；CM—Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭的时间亦为21d。结论：CM—Dil染色简单、方便、稳定，荧光开始淬灭时间较长，可望成为大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的新方法。     

用猪AMI模型研究荧光染料CFSE和Brdu作为移植细胞标记物的实用性

目的研究荧光染料CFSE和Brdu作为体内细胞移植标记物的实用性.方法构建猪急性心肌梗死(AMI)模型.用CFSE和Brdu对骨髓单个核细胞进行双标记,经冠状动脉回输至MI区.4周后,利用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法分别观察CFSE和Brdu的定位和标记情况.结果细胞移植4周后,发现Brdu阳性细胞多位于心肌疤痕形成区且MI区的新生血管内壁也出现阳性染色.在MI区可见CFSE标记的带绿色荧光的细胞,但背景色较高.结论在动物实验中,CFSE和Br-du均可作为移植细胞标记物,Brdu的标记效果优于CFSE,适于同时进行形态学和组织学研究.     

细胞标记及MR示踪的进展

干细胞和祖细胞领域的研究最新进展表明这些细胞可以用来修复或替代人的缺陷和受损的机体细胞以达到治疗的目的,因此有理由相信在不久的将来,广泛的临床应用将是很有希望的.例如中枢神经系统疾病(包括脊髓损伤、帕金森病、脱髓鞘性疾病等)和心肌的修复再生、肝肾疾病的治疗也将从不断深入的细胞治疗研究中受益.     

应用荧光标记信使核糖核酸差异显示技术分离子宫肌瘤相关基因片段

目的：应用荧光标记的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)差异显示技术分离子宫肌瘤及正常子宫肌组织相关的差异基因片段。方法：用4种锚定引物和3种随机引物，共12种组合，结合Genomyx LR^TMDNA差异显示系统及Genomyx SC^TM荧光图像扫描系统，以及配套的Fluoro DD and HI-EROGLYPH mRNA Profile试剂盒，采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行子宫肌瘤及正常子宫肌组织相关差异基因片段的分离。结果：从子宫肌瘤及正常子宫肌组织间分离出相关的差异基因片段27条，差异片段中主要表现为条带密度的强弱差别。结论：子宫肌瘤的产生可能与某些基因表达的差异有关，而差异基因的序列及功能有待进一步研究。     

基于CFSE染色的小鼠淋巴细胞体内示踪方法的建立

目的确定CFSE标记小鼠淋巴细胞的条件,建立简单快速、稳定可行的淋巴细胞体内示踪方法。方法利用流式细胞术分别检测不同浓度CFSE、不同悬浮溶液(1640培养基、PBS溶液)对小鼠淋巴细胞标记效果的影响,确定合适的标记条件;输注同品系CFSE标记的小鼠淋巴细胞,于不同时间点检测受鼠主要脏器内CFSE+细胞在淋巴细胞中的比例,并确定供鼠细胞的注射剂量;按照合适的注射剂量分别在注射后不同时间点测定供鼠细胞在受鼠体内的分布,考察本方法的稳定性及阳性信号的持续时间。结果 PBS组CFSE+细胞平均荧光强度分别为596、793、1123、1596、1737,明显高于1640培养基组(P<0.05);1640培养基组CFSE+细胞死亡率分别为8.7%、8.4%、8.6%、9.0%(P>0.05),而PBS组CFSE+细胞死亡率随着CFSE终浓度的上升而增加(P<0.05);按照不同剂量输注同品系淋巴细胞24h后,在受鼠各组织中检测到CFSE+细胞;每只小鼠尾静脉注射5×106个CFSE+淋巴细胞后,到d63仍可在组织中检测到阳性信号细胞。结论以PBS作为孵育液、CFSE终浓度选择10μmol/L对小鼠淋巴细胞标记、注射剂量为细胞5×106个/只,可使CFSE+细胞信号在同系小鼠体内持续2个月。     

