人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P < 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

重组合异种骨复合血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对非创伤性股骨头坏死的修复*

目的：将复合有血管内皮生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞的重组合异种骨植入病灶清除区,观察其修复股骨头坏死的效果。 方法：体外分离、培养、鉴定骨髓间充质干细胞,PcDNA3/VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞,与重组合异种骨复合培养。应用局部液氮冷冻法造成的24只兔非创伤性股骨头坏死模型,左侧骨缺损处植入复合血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞的重组合异种骨为治疗组,右侧仅植入单纯重组异种骨为对照组。行X射线,组织病理及股骨骨密度和矿物质含量检查。 结果：①X射线片观察第6周时治疗组坏死区出现骨小梁结构,新骨形成增加,对照组仍呈现坏死区中心低密度,边缘高密度;第12周时治疗组股骨头形态规则,密度均匀,对照组股骨头坏死区有囊状低密度区。②第6周和12周时两组骨密度和矿物质含量差异有显著性意义(P < 0.01)。③在组织学上,6周时治疗组骨细胞及微毛细血管明显多于对照组;12周治疗组新生骨组织修复达软骨下,对照组植入骨块仍有少量未吸收。 结论：重组合异种骨复合血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞具有明显的成骨诱导作用,能有效促进非创伤性股骨头坏死的早期修复。 关键词：股骨头坏死;骨髓间充质干细胞;血管内皮生长因子;重组合异种骨     

人骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷

背景：目前已有将体外培养的骨髓基质细胞与支架复合修复骨缺损的临床报道。但是由于该类复合材料中缺乏骨生长因子作用，在原位的成骨作用并不十分理想。 目的：探讨携带人骨形态发生蛋白2基因的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷材料在修复兔颅骨缺损中的原位成骨作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-02/2008-11在辽宁医学院解剖学实验室完成。 材料：生物活性玻璃陶瓷由中国科学院四川成都光电研究所提供，转人骨形态发生蛋白2和转pcDNA3载体的骨髓间充质干细胞由辽宁医学院解剖学教研室骨组织工程研究所保存。 方法：制备兔双侧颅骨骨缺损模型，将基因转染的骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷复合培养物植入骨缺损区，术后第4,8,12周对植骨区进行大体观察、X射线摄片、组织切片、组织化学检测。 主要观察指标：①复苏后的转染人骨形态发生蛋白2的骨髓基质细胞的生长特性。②从大体、X射线结果和组织学等方面观察复合材料在原位修复骨缺损的作用。 结果：转染的骨髓基质细胞在细胞形态及增殖特性方面与未转染的细胞无明显差异。扫描电镜显示基因转染的骨髓基质细胞在生物活性玻璃陶瓷表面呈星形紧密排列，长入生物活性玻璃陶瓷孔隙中。复合材料植入免颅骨缺损后，X射线观察术后第4周骨缺损外周骨质与复合材料之间大部分被高密度阴影充填，术后第12周骨缺损外周骨质与复合材料之间完全被高密度阴影充填；光镜观察术后第8周骨小梁大部分相连成片，术后第12周骨小梁粗大，骨髓再生。 结论：基因转染的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷材料基本符合骨组织工程学的要求，在骨缺损区原位具有良好的成骨作用。 关键词：骨髓基质细胞；基因转染；生物活性玻璃陶瓷；骨缺损     

脂质体介导pcDNA3/hVEGF165转染骨髓基质干细胞复合冻干骨的体内成骨和血管化☆

背景：以往的研究表明血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子可以促进移植物的存活和体内生长。 目的：观察脂质体介导的pcDNA3/hVEGF165转染骨髓基质干细胞后复合冻干松质骨在体内的成骨和血管化效果。 方法：取同种异体新西兰大白兔的耾骨和股骨制备冻干骨,用脂质体将血管内皮生长因子转染入体外培养扩增新西兰大白兔骨髓基质干细胞中,使其附着于同种异体冻干松质骨。将新西兰大白兔分为3组,于兔竖脊肌分别植入单纯冻干骨、单纯骨髓间充质干细胞复合冻干骨组、转染有血管内皮生长因子的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨。 结果与结论：植入后8周时可见到转染血管内皮细胞生长因子的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨标本的表面有软骨和骨质形成,有成骨和破骨细胞出现,并形成类骨质,在移植骨周围组织中有大量血管形成,其他两组仅有大量纤维包裹。说明,脂质体介导的pcDNA3/hVEGF165转染后骨髓基质干细胞复合冻干骨具有较好成骨活性,优于单纯骨髓基质干细胞复合冻干松质骨和单纯冻干骨。     

