从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1529bp cDNA的核苷酸序列分析

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－Ｋ５的大片段经直接自身环化，小片段与质粒载体ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ重组，构建测序用的亚克隆。用双链双脱氧末端终止法测各亚克隆的核苷酸序列，再拚接出全长为１５２９ｂｐ的３Ｄ５－５ｃＤＮＡ全长序列。与国际基因库资料比较，未见有相同的序列。此ｃＤＮＡ中有一个长４６５ｂｐ（从５４０ｂｐ－１００４ｂｐ）的ＯＲＦ，编码１５４个氨基酸的蛋白质。此蛋白质中有二个疏水区（第１～３４位氨基酸及第７９～１０９位氨基酸），提示它可能属Ⅰ类穿膜蛋白。     

单抗5C5-G1识别的分化抗原表达于活化B细胞胞膜

目的鉴于５Ｃ５ｃＤＮＡ（６１３ｂｐ）的２～４５０ｂｐ与ＨＳＭＲＰ１７ｍＲＮＡ（１００８ｂｐ）的５６０～１００８ｂｐ的同源性高达９５％，且后者编码的蛋白质（ＭＲＰＬ１２）也在细胞活化后表达，本研究旨在探究两者是否属同一物。方法多个人Ｂ细胞株用单抗５Ｃ５－Ｇ１作间接免疫荧光染色，激光扫描共聚焦显微镜观察。结果５Ｃ５－Ｇ１单抗识别分子表达于膜下近膜胞浆处、也可能在膜表面，但非单纯在膜上，而ＭＥＰＬ１２只表达于线粒体。另外，前Ｂ细胞Ｎａｌｍ－６与单抗５Ｃ５－Ｇ１反应阴性，活化前期Ｂ细胞Ｄａｕｄｉ和３Ｄ５的反应强阳性，分化晚期Ｂ细胞ＳＫＷ６为弱阳性。结论５Ｃ５ｃＤＮＡ与ＨＳＭＲＰ１７ｍＲＮＡ不属同一基因；单抗５Ｃ５－Ｇ１识别的分化抗原的表达在Ｂ细胞分化过程中有变化     

一个新的人B细胞活化抗原—5C5

用活化人B细胞株3D5细胞免疫小鼠和作为筛选的靶细胞,我们建立了产生单克隆抗体5C5的杂交瘤细胞株。此单抗识别的抗原5C5在25μg/ml anti-μ刺激的B细胞,于第10小时开始表达,亦即于G_1期开始表达。5C5细胞百分率随培养时间而增多。在PWM诱导下.外周血单一核细胞中5C5~ 细胞随培养时间而增加,至第3～4天达最高峰,然后减少,至第7天降至本底水平。5C5~ 细胞在不能为BCDF诱导分化至免疫球蛋白分泌细胞(ISC)的B细胞株3D5,Raji和Daudi阳性,但在能为BCDF诱导分化至ISC的CESS和SKW6细胞却不表达。这均表明5C5抗原表达于B细胞活化的早期和中期,但在B细胞终末分化阶段消失。在休止期B细胞、休止期T细胞、PHA激活的T细胞、单核细胞和中性粒细胞,以及在所检测的T细胞株和髓细胞株,5C5抗原均为阴性。~(125)I标记后用单抗5C5免疫沉淀提取的抗原,在还原与非还原条件下电泳,均只有分子量为52000的一条带,表明5C5是一个单链细胞表面蛋白。鉴于5C5抗原的分子量与文献中已报道的B细胞活化抗原分子量不同,以及5C5在细胞株表达的特点,它可能是一个新的人B细胞活化抗原。     

