利用基因芯片研究与胶质母细胞瘤侵袭性相关的基因

目的探讨利用基因表达谱芯片筛选人脑胶质母细胞瘤与侵袭性相关基因的表达及功能。方法用含13 939种人类基因的BioStarH140S型芯片,以成人脑及6例胶质母细胞瘤组织总RNA制备的探针杂交芯片;ScanArray4 000扫描芯片荧光信号,提取脑及胶质母细胞瘤组织差异基因,并进行生物信息分析及功能研究。结果表达谱芯片筛选出胶质母细胞瘤差异基因198条(1.42％),与细胞信号和传递蛋白、细胞骨架、代谢、蛋白翻译合成、细胞周期蛋白类、癌基因和抑癌基因等多类基因密切相关;与侵袭性相关的8条细胞骨架和细胞外基质基因表达谱相似,均在胶质母细胞瘤中显著上调,生物信息分析为α-连环素基因、钙粘附素1基因、层粘连蛋白、纤连蛋白1基因、基质金属蛋白酶2、Ⅲ型胶原基因、组织金属蛋白酶抑制1基因和血小板衍生生长因子受体A基因。结论表达谱芯片是高通量筛选胶质瘤相关基因的生物高新技术,侵袭性相关基因为判断胶质母细胞瘤患者的预后提供了分子生物学指标,有助于临床诊治。     

胶质母细胞瘤基因表达谱及相关基因的聚类研究

目的探讨人脑胶质母细胞瘤发生、发展中相关基因的表达及功能.方法用含13 939种人类基因的BioStarH140S型表达谱芯片,以正常成人脑及不同级别胶质瘤组织总RNA制备的探针杂交芯片;ScanArray 4000扫描芯片荧光信号,提取脑及胶质瘤组织差异基因并进行生物信息分析;用Hierarchical聚类对胶质瘤差异基因进行特征提取;用Northern杂交验证及进行初步功能研究.结果正常脑与18例不同级别胶质瘤组织间筛选出多类差异表达基因,通过生物信息学和Hierarchical聚类,发现α-连环素、微型染色体维护蛋白7、细胞周期素B2、FBX05、着丝粒蛋白F基因与胶质母细胞瘤密切相关,该类基因在低级别胶质瘤中表达差异不明显,但胶质母细胞瘤中表达明显上调.Northern杂交显示该类基因与胶质母细胞瘤密切相关,与芯片结果一致.结论基因表达谱芯片可快速、高效地筛选胶质瘤相关基因,发现的5条基因与胶质母细胞瘤侵袭性强密切相关,可成为判断胶质瘤预后的分子生物学指标.     

cDNA芯片和Oligo芯片结合Meta分析筛选高低级别星形胶质细胞瘤特异性靶标研究

目的 筛选高级别与低级别星形胶质细胞瘤之间的特异性差异基因,并结合Meta分析法对不同样本在两种不同芯片和不同平台研究的结果进行综合.方法 (1)采用eDNA芯片建立33张星形胶质细胞瘤基因表达谱,Oligo芯片建立17张星形胶质细胞瘤表达谱芯片,筛选低级别(Ⅰ、Ⅱ级)和高级别(Ⅲ、Ⅳ级)星形胶质细胞瘤间的差异基因,并对其生物信息进行分析;(2)利用挖掘出的基因数据采用Fisher判别、支持向量机法和贝叶斯混合协变量分析法对高、低级别胶质瘤进行判别检验;(3)对两种不同芯片得出的数据采用Meta分析法进行综合分析.结果 cDNA表达谱芯片星形胶质瘤Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级间的分型基因148条;Oligo芯片数据找到高、低级别之间判别基因46条,对胶质瘤样本可达到85%以上预测率;生物信息分析发现靶基因与众多生物功能相关,对两种芯片的表达谱数据的Meta综合分析结果发现一些功能还尚不清楚的差异基因,值得深入研究.结论 不同样本在不同平台、不同芯片中的数据不尽相同,Meta分析能较好地减少芯片数据的误差,筛选出的基因可作为进一步研究的靶基因.     