血管内皮生长因子165基因修饰人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤

背景：利用组织工程原理构建的人工皮肤替代物用于皮肤移植可有效解决供皮不足这一难题，但组织工程皮肤很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。 目的：以血管内皮生长因子165基因修饰的人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质，拟构建活性组织工程皮肤。 设计、时间和地点：以基因工程为基础的组织构建实验，于2008-03/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：普通级新西兰大白兔5只用于提取脱细胞真皮基质原料，由南昌大学医学院动物科学部提供，人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的患者，pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。 方法：无菌条件下切取兔耳全层皮肤，将2 cm×2 cm皮片置于0.25%胰酶-EDTA消化液中去掉表皮，再置入曲拉通X-100溶液使真皮细胞完全脱净，磷酸盐缓冲液反复清洗，即为脱细胞真皮基质，4 ℃保存备用。采用密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，取传至第3代细胞，按5×105/孔密度接种，待细胞达80%融合时进行脂质体介导的pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染，接种于制备好的脱细胞真皮基质上体外联合培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质的形态观察，组织工程皮肤结构观察。 结果：体外培养的骨髓间充质干细胞大部分呈梭形，基因转染后细胞形态及活性无明显影响；脱细胞真皮基质呈瓷白色，柔韧有弹性。血管内皮生长因子165基因修饰的骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质共培养2 d后，所构建的组织工程皮肤呈淡红色，质软，接种细胞生长状态正常，苏木精-伊红染色及扫描电镜观察可见在脱细胞真皮基质的间隙中有大量长梭形细胞附着生长。 结论：血管内皮生长因子165基因转染的人骨髓间充质干细胞在兔脱细胞真皮基质中生长良好，可在体外联合构建活性组织工程皮肤。     

4001/转染bFGF基因骨髓间充质干细胞在珊瑚骨表面生长状况

目的：将转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞与珊瑚骨的复合培养,观察转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚支架材料上生长状况。材料和方法：穿刺抽取新西兰大白兔胫骨骨髓,采用密度梯度离心法分离BMSCs,采用贴壁筛选法对分离出的BMSCs进行纯化,利用脂质体转染bFGF-pcDNA3到BMSCs。取生长良好的转染bFGF基因BMSCs和未转染的BMSCs,分别接种于不同珊瑚表面,采用MTT法观察细胞－支架联合培养BMSCs的增殖情况和利用扫描电镜观察珊瑚支架上细胞的生长状况。结果：MTT法检测显示细胞－支架联合培养转染组细胞与联合培养未转染组细胞增殖相比有统计学差异（P﹤0.05）,联合培养转染组细胞生长增殖强于未转染组细胞。而联合培养的转染组细胞同单纯培养转染组细胞增殖相比无统计学差异（P>0.05）。扫描电镜观察显示复合BMSCs细胞贴附在珊瑚上,并在材料上完全铺展,形态多样,细胞向孔内长入或跨越微孔表面,部分区域有细胞外基质形成。 结论：转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况较未转染组好,珊瑚人工骨不影响BMSCs的增殖,可以作为BMSCs支架材料构建组织工程骨。     