B细胞活化基因的研究：I.人活化B细胞cDNA文库的构建

本文报导以人活化Ｂ淋巴细胞的３Ｄ５细胞的ｍＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ的第一链；按常规的自身引物法，以合成的第一链为模板合成ｃＤＮＡ第、二链；以λｇｔ１１ Ｓｆｉ－Ｎｏｔ噬菌体为载体，定向插入构建了人活化Ｂ细胞ｃＤＮＡ表达文库。该文库的大小为２．５×１０＾６ｐｆｕ，插入片段长度大于１ｋｂ；用抗ＣＤ７１及ＣＤ９８单克隆抗体为探针，对所构建的文库进行筛选，均获得了阳性克隆。ＣＤ７１及ＣＤ９８均为人     

编码人分化抗原5C5全长cDNA的克隆及功能初探

目的 编码５Ｃ５分化抗原全长ｃＤＮＡ的克隆及功能探索。方法 构建人活化Ｂ细胞株３Ｄ５细胞的λｇｔ１１ ｃＤＮＡ文库，以核苷酸杂交法从ｃＤＮＡ文库中筛选阳性克隆、作核苷酸序列分析，编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ测５Ｃ５ ｍＲＮＡ转录本长度，用ＲＴ－ＰＣＲ检测５Ｃ５ ｍＲＮＡ在不同细胞株的表达，观察单抗５Ｃ５－Ｇ１对３Ｄ５细胞增殖的影响。结果 从人活化Ｂ细胞株３Ｄ５的λｇ     

B细胞活化基因的研究Ⅰ．人活化B细胞cDNA文库的构建

本文报导以人活化Ｂ淋巴细胞的３Ｄ５细胞的ｍＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ的第一链：按常规的自身引物法，以合成的第一链为模板合成ｃＤＮＡ第、二链；以及λｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ噬菌体为载体，定向插入构建了人活化Ｂ细胞。ＤＮＡ表达文库。该文库的大小为２．５×１０６ｐｆｕ，插入片段长度大于１ｋｂ；用抗ＣＤ７１及ＣＤ９８单克隆抗体为探针，对所构建的文库进行筛选，均获得了阳性克隆，ＣＤ７１及ＣＤ９８均为人Ｂ细胞活化时才得以表达的分化抗原，从而证明，新构建的ｃＤＮＡ文库是人活化Ｂ细胞的ｃＤＮＡ表达文库。     

人B细胞激活抗原B7（hB7）基因cDNA的克隆

我们采用Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ的方法，成功地从Ｒａｊｉ细胞中扩增出Ｂ７ ｃＤＮＡ，通过单个碱基改变，在两端分别引入单酶切位点（５＇端为ＨｉｎｄⅢ，３＇端为ＥｃｏＲⅠ），经酶切后连入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ克隆载体，测序证明所得序列与Ｆｒｅｅｍａｎ等报告的完全一致。我们所选用的两个酶切位点ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏｒＩ恰好位于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ多克隆位点的中央，克隆入Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ后，两端有多个单酶切     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的 …

目的：建立人树突状细胞的ｃＤＮＡ文库。通过大规模随机测序克隆免疫新分子,方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽提纯化ｍＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２．０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行随机测序,将得到的ＥＳＴ在Ｓｕｎ－Ｅ４５０服务器中与ＥＭＢＬ及Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ数据库进行同源性比较,筛     

从人T细胞淋巴瘤cDNA文库中筛选含PH结构域编码序列的新基因

目的 从T细胞中获得更多含PH结构域编码序列的新基因。方法 采用低严谨核酸杂交技术，根据T细胞中已知的PH结构域的分子设计探针，对人T细胞淋巴瘤cDNA文库进行筛选。结果 在筛选过程中得到了4个新基因，各cDNA长度依次为：1733bp,2308bp,2130bp和1647bp，分别编码含229，376，211和143个氨基酸残基的多肽。经生物信息学分析，在基因数据库中未发现与此4种cDNA序列类似的基因。该4个基因均已被GenBank收录，登录号分别为：AF334588，AF334589，AF334590和AF334792。结论 这些新基因的获得及进一步研究，可能会为深入探讨T细胞激活机制提供新的线索。     