人BTBD10新基因克隆及组织表达和在脑胶质瘤中的表达谱及聚类

目的探讨人脑胶质瘤相关BTBD10新基因克隆、正常成人组织分布及在不同级别星形细胞瘤中的表达。方法构建胎脑cDNA文库和大规模测序获得全长BTBD10新基因;用Clontech人多组织文库(MTC)为模板研究BTBD10在8种正常组织中的分布;用含13 939种人类基因(8 347种已知基因,5 592种未知基因)的BioStarH140S型表达谱芯片检测BTBD10在星形细胞瘤中的表达,Hierarchical聚类分析与BTBD10表达谱相近的基因群;Northern杂交验证BTBD10在不同级别胶质瘤中的表达。结果人胎脑文库中克隆的BTBD10新基因含1 428bp长的开放阅读框,编码475个氨基酸的蛋白;芯片结果提示BTBD10基因在18例胶质瘤组织中表达一致降低,与促性腺诱导素转录阻抑蛋白GIOT1、血管性肠肽VIP等7条基因的表达谱相似;BTBD10在正常脑组织中表达量最高,而心、肺、肝、肾、胰腺中表达较低;Northern显示BTBD10与胶质瘤发生密切相关,与芯片结果一致。结论表达谱芯片可快速高效筛选脑胶质瘤相关基因,BTBD10基因与胶质瘤发生密切相关,在脑胶质瘤的转录调控中起重要作用。     

脑星形胶质细胞瘤组织P21^WAF1／CIP1mRNA的表达与p53？…

目的：探讨脑星形胶质细胞瘤组织Ｐ２１＾ＷＡＦ１／ＣＩＰ２ｍＲＮＡ的表达与ｐ５３基因突变的关系及其意义。方法：应用ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对３８例新鲜脑星形胶质细胞瘤组织中上述两种基因进行研究。结果：ｐ５３基因在脑星形胶质细胞瘤组织中的突变率为２８．９％（１１／３８），且在Ⅲ、Ⅳ级肿瘤突变率显著高于Ⅰ～Ⅱ级者（Ｐ〈０．０５）；Ｐ２１＾ＷＡＦ１／ＣＩＰ１ｍＲＮＡ在Ⅲ，Ⅳ级中的表达显著低于Ⅰ～     

脑星形胶质细胞瘤组织P21~(WAF1/CIP1)mRNA的表达与p53基因突变的关系

目的：探讨脑星形胶质细胞瘤组织Ｐ２１~(WAF1/CIP1) ｍＢＮＡ的表达与p~(53)基因突变的关系及其意义。方法：应用 ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对３８ 例新鲜脑星形胶质细胞瘤组织中上述两种基因进行研究。结果：p~(53)基因在脑星形胶质细胞瘤组织中的突变率为２８．９％（１１／３８），且在Ⅲ、Ⅳ级肿瘤突变率显著高于Ⅰ～Ⅱ级者（Ｐ＜０.０５）；Ｐ２１~(WAF1/CIP1)ｍＲＮＡ在Ⅲ，Ⅳ级中的表达显著低于Ⅰ～Ⅱ级肿瘤组织（Ｐ＜０．０１）；１１例p~(53)基因突变组中，Ｐ２１~(WAF1/CIP1)ｍＲＮＡ表达阳性率明显低于２７例p~(53)基因未突变组（Ｐ＜０．０５）。结论：脑星形胶质细胞瘤组织中Ｐ２１~(WAF1/CIP1)ｍＲＮＡ的低表达可能与p~(53)基因突变有关。     

星形细胞瘤热休克蛋白70（HSP70）表达的研究

目的 研究HSP70在星形细胞瘤中的表达与肿瘤病理分级的关系,探讨HSP70在星形细胞瘤预后判断上的价值。方法 用SP免疫组化方法对96例星形细胞瘤中HSP70的表达进行研究。结果 在星形细胞瘤中,HSP70的阳性表达随星形细胞瘤的病理分级增高而增加。结论 结合脑星形细胞瘤的病理组织分级,HSP70的表达能反映星形细胞瘤的恶性进展,从而对判断的预后有一定价值。     

