癌细胞线粒体DAN CoⅡ及ATPase6基因结构探讨

目的 探讨癌细胞ｍｔＤＮＡ基因编码区的结构特征。 方法 采用ＰＣＲ和ＰＣＲ产物ＨａｅⅢ限制性片段长度多态性分析方法,分析了６株人癌细胞系、８例癌患者及８例正常人白细胞线粒体ＣｏⅡ和ＡＴＰａｓｅ６基因的缺失和限制酶谱变化。 结果 在６个癌细胞系、８例癌患者和８例健康成人白细胞ｍｔＤＮＡ中,两个基因片段均未出现缺失现象;６个癌细胞系及８例癌患者白细胞ｍｔＤＮＡ Ｃｏ Ⅱ和ＡＴＰａｓｅ６基因ＰＣＲ扩增片     

线粒体DNA与人细胞癌变的关系--癌细胞核基因组mtDNA探针FISH分析

目的：探讨ｍｔＤＮＡ与细胞癌变的关系。方法：采用ＰＣＲ方法制备地高辛标记的３条人ｍｔＤＮＡ探针,对６株人癌细胞系和１例原代培养人皮肤成纤维细胞的染色体或间期细胞核进行荧光原位杂交分析。结果：３条ｍｔＤＮＡ探针在６个癌细胞系的部分染色体或间期核中均存在阳性杂交信号,而在成纤维细胞核中未出现阳性杂交信号。结论：表明癌细胞核基因组中存在ｍｔＤＮＡ的同源序列,这些同源片段的出现可能与细胞癌变有关。     

线粒体DNA突变增加前列腺癌的发生

越来越多的证据表明，线粒体基因突变与各种癌症有关，已在结肠癌、前列腺癌和其他实体肿瘤中发现各种线粒体DNA编码区和调控区突变。     

人肺癌组织线粒体ATPase 6基因突变研究

目的：了解人肺癌组织ATPase6基因变异,探讨线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）突变与肿瘤发生的关系。方法：采用酚-氯仿法提取肺癌组织总DNA,用PCR产物直接测序方法,对37例肺癌组织mtDNA ATPase6基因序列进行分析,运用DNAStar软件将所得序列与mtDNA剑桥修订序列进行对照。结果：共发现28个碱基序列变异,没有检测到新的多态性位点,各亚型间在ATPase6基因碱基变异率没有显著性差异。在24例肺癌病例的ATPase6基因中检测到了碱基突变,突变率为64.8%。结论：在肺癌组织中存在ATPase6基因的高频率变异,这种变异可能在肺癌发生、发展中发挥重要作用。对ATPase6基因突变的进一步研究将有助于评价肺癌的DNA损伤和恶性程度,进一步研究这些变异对细胞功能的影响可能有助于阐明线粒体在肿瘤发生中的作用。     

人肺癌组织线粒体ATPase 6基因突变研究

目的:了解人肺癌组织ATPase6基因变异,探讨线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变与肿瘤发生的关系。方法:采用酚-氯仿法提取肺癌组织总DNA,用PCR产物直接测序方法,对37例肺癌组织mtDNA ATPase6基因序列进行分析,运用DNAStar软件将所得序列与mtDNA剑桥修订序列进行对照。结果:共发现28个碱基序列变异,没有检测到新的多态性位点,各亚型间在ATPase6基因碱基变异率没有显著性差异。在24例肺癌病例的ATPase6基因中检测到了碱基突变,突变率为64.8%。结论:在肺癌组织中存在ATPase6基因的高频率变异,这种变异可能在肺癌发生、发展中发挥重要作用。对ATPase6基因突变的进一步研究将有助于评价肺癌的DNA损伤和恶性程度,进一步研究这些变异对细胞功能的影响可能有助于阐明线粒体在肿瘤发生中的作用。     