用细胞酶联免疫吸附法筛选分泌抗人B细胞分化抗原单抗的杂交瘤

用活化的人Ｂ细胞株３Ｄ５细胞免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取小鼠脾脏细胞与ＳＰ２／０细胞融合，融合后细胞置甲基纤维素半固体培养基生长。以０．５％甲醛处理的３Ｄ５细胞和ＣＥＭ细胞包被酶细胞反应阳性而与ＣＥＭ细胞反应阴性的克隆。再经间接免疫荧光染色后，用流式细胞仪复测以上所得３３个阳性克隆，结果３Ｄ５阳性ＣＥＭ阴性者２７例，占８１．８２％，表明ＣＥＬＩＳＡ法是一个粗筛抗人Ｂ细胞分化抗原的简便有效方法。     

人B细胞活化相关基因BC-1514全长cDNA的克隆与原核表达

目的 克隆与B细胞活化相关的新基因及其原核表达。方法 采用差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行入活化B细胞cDNA文库的筛选,将所获得的阳性克隆的编码区经PCR扩增后克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,重组质粒经酶切,测序鉴定后转化大肠杆菌BL-21,以IPTG诱导表达融合蛋白。结果 以在活化B细胞高表达的EST32为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库获得一个新的全长为1514bp的cDNA克隆（命名为BC-1514）,重组的BC-1514蛋白可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,其表达量约占细菌总蛋白量的14.3%左右,BC-1514cDNA的GenBank的登录号为AF304442。结论 获得了1条新的与B细胞活化相关的cDNA克隆并在E.coliBL-21中得到了有效表达。     

人谷胱甘肽S－转移酶基因π（cDNA）的筛选和鉴定

采用免疫筛选法和寡核苷酸探针筛选法从人肺ｃＤＮＡ文库中筛选得到人ＧＳＴ一ｐｉ（ＧＳＴ－ｘ）ｃＤＮＡ，对其序列进行了测定和分析。     

新的识别人活化B细胞分化抗原5C5单克隆抗体（5C5－G＿1）的制备和鉴定

新制备的抗人活化Ｂ细胞分化抗原５Ｃ５单克隆抗体５Ｃ５－Ｇ＿１经Ｗｅｓｔｅｒ印迹分析表明，该分化抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（还原条件下）显示五条带，分子量分别为９２ｋＤ、５２ｋＤ±（两条）、４０ｋＤ和２０ｋＤ。用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ＿１的混合物，从３Ｄ５细胞的λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库中筛选到７个阳性ｃＤＮＡ克隆。     

DCS细胞中SRS19—6白血病病毒3‘—cDNA序列的克隆

利用本室建立的树突状细胞肉瘤（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓａｒｃｏｍａ,ＤＣＳ）细胞系免疫Ｌｏｕ／ｃ大鼠,制备了细胞膜蛋白单克隆抗体９８３Ｄ４,该抗体具有小鼠肿瘤细胞的特异性,能抑制体外细胞生长速度,降低克隆形成能力＾〔１〕。为了得到其ｃＤＮＡ序列,本工作构建了ＤＣＳ细胞ｃＤＮＡ表达文库并用９８３Ｄ４单抗进行了免疫学筛选。     

基于细胞3D打印技术的肿瘤药物筛选细胞芯片研究

现有的药物筛选评价技术中,动物筛选模型存在种属差异和周期长等缺点,高通量筛选和细胞筛选模型则与体内环境差异大,药物筛选准确率低。细胞3D打印技术为在体外构建仿真的组织器官模型提供了可能,当其与细胞芯片技术结合则为体外构建高效准确的药物筛选模型提供了新的技术空间。本研究构建了含有多个叉指电极（IDEs）阵列的细胞芯片,用细胞3D打印技术在芯片上组装了卵巢癌细胞HO-8910和人肝间充质干细胞HMSC-H组织模型,并通过对组织模型内细胞阻抗变化的检测,反映细胞生长、贴附、增殖、凋亡的过程及药物对细胞活性的影响等,最终基于该模型检测了抗癌药物顺铂和环磷酰胺对肿瘤细胞的杀伤和肝毒性。结果显示：支架微丝直径和孔径约为200～300 μm,肿瘤细胞和肝细胞在三维结构里生长良好;DMEM作为电解液,芯片在10.4 Hz可准确检测到三维结构中细胞增殖引起的阻抗变化,20 h后阻抗升高69.6%;基于该筛选模型,能同步检测到药物的抗肿瘤作用和肝毒性,并筛选出需要肝的二次代谢产物才能产生抗肿瘤性的药物环磷酰胺。     