基于基因表达谱筛查小鼠脑缺血再灌注后星形胶质细胞活化相关基因

目的 利用全基因组表达谱芯片筛查脑缺血再灌注后星形胶质细胞中起关键作用的信号通路,并对 星形胶质细胞活化过程中可能参与的关键基因进行分析。 方法 从美国基因表达汇编（gene e xpression o mnibus,GEO）数据库中选取小鼠星形胶质细胞基因表 达谱芯片（Affymetrix Gene Chip Mouse Genome 430 2.0 Arrays）数据8张。小鼠分为脑缺血再灌注组 （脑缺血1 h再灌注24 h）和假手术组,每组4只。筛选差异表达基因,并进行信号通路分析,筛选核心 信号通路,分析具有重要调控作用的基因。 结果 共筛查出1966个在脑缺血再灌注后星形胶质细胞中差异表达的基因,其中有1210个基因表达 上调,756个基因表达下调。信号通路分析得到154个差异表达的信号通路。进一步分析发现,在脑 缺血再灌注后参与星形胶质细胞活化的关键信号通路主要有丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）信号通路、凋亡（apoptosis）、细胞周期（cell cycle）和p53信号通路。对信号通路 中差异基因的分析发现,Flnc 和Ccnd1基因在脑缺血再灌注后星形胶质细胞活化过程中具有重要作用。 结论 脑缺血再灌注后星形胶质细胞中有大量基因表达异常。通过对差异基因的分析,筛选出脑缺 血再灌注损伤过程中潜在的发挥重要调控作用的新靶点。     

抗原处理相关转运蛋白和星形细胞瘤的相关性研究

目的探讨星形细胞瘤中抗原处理相关转运(TAP)蛋白分子表达及其临床意义,探讨星形细胞瘤的治疗策略。方法采用免疫组织化学技术对50例星形细胞瘤患者肿瘤组织和15例来自于脑外伤内减压手术、高血压脑出血及脑血管畸形手术中所取的正常脑组织中TAP蛋白的表达进行了检测。结果肿瘤组与正常组TAP蛋白阳性细胞百分率比较有显著性差异；低级别星形细胞瘤25例与高级别星形细胞瘤25例TAP蛋白平均阳性细胞百分率比较有显著性差异；低级别星形细胞瘤与高级别星形细胞瘤病例TAP蛋白表达阳性率比较有显著性差异；50例星形细胞瘤患者中复发者与未复发者TAP蛋白表达阳性率比较有显著性差异：死亡者与未死亡者TAP蛋白表达阳性率比较有显著性差异；50例星形细胞瘤患者中TAP蛋白表达阳性者与表达阴性者GOS评分比较有显著性差异。结论星形细胞瘤患者存在TAP蛋白分子低表达,推测其促使星形细胞瘤患者肿瘤细胞逃避免疫监视；推测TAP蛋白缺失率可成为预测星形细胞瘤的发生、恶性程度及其预后的指标之一。     

MMP-2及PTEN在人脑星形细胞瘤中的表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)及抑癌基因PTEN在人脑星形瘤中的表达及二者与人脑星形细胞瘤侵袭性的关系。方法用免疫组织化学SABC法检测50例人脑星形细胞瘤组织和10例正常人脑组织中的MMP-2和PTEN蛋白的表达,并且分析二者与人脑星形细胞瘤临床病理分级的关系。结果 MMP-2和PTEN在低度恶性星形细胞瘤和高度恶性星形细胞瘤组织中表达差别有统计学意义(p<0.05)。随着星形细胞瘤恶性度增高,MMP-2的表达强度呈上升趋势而PTEN表达强度逐渐下降;Spearman等级相关分析表明人脑星形细胞瘤中MMP-2和PTEN之间呈负相关(Rs=-0.518,P<0.01)。结论 MMP-2和PTEN是人脑星形细胞瘤分化程度和转移的潜在生物学指标,联合检测MMP-2和PTEN更有利于判断星形细胞瘤生物学行为和病理分级。     