肺鳞癌患者线粒体DNA编码区序列突变研究

背景与目的 吸烟是肺癌发病的重要因素,但吸烟在肺癌发生发展中的机制目前尚不清楚.本研究旨在分析肺鳞癌患者外周血白细胞、癌旁组织及癌组织线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)编码区序列的突变情况,并探讨其临床意义.方法 应用改良一步法制备15例肺鳞癌患者外周血白细胞、癌旁组织及癌组织mtDNA,PCR产物直接测序,对比分析编码区序列突变情况.结果 15例肺鳞癌患者癌组织mtDNA编码区中,有11例(73.33%)发生突变,共发现18个突变,其中10例患者有长期吸烟病史.结论 肺鳞癌患者mtDNA编码区突变可能与吸烟密切相关.     

鼻咽癌患者组织及血液中线粒体DNA D-loop区突变

目的:检测鼻咽癌患者线粒体DNA复制控制区(mtDNAD-loop)的突变情况。方法:以健康人血标本和鼻咽癌患者癌旁组织作为对照,对20例鼻咽癌组织样本及相应的血液样本的mtDNAD-loop区进行PCR扩增和直接测序分析。结果:在20份鼻咽癌组织样本中共发现312个核苷酸改变,其中293个为已知的多态性改变,4个为新的未记载过的多态性改变;9个肿瘤组织样本和相应的血标本中共发现15个突变;癌旁组织较多多态性变化,未检出突变;鼻咽癌的mtDNAD-loop区突变率为45%(9/20)。结论:血液中mtDNAD-loop的变异可能与鼻咽癌的易感性有一定的联系;本研究为寻找新的肿瘤基因诊断和肿瘤遗传易感性的标志物提供了依据。     

电离辐射诱发的淋巴细胞线粒体DNA多个片段缺失的分析

背景与目的： 探讨电离辐射是否诱发人淋巴细胞永生化细胞系中mtDNA中多个片段的缺失。 材料与方法： 用10 Gy 60Co γ射线照射指数生长期的人淋巴细胞永生化细胞系,照射后24 h、48 h提取纯线粒体DNA,用巢式PCR方法进行线粒体DNA 889 bp、3 895 bp和7 436 bp的缺失分析,并与未照射细胞进行比较;并将纯化的最后一轮PCR产物进行DNA测序和核苷酸同源性分析。 结果： 用于分析线粒体DNA 3 895 bp缺失的并引物对可特异性扩增出线粒体DNA 3 895 bp缺失,该扩增产物经纯化、测序证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的nt 548～4 443之间。用于扩增线粒体DNA 889 bp的引物对可扩增出目的DNA片段,同时也可扩增出未发生缺失的DNA片段,扩增产物经纯化、测序,证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的nt 11 688～12 576之间。所有未照射细胞无线粒体DNA 889 bp和3 895 bp的缺失。而照射前后mtDNA 7 436 bp缺失并未增加。 结论： 电离辐射可诱发淋巴细胞线粒体DNA 889 bp和3 895 bp的缺失,而对7 436 bp缺失影响不大。     

线粒体 DNA 突变在宫颈癌中的研究探讨

线粒体是真核细胞进行氧化磷酸化产生 ATP 的细胞器,它与细胞的能量代谢、细胞凋亡、氧化应激、钙稳态 调控等密切相关。线粒体拥有独立于核基因外的遗传物质 mtDNA,mtDNA 是细胞核外唯一的遗传物质,由于其自身独特 的结构特点和生物学环境,极易发生突变,突变率约为核基因组的 10 倍,大量研究表明,mtDNA 与人类肿瘤的发生、 发展密切相关。宫颈癌是危害人类健康的最常见的妇科恶性肿瘤,在世界女性恶性肿瘤性疾病中发病率仅次于乳腺癌而 位居第二。随着经济社会的发展,人类的疾病谱有了较大的改变。但是宫颈癌的发病率和死亡率一直高居不下。核内基 因组与宫颈癌的相关性研究较多,但在核外基因组研究很少。近年来,mtDNA 与宫颈癌的相关性研究已成为研究热点。 mtDNA 的突变包括碱基替换、插入或缺失等的质的突变及 mtDNA 含量的变化等,前人的诸多研究包含 mtDNA 突变对宫 颈癌各个方面不同程度的影响。本文将从 mtDNA 突变类型及其与宫颈癌的发生、发展、预后等之间关系的研究作一概述。     