PKH26荧光标记大鼠内皮祖细胞在慢性损伤肝内迁移示踪

背景:课题组早期研究发现门静脉回输内皮祖细胞可以改善肝纤维化,但是将其应用于临床尚有很多问题需要解决,如回输路径、细胞的分布情况等.目的:探讨PKH26荧光标记的大鼠内皮祖细胞在慢性肝损伤肝内迁移过程中的示踪.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2008-08/2009-02在北京大学人民医院肝病研究所完成.材料:SPF级健康成年SD大鼠100只,由解放军军事医学科学院动物中心提供.红色荧光染料PKH26为SIGMA公司产品.方法:取16只大鼠,贴壁法分离培养内皮祖细胞,并行PKH26体外标记.实验设立3组:正常对照组4只大鼠,不进行任何干预;二甲基亚硝胺组40只大鼠,通过腹腔注射二甲基亚硝胺10 mg/kg建立肝纤维化模型:四氯化碳组40只大鼠,通过四氯化碳/橄榄油灌胃建立肝纤维化模型.造模后,二甲基亚硝胺组、四氯化碳组大鼠经尾静脉注入1 mL PKH26标记的内皮祖细胞悬液(1×106个细胞).主要观察指标:PKH26标记率和细胞存活率,通过荧光共聚焦显微镜观察大鼠损伤肝内内皮祖细胞的迁移及CD31的表达.结果:流式细胞仪检测结果显示PKH26标记的内皮祖细胞阳性率为99%,荧光显微观察发现锥虫蓝染色后PKH26标记细胞存活率均>90%.输注1 d后,两种慢性肝损伤模型中的肝内均可见PKH26标记阳性的细胞出现在肝小叶内,并且随时间延长阳性细胞数增加.PKH26标记阳性的细胞主要存在于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的窦内皮,且血管内皮可见CD31/PK26双阳性细胞.结论:PKH26可以在体外成功标记大鼠内皮祖细胞,并在损伤肝内示踪.     

SPIO标记干细胞移植MRI示踪研究进展

干细胞(Stem cell,SC)是一类具有自我更新及多潜能分化能力的细胞,利用这种特性在适宜的条件下可将其诱导分化为心肌、软骨、肌腱、肌肉、神经元和肝细胞等,这在疾病治疗和再生医学方面都具有重要的研究和应用价值。与此同时,干细胞移植技术的快速发展,使科学家开始关注干细胞进入体内后的     

Instruction for cytokine expression in T helper lymphocytes in relation to proliferation and cell cycle progression

T helper (Th) lymphocytes, when reactivated, recall expression of those cytokines they had been instructed to express in earlier activations, even in the absence of specific cytokine-inducing factors. In cells that memorize their expression, the cytokine genes are modified by chromatin rearrangement and demethylation, suggesting that they have been somatically imprinted. Here we show, by using inhibitors blocking the cell cycle in various stages, that for the instruction of a Th cell to express interleukin (IL)-4 or IL-10 upon restimulation, entry of the cell into the S phase of the first cell cycle after initial activation is required. Separation of the IL-4 receptor (IL-4R) and T cell antigen receptor (TCR) signals in time, demonstrates that this instruction is dependent on concomitant signaling from both receptors. In Th cells, inhibited to progress into the first S phase after activation, the IL-4R and TCR signals can be memorized for at least 1 d, priming the T cell to become instructed for expression of IL-4 upon restimulation, when entering the S phase after release of the cell cycle block. The requirement of the initial S phase of T cell activation, for instruction of Th cells to express IL-4 or IL-10 upon restimulation points to the decisive role of epigenetic modification of cytokine genes as a molecular correlate of the memory to express particular cytokines.     

A ray tracing method for calculating the speed of sound in a nonparallel layered model using pulse echo ultrasound

A method of calculating the speed of sound in a nonparallel layered model is presented. A focussed ultrasound source and receiver are used to locate the angle and position of an incident pulse and the reflected pulses at the surface of the model. Triangulation is used to calculate the speed of sound in the first layer and points on the first interface for a number of source positions and angles. For subsequent layers, ray tracing is used to eliminate the effect of the overlying layers. A computer simulation in which images of the speed of sound are reconstructed from data generated by ray tracing through two models is presented. Ways in which this method could be implemented are proposed.     

Mechanisms of mouse spleen dendritic cell function in the generation of influenza-specific, cytolytic T lymphocytes.

We have evaluated the capacity of dendritic cells to function as antigen-presenting cells (APCs) for influenza and have examined their mechanism of action. Virus-pulsed dendritic cells were 100 times more efficient than bulk spleen cells in stimulating cytotoxic T lymphocyte (CTL) formation. The induction of CTLs required neither exogenous lymphokines nor APCs in the responding T cell population. Infectious virus entered dendritic cells through intracellular acidic vacuoles and directed the synthesis of several viral proteins. If ultraviolet (UV)-inactivated or bromelain-treated viruses were used, viral protein synthesis could not be detected, and there was poor induction of CTLs. This indicated that dendritic cells were not capable of processing noninfectious virus onto major histocompatibility complex (MHC) class I molecules. However, UV-inactivated and bromelain-treated viruses were presented efficiently to class II-restricted CD4+ T cells. The CD4+ T cells crossreacted with different strains of influenza and markedly amplified CTL formation. Cell lines that lacked MHC class II, and consequently the capacity to stimulate CD4+ T cells, failed to induce CTLs unless helper lymphokines were added. Similarly, dendritic cells pulsed with the MHC class I-restricted nucleoprotein 147-155 peptide were poor stimulators in the absence of exogenous helper factors. We conclude that the function of dendritic cells as APCs for the generation of virus-specific CTLs in vitro depends measurably upon: (a) charging class I molecules with peptides derived from endogenously synthesized viral antigens, and (b) stimulating a strong CD4+ helper T cell response.