基因修饰骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架材料修复骨质疏松性下颌骨缺损**☆

背景：近年来基因修饰干细胞与支架材料复合形成组织工程化骨为修复骨缺损提供了骨组织重建的全新思路。 目的：实验拟观察转染人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架材料修复骨质疏松症下颌骨缺损的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-06/2006-10在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成。 材料：6月龄未孕雌性SD大鼠24只，SPF级，体质量250~300 g，构建绝经后骨质疏松症动物模型。含人骨形态发生蛋白2基因的pcDNA3.1-hBMP-2重组质粒由解放军第三军医大学提供；支架材料珊瑚羟基磷灰石由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供。 方法：24只SD模型大鼠随机数字表法分为实验组和对照组，每组12只。3个月后分别取其骨髓间充质干细胞培养。实验组骨髓间充质干细胞通过脂质体Lipogen介导转染pcDNA3.1-hBMP-2质粒，对照组细胞未作处理。3 d 后将每只大鼠骨髓间充质干细胞与珊瑚羟基磷灰石支架材料复合，再分别对应地植入取材动物的自体下颌骨极限性骨缺损区。 主要观察指标：术后第4，8周组织切片行免疫组织化学染色，观察新骨形成情况。术后8周进行成骨量的半定量检测。 结果：24只SD模型大鼠均进入结果分析。①术后4周实验组在珊瑚羟基磷灰石材料边缘有新生骨质形成，8周时见相互连接的层板状成熟骨基质形成，对照组4周时只在材料边缘有少量骨基质形成，8周时新生骨质数量上明显少于实验组，且材料边缘及中央处有脂肪样结构形成。②对照组术后8周新生骨所占面积百分比为（0.046±0.004）%，实验组为（0.233± 0.015）%，各组成骨量差异具有显著性意义（P < 0.01）。 结论：人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架形成的组织工程化骨修复骨质疏松症下颌骨的成骨量较无基因修饰明显增加。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2) 是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。 目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。 设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。 材料：pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。 方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T- hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T- hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达。 主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA 反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM-T-hBMP-2 和pcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。 结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1.2 kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3.1- hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达**

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

脂质体介导骨保护素基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达*

背景：基因修饰骨组织工程种子细胞,可提高对骨缺损的修复能力。 目的：构建含有骨保护素的真核表达载体并检测转染骨髓基质干细胞后的表达。 方法：取4周龄SD大鼠胫骨和股骨行骨髓基质干细胞的分离和培养,分为载体组、空载体组、对照组。空载体组转染plRES2-EGFP载体,载体组转染plRES2-EGFP-OPG。 结果与结论：转染后激光扫描共聚焦显微镜观察可见骨髓基质干细胞内绿色荧光蛋白表达;RT-PCR检测结果可见质粒载体组在1 200 bp有明显条带,空载体组及对照组未见表达;免疫细胞化学检测骨髓基质干细胞内骨保护素蛋白呈阳性;MTT法检测各组细胞增殖活力无明显改变(P > 0.05)。证实应用plRES2-EGFP-骨保护素质粒转染大鼠骨髓基质干细胞,可获得外源性骨保护素的基因及蛋白表达。     

转基因骨髓间充质干细胞移植与组织工程皮肤的血管化

背景：组织工程化皮肤移植后常因缺乏足够的血管化而导致低灌注和缺血损伤。利用转基因技术,可将血管生成调控因子基因导入目的细胞,使其表达某些调控因子,进而利于血管生成。 目的：观察转基因骨髓间充质干细胞移植促进组织工程皮肤血管化基因治疗的可行性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-03/11在江西省南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：人骨髓间充质干细胞由试验者取自临床骨髓穿刺检查骨髓正常的患者。pShuttle-CMV/VEGF165 质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。16只新西兰大白兔用于皮肤缺损模型的制作,分为基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组进行移植。 方法: 采用密度梯度离心结合贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞,以pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞。于兔背部两侧制备2 cm×2 cm 的正方形全层皮肤缺损3个,并分别以人血管内皮细胞生长因子165转染骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、不含细胞的真皮支架材料植入全层皮肤缺损创面。 主要观察指标：观察局部组织微血管密度变化及移植物成活率。 结果：术后7 d,3组创口周围皮肤均无明显红肿及炎症反应,移植物与创面接触紧密,基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组可见部分真皮泛红, 真皮支架材料组不明显,术后3周创面基本愈合,基因转染骨髓间充质干细胞组创面的毛细血管密度较骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组明显增高(P < 0.01),14 d时3组中基因转染骨髓间充质干细胞组血管密度仍最高,但3组数据无统计学差异。术后二三周基因转染骨髓间充质干细胞组移植物成活率最高(P < 0.01)。 结论：血管内皮细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植可改善和促进局部血管再生,促使新的毛细血管从创面长入移植的组织工程皮肤,从而促进组织工程皮肤的早期血管化及创面愈合。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长、定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点。 目的：探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。 方法：将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序。利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期。 结果与结论：脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位主要位于胞浆。转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P < 0.05)。提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖。     