线粒体DNA基因组不稳定性在肝细胞癌中的研究进展

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）发病率呈逐年上升趋势,但筛查和诊断方法仍有限。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是真核细胞中重要的遗传物质,其基因组不稳定性（mitochondrial genome instability,mtGI）与癌症发生进展密切相关。mtGI主要包含单碱基替换、片段插入缺失、拷贝数变异等多种mtDNA变异形式。既往研究在HCC患者中发现大量mtDNA变异,因此探索mtDNA变异与HCC的关系有利于进一步阐明HCC发病机制,为HCC临床早期诊断及治疗提供更多可能性。本文将围绕mtDNA变异与HCC研究进展进行综述。     

食管鳞癌组织中线粒体DNA拷贝数量的变化及意义

目的：比较线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝数量在食管鳞癌、癌旁粘膜和正常食管粘膜组织间的差异,探讨mtDNA与食管鳞癌发生、发展的关系。方法：应用荧光定量PCR（real-time PCR）技术,定量检测42例食管鳞癌、癌旁粘膜和正常食管粘膜组织中mtDNA拷贝数;并采用凝胶电泳对mtDNA进行定性检测。结果：食管鳞癌组织中mtDNA检测率为100%（42/42）,平均拷贝数为27.1894×106μgDNA;正常食管粘膜组织mtDNA检测率100%（42/42）,平均拷贝数为5.9347×106μgDNA;癌旁粘膜组织mtDNA检测率100%（42/42）,平均拷贝数为9.4102×106μgDNA,三者之间有显著差异（F=27.83,P〈0.05）。PCR产物经凝胶电泳后,在403bp处显示阳性条带,且食管鳞癌组织所在的泳道较亮,与real-timePCR检测结果一致。结论：mtDNA拷贝数量的增加与食管鳞癌的发生、发展有关。     

线粒体DNA中D-loop区突变在非小细胞肺癌中的意义

目的： 探讨线粒体DNA中D-loop区突变在非小细胞肺癌中的意义及其临床应用的可能性。方法：提取20例非小细胞肺癌患者的癌组织及癌旁组织细胞的线粒体DNA (mtDNA),PCR扩增D-loop区并进行测序,然后以人类基因组中的D-loop区序列为对照,分析基因突变。结果：20例非小细胞肺癌患者的癌组织及癌旁组织mtDNA的D-loop区均发生突变,总突变数265个,其中癌组织特异性突变69个,癌旁组织特异性突变96个,共同突变50个,突变主要集中于D-loop的HVRII区。结论：线粒体DNA中D-loop区的突变主要集中于HVRII区,在非小细胞肺癌的发生发展中可能有重要作用。     

癌细胞mtDNA限制性片段长度多态性分析

目的探讨人癌细胞ｍｔＤＮＡ与正常细胞ｍｔＤＮＡ一级结构的差异。方法采用一步法制备包括肺腺癌ＳＰＣ－Ａ－Ａ、ＰＬＡ－８０１Ｄ、Ａ５４９、Ａ５３１,肝细胞癌ＳＭＭＣ－７７２１,膀胱上皮癌ＥＪ共６个癌细胞系ｍｔＤＮＡ;用ＰｖｕⅡ、ＸｈｏⅠ、ＰｓｔⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＢｓｔＥⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＨｐａⅠ、Ｂｃ１Ⅰ、ＥｃｏＲⅤ、ＳｃａⅠ和ＸｂａⅠ共１１种限制性内切酶对所得ｍｔＤＮＡ进行ＲＦＬＰ分析;并用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法分析了癌细胞ｍｔＤＮＡ非编码区结构变化。结果６个癌细胞系其ｍｔＤＮＡ基因编码区的３２个酶切位点均无变异,而有３个癌细胞系在其ｍｔＤＮＡ非编码区第１６２７６位核苷酸处出现了ＥｃｏＲⅤ新的酶切位点。结论提示癌细胞ｍｔＤＮＡ基因编码区一级结构相当稳定,而主要的核苷酸变异可能位于其ｍｔＤＮＡ非编码区。     