胶质瘤放射敏感性与EGFR表达关系的探讨

目的探讨EGFR的表达水平与胶质瘤放射敏感性的关系。方法应用免疫组织化学SABC法检测EGFR在5例正常脑组织,2种胶质瘤细胞系及82例不同放射敏感性胶质瘤中的表达。结果EGFR在正常脑组织未见表达,在两种胶质瘤细胞系表达率为100%。EGFR在髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质细胞瘤、低(Ⅰ~Ⅱ级)及高级别(Ⅲ~Ⅳ级)星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤的表达率呈依次上升趋势。髓母细胞瘤表达率最低,与其他各组均有显著性差异(P<0.05)。结论EGFR表达水平与胶质瘤的不同放射敏感性可能相关。     

一条人脑胶质瘤相关新基因的克隆与表达

目的运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因，并对其中一条与脑胶质瘤相关的新基因进行了克隆和表达的研究。方法抽提正常成人脑组织与人脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针，经杂交、洗涤后，通过计算机观察二者表达谱的差异情况，对681F05克隆子进行了Northern blot，生物信息学分析和蛋白质的表达。结果通过四次基因芯片筛选，获得15条与胶质瘤相关的新基因，经northern blot证实681F05基因在人正常脑组织中低表达，而在人脑胶质瘤中高表达。BLASTn和BLASTx分析显示，它们编码蛋白与线虫Cyp-10蛋白同源性分别为52％和72％。cDNA序列分析发现这两个克隆是同一个基因[命名为cyclophilin—like gene（PPIL3）]的两个不同的剪切体（PPIL3a和PPIL3b）。并在大肠杆菌中得到了PPIL3a和PPIL3b与GST较好表达的融合蛋白。结论基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少，高质量，高速度，高敏感等特性。681F05基因可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因。     

Screening of differentially expressed genes related to differentiation and proliferation by gene expression profiling of different grade astrocytoma cell lines*☆

BACKGROUND： The detection of differential gene expression in brain is possible by cDNA microarray technology, and the screening of differentially expressed genes might provide a biological basis for gene-targeted therapy for tumors. OBJECTIVE： To detect the differential expression of genes among astrocytoma SHG-44 （WHO grade Ⅳ）, CHG-5 （WHO grade Ⅱ）, and ATRA-treated SHG-44 cell lines by cDNA microarray. DESIGN： Laboratory experiments in vitro. SETTING： Department of Neurobiology, the Third Military Medical University. MATERIALS： The experiment was performed at the Department of Neurobiology in the Third Military Medical University of the Chinese PLA from January to October 2007. The SHG-44 cell line （WHO grade Ⅳ） was established by Prof. Ziwei Du, and the CHG-5 cell line （WHO grade Ⅱ） was set up by Prof. Xiuwu Bian from the Third Military Medical University of the Chinese PLA. The cDNA microarray containing 9182 known genes was prepared and provided by Dr. Yang Zhong at the City University of Hong Kong. METHODS： To screen differentially expressed genes from the gene expression profiles detected by cDNA microarray comparisons were made between CHG-5 and SHG-44 cells and between SHG-44 cells with or without treatment with 10 μmol/L ATRA. Some differentially expressed genes were selected randomly for Northern Blot analysis to confirm the results of the microarray. The determination criteria for differential gene expression were as follows. ① The ratio of Cy5 signal to Cy3 was greater than 2.0 or less than 0.5. ② The results of the triplicate microarray hybridizations showed the same trend in three experiments. ③ A gene appeared at least two times on the triplicate microarray hybridizations, and the 3^rd value did not show a contradictory trend. A normalized ratio of Cy5 intensity to Cy3 greater than 2.0 or less than 0.5 was considered to represent up-regulated or down-regulated gene expression, respectively. MAIN OUTCOME MEASURES： The identification of genes that were sim     