构建稳定表达血管内皮细胞生长因子 的人间充质干细胞

背景：血管内皮细胞生长因子可有效治疗缺血性心脏病,但其在体内难以保持持续的有效浓度。 目的：构建稳定表达血管内皮细胞生长因子的人骨髓间充质干细胞株,检测经基因转染后外源基因的表达。 设计、时间及地点：观察实验,于2006-03/2007-04在上海胸科医院完成。 材料：人骨髓间充质干细胞株、血管内皮细胞生长因子由上海市胸科医院胸部肿瘤研究所基础实验室提供。 方法：扩增血管内皮细胞生长因子片断,构建pcPGK- hVEGF 165真核表达质粒,利用脂质体介导转染人骨髓间充质干细胞,然后进行阳性细胞克隆筛选。 主要观察指标：以RT-PCR、PCR、Western Blot、 ELISA 方法检测在稳定转染了pcPGK-VEGF165-IRES-GFP的3株细胞和稳定转染pcPGK- IRES-GFP的3株细胞中,人血管内皮细胞生长因子165在人骨髓间充质干细胞中的表达情况。 结果：扩增血管内皮细胞生长因子后,成功了构建质粒 pcPGK-hVEGF165,并利用脂质体顺利转染了人骨髓间充质干细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。RT-PCR、PCR检测结果显示,在稳定转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞中表达的血管内皮细胞生长因子165信使RNA明显高于对照及未转染的人骨髓间充质干细胞,Western Blot、ELISA检测结果显示,稳定转染血管内皮细胞生长因子人骨髓间充质干细胞及培养上清中的血管内皮细胞生长因子蛋白明显高于对照及未转染的人骨髓间充质干细胞。 结论：采用脂质体介导基因转移技术可将人血管内皮细胞生长因子165顺利转染人骨髓间充质干细胞中,并获得稳定表达血管内皮细胞生长因子165的细胞株。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景：在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路。 目的：观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。 方法：使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。 结果与结论：流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

转染碱性成纤维细胞生长因子骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建的组织工程皮肤

背景：研究证实,小肠黏膜下层不存在免疫原性,不会引起异种移植中常见的排斥反应,是一种比较理想的人工真皮替代物。 目的：通过基因转染的方法将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至骨髓间充质干细胞,并复合猪小肠黏膜下层构建组织工程皮肤。 方法：日本大耳兔骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,通过pCDNA3.1质粒将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至生长状态良好的骨髓间充质干细胞,并将转染后的细胞接种于制备好的猪小肠黏膜下层上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表型,WesternBlot检测pCDNA-bFGF真核表达载体转染兔骨髓间充质干细胞的结果,并观察组织工程皮肤的结构。 结果与结论：传代后骨髓间充质干细胞生长迅速,呈长梭形,形态良好。细胞的表面抗原CD90、CD44有阳性表达,而CD45为阴性。碱性成纤维细胞生长因子基因转染入兔骨髓基质干细胞并能稳定表达,转染后的骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层中生长良好,可体外构建组织工程皮肤。     

软骨源形态发生蛋白基因转染自体骨髓间充质细胞修复关节软骨缺损

背景：以支架或干细胞在一定程度上能够修复软骨缺损,但是研究中发现较大块的缺损修复效果还达不到令人满意的程度。基因转染后的干细胞能够不断的释放生长因子有可能够为软骨缺损研究带来突破。 目的：进一步验证软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞是否会促进体内兔软骨修复。 方法：从兔骨髓内分离获得骨髓间充质干细胞,脂质体感染的方法将软骨源形态发生蛋白基因转染到骨髓间充质干细胞中。实验组移植转染后的细胞;单纯骨髓间充质干细胞组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白对照组缺损区不移植细胞。术后行组织学检测及组织学评分分析修复情况。 结果与结论：体内修复过程中,软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞促进了软骨再生。透明软骨填充了软骨缺损区,并且深部区域显示了软骨下成骨。透明软骨的重建区域优于单纯骨髓间充质干细胞移植组。组织学评分实验组高于骨髓间充质干细胞对照组和空白组。提示转染软骨源形态发生蛋白基因的骨髓间充质干细胞能够促进和提高关节软骨的改建和修复。     

构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因腺病毒表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少。 目的：构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达。 方法：以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES- hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建。重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度。 结果与结论：经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功, 荧光显微镜下观察表明, 感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达。可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达, 有可能用于缺血性疾患的基因治疗。