肺癌细胞系线粒体DNA非编码区序列变异研究

背景与目的 线粒体DNA（mtDNA）非编码区在mtDNA转录过程中起重要的调控作用，mtDNA非编码区的突变将直接影响其转录和翻译，从而改变细胞的能量代谢。本研究的目的是分析7种肺癌细胞系mtDNA非编码区序列的变异情况并探讨其意义，为肺癌细胞系mtDNA变异研究提供基础信息。方法 培养7种常用肺癌细胞系，包括人肺腺癌A549、SPC-A-1、Calu-3、LTEP-a-2，人肺扁平上皮癌QG-56，人高转移肺癌95-D以及人小细胞肺癌NCI-H446，应用改良一步法提取7种肺癌细胞系mtDNA，以剑桥mtDNA序列为标准，分析非编码区序列变异情况。结果 7种肺癌细胞系mtDNA非编码区存在不同程度的碱基变异，其中LTEP-a-2细胞系变异率最高，为1．82％，A549细胞系最低，为0．21％。结论 率先成功完成了7种人肺癌细胞系mtDNA整个非编码区的测序，揭示了这7种肺癌细胞系mtDNA非编码区碱基变异背景，为后续实验研究提供了理论基础和参考依据。     

喉鳞状细胞癌组织中线粒体基因4977bp缺失突变的检测

背景与目的:线粒体DNA4977bp缺失突变是机体衰老的分子生物学标志之一,已证实其存在于多种实体性肿瘤中,该突变与喉鳞状细胞癌之间的关系尚不明确。本文旨在探讨喉鳞状细胞癌组织中线粒体基因4977bp缺失突变的发生情况及其与喉癌组织分化水平之间的关系。方法:取喉癌组织35例,均经病理证实为喉鳞状细胞癌。提取肿瘤组织总DNA,利用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)对线粒体基因4977bp缺失进行检测。PCR产物直接测序。结果:35例标本中有20例(57.14%)检测到线粒体基因4977bp缺失突变,其中7例高分化喉鳞癌中有5例,24例中分化喉鳞癌中有15例,4例低分化喉鳞癌未检测到该缺失突变。经统计学分析,高分化、中分化级别喉鳞癌组织4977bp缺失突变发生率与低分化相比有显著性差异(P<0.05),而高分化和中分化之间无显著性差异(P>0.05)。结论:喉鳞状细胞癌组织中存在线粒体DNA4977bp缺失突变,该突变的发生可能与肿瘤组织分化水平有关。     

重离子辐射引起的线粒体DNA突变定量分析

目的 对重离子辐射引起的线粒体DNA突变进行定量分析。方法 使用X射线和重离子束对 人乳腺癌细胞MCF-7进行辐照,对照后细胞进行克隆存活分析;用real-time PCR定量检测线粒体DNA 4 977缺失,克隆测序法定量检测线粒体D310区突变。结果 克隆存活结果和辐照后D310多态性分布 显示重离子射线对MCF-7细胞的增殖抑制效果比X射线更为明显,引起的D310突变也更多,并且这些 突变体能在辐照后的MCF-7细胞中稳定积累,但重离子辐照引起的线粒体DNA 4 977 bp缺失在细胞中 仅能短暂存在。结论 辐照后的细胞中存在着克隆选择机制,严重影响线粒体的正常功能突变体短暂 存在于辐照后的MCF-7细胞,但很快被清除,如4 977大片段缺失;而D310突变随着细胞遗传,这表 明它在线粒体中没有重要功能。     