脑膜瘤病理级别基因诊断芯片数学模型的建立

目的根据脑膜瘤基因表达谱,寻找脑膜瘤病理分级(WHO2000标准)的分子生物学依据,并建立脑膜瘤病理级别基因诊断芯片的数学模型。方法利用cDNA芯片技术建立24例脑膜瘤基因表达谱数据库,应用生物信息学分析软件GeneMaths2.0对脑膜瘤基因表达谱数据进行“非监督”样本聚类分析(Hierarchical聚类),将聚类结果与脑膜瘤样本的病理级别进行相关性分析;应用SAS9.0软件,用“贝叶斯判别法”建立脑膜瘤病理级别诊断的判别函数方程;对于脑膜瘤基因表达谱的数据可靠性,应用点杂交(DotBlot)实验进行了验证。结果脑膜瘤基因表达谱样本聚类结果与其样本的病理级别存在高度相关性;筛选出5条基因,建立了3个判别函数方程,根据它们的表达情况可以较准确的判断脑膜瘤的病理级别。结论脑膜瘤目前的病理分级标准有分子生物学基础;根据脑膜瘤基因表达谱可建立判断脑膜瘤病理分级的诊断芯片数学模型。     

Identification of KLRC2 as a candidate marker for brain tumor-initiating cells

ABSTRACT

Objective: Brain tumor-initiating cells are characterized by their features of self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumorigenicity. We analyzed the gene expression of brain tumor-initiating cells to identify their novel cellular markers.

Methods: We performed cDNA microarray, in silico expressed sequence tags (ESTs), RT-PCR, and q-PCR analyses.

Results: We identified 10 genes that were more highly expressed in brain tumor-initiating cells than in neural stem cells. In addition, we identified 10 other genes that were more highly expressed in brain tumor-initiating cells than in glioma cell line cells from the cDNA microarray analysis. Using the EST database, we looked to see if the 20 genes were expressed more highly in gliomas, compared with normal adult brains. Among the 20 genes, five (KLRC2, HOXB2, KCNJ2, KLRC1, and COL20A1) were expressed more than twice in glioma samples, compared with normal adult brains, and, therefore, were referred for further evaluation. RT-PCR was conducted using cDNA samples obtained from neural stem cells, normal brain tissue, fetal brain tissue, glioma cell lines, and glioma tumor-initiating cell lines. KLRC2, a transmembrane activating receptor in natural killer cells, was expressed more highly in glioma-initiating cells than in neural stem cell lines or normal adult brain tissue. The q-PCR analysis revealed that expression of KLRC2 was significantly higher in brain tumor-initiating cells compared to normal brain controls.

Conclusion: KLRC2 could be a novel cellular marker for brain tumor-initiating cells.     

脑胶质瘤相关的全长新基因PPIL-3的克隆和蛋白质特性的研究

目的 运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因,并对其中一条与脑胶质瘤相关的新基因进行了克隆和表达的研究.方法 抽提正常成人脑组织与人脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机观察二者表达谱的差异情况,对681F05克隆子进行了Northern blot,生物信息学分析和蛋白质的表达.结果 通过4次基因芯片筛选,获得15条与胶质瘤相关的新基因,经Northern blot证实681F05基因在人正常脑组织中低表达,而在人脑胶质瘤中高表达.BLASTn和BLASTx分析显示,它们编码蛋白与线虫Cyp-10蛋白同源性分别为52%和72%.cDNA序列分析发现这两个克隆是同一个基因(cyclophilin-like gene,PPIL3)的两个不同的剪切体(PPIL3a和PPIL3b).并在大肠杆菌中得到了PPIL3a和PPIL3b与GST较好表达的融合蛋白.PPIL3b蛋白具有依赖于Ca2+/Mg2+核酸酶活性,其核酸酶活性可被一定浓度的K+/Na+抑制.结论 基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少、高质量、高速度、高敏感等特性.681F05基因可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因.     

胶质瘤患者抑癌基因RASSF1A启动子区甲基化研究

目的探讨RASSF1A抑癌基因在胶质瘤组织及脑正常组织中甲基化程度及与临床特征的关系。方法46例脑胶质瘤组织及6例脑正常组织采自手术患者。用甲基化特异性聚合酶链反应（MS—PCR）方法检测46例胶质瘤（其中