用单抗5C5和5C5—G1筛选的613bp cDNA的核苷酸序列分析

用识别人活化Ｂ细胞分化抗原５Ｃ５的单克隆抗体５Ｃ５和５Ｃ５－Ｇ１的混合物从人扁桃体细胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡ文库筛选到３个阳性克隆。其ｃＤＮＡ插入到质粒ｐＵＣ１８，经双链双脱氧测序法作核苷酸序列分析，知其中一个ｃＤＮＡ长６１３ｂｐ，另二个长４６７ｂｐ，后者与前者的前４６７ｂｐ完全重叠。６１３ｂｐ ｃＤＮＡ中有一个开放阅读框架，从１０３ｂｐ到４２９ｂｐ，共３２７ｂｐ。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示，此６     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立

目的：建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭＣＳＦ和ＩＬ４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽提纯化ｍＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行随机测序,将得到的ＥＳＴ在ＳｕｎＥ４５０服务器中与ＥＭＢＬ及Ｓｗｉｓｐｒｏｔ数据库进行同源性比较,筛选出代表未知基因ＥＳＴ,然后在ＧＣＧ软件中进行分析,对重要的未知ＥＳＴ克隆其全长ｃＤＮＡ。结果：所扩增的ＤＣ经流式细胞仪分析高表达ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ、Ｂ７、ＣＤｌａ和ＣＤ８３等表面标志,能强烈刺激同种异体Ｔ淋巴细胞的体外增殖反应;建立的ＤＣｃＤＮＡ文库９２％以上克隆有平均１６ｋｂ大小的插入片段;从所测的１２０００余条ＥＳＴ中筛选出代表未知基因的３０００余条,克隆到１０９条全长新基因,包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子,部分全长基因已在Ｇｅｎｅｂａｎｋ中登录。结论：成功建立了人ＤＣ的ｃＤＮＡ基因文库及其大规模随机测序体系,并克隆到免疫分子。     

WNT5B过表达对人乳腺癌MCF-7细胞活力及凋亡的影响

目的:检测WNT5B在人正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞株中的表达,及过表达WNT5B后对人乳腺癌MCF-7细胞活力及凋亡的影响,探讨WNT5B在乳腺癌发生发展中的作用。方法:采用RT-PCR法检测正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中WNT5B的mRNA表达水平,将WNT5B的表达载体pc DNA3.1/WNT5B和空白对照载体pc DNA3.1分别瞬时转染人乳腺癌MCF-7细胞,通过real-time PCR和Western blotting法分别在mRNA和蛋白水平验证WNT5B的表达效率;并通过CCK-8的方法检测WNT5B过表达对人乳腺癌MCF-7细胞活力的影响,通过流式细胞术分别检测过表达WNT5B对MCF-7细胞周期分布及凋亡比例的影响。结果:与正常乳腺上皮细胞相比,WNT5B在乳腺癌细胞中低表达;在乳腺癌细胞MCF-7中转染WNT5B表达质粒后,WNT5B表达上调,差异有统计学显著性(P0.05);与对照组相比,过表达WNT5B后,MCF7细胞的活力明显降低,处于S期细胞的量明显增加,G1和G2/M期细胞明显减少,且细胞凋亡比例明显增加,差异均有统计学显著性(P0.05)。结论:WNT5B在乳腺癌细胞中低表达,过表达WNT5B可使人乳腺癌细胞MCF-7阻滞在S期,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。