人食管鳞癌EC9706细胞线粒体DNA中ND1基因突变的检测及意义

目的通过对人食管鳞癌EC9706细胞线粒体DNA（mtDNA）中ND1基因进行检测,分析其基因突变的意义。方法培养人食管鳞癌EC9706细胞,提取其mtDNA中的ND1基因,并测序。结果测序发现,人食管鳞癌EC9706细胞mtDNA中ND1基因的3971处出现点突变,由C突变为T。结论人食管鳞癌EC9706细胞中mtDNA的ND1基因的突变与食管癌发生、发展关系密切。     

122例宫颈癌患者线粒体DNA含量及10398位点突变情况分析

目的:探讨122例中国汉族女性宫颈癌患者的线粒体DNA(mtDNA)含量及10398位点的突变情况。方法:收集2002年至2012年间在武汉大学中南医院及宜昌市第二人民医院经病理确诊的中国汉族女性宫颈癌住院患者的蜡块组织,提取其mtDNA,并收集病例的临床病理资料。采用实时定量PCR方法（Real-time PCR）检测其mtDNA含量,采用聚合酶链式反应-限制性片段多态性方法(PCR-RFLP)检测mtDNA 10398位点基因型。用t检验、方差分析、卡方检验等进行统计分析。结果:本研究中共纳入122例患者。年龄从22岁至77岁,中位年龄为45岁,mtDNA含量的差异大,含量最低为14.27,最高为21 769.19,中位值为1 758.18±3 335.72。mtDNA含量与病理类型、分期等均无关（P值分别0.068、0.213）,而与年龄有关,年龄大者,mtDNA含量高(P=0.019);10398位点突变则与年龄、病理类型、分期等均无关（P值分别为0.271、0.300、0.244）。结论:mtDNA含量变化及mtDNA 10398位点突变与宫颈癌的病理、分期等无关,mtDNA含量与年龄相关。     

嗜酸细胞瘤线粒体DNA非编码控制区基因突变及其意义的初步探讨

目的 分析嗜酸细胞瘤中线粒体DNA(mtDNA)非编码控制区(D-loop区)的碱基突变情况及其意义.方法 收集20例甲状腺和肾嗜酸细胞瘤及瘤旁的正常组织石蜡包埋标本,分别提取瘤组织和正常组织的总DNA,对mtDNA D-loop区(1122 bp)进行PCR扩增,以直接测序法检测PCR产物的基因序列.另收集5例人胚胎肾组织作为正常对照.结果 20例甲状腺和肾嗜酸细胞瘤标本中,7例(35.0%)肿瘤组织和1例(5.0%)正常组织共检测出突变位点21个,主要集中在高变区Ⅰ(HVⅠ).20例(100%)肿瘤标本中均检测出多态性位点,共191个.结论 D-loop区尤其是HV Ⅰ是嗜酸细胞瘤的突变热点,其突变可能引起mtDNA复制速率的变化,并与线粒体功能异常密切相关.     

食管癌细胞Eca9706 DNA聚合酶β基因敲除载体的构建

目的构建食管癌细胞Eca9706 DNA聚合酶β（DNA polβ）基因敲除载体,为DNA polβ基因敲除奠定基础。方法应用体细胞基因敲除技术的方法和原理,根据DNA polβ基因序列,设计并合成2对特异性引物（UP1/UP2和DOWN1/DOWN2）,通过PCR扩增获得上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN）,其中上游同源序列长1 268 bp,下游同源序列长2 150 bp,将其插入骨架载体pcDNA3.1,从而构建了DNA polβ基因敲除载体pOUT-polβ,最后用PCR、酶切和测序进行鉴定。结果经过PCR筛选,限制性酶切及DNA测序鉴定,证实上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN）2个片段插入正确。结论通过本研究所述方法,成功构建了用于食管癌细胞Eca9706 DNA polβ基因敲除载体pOUT-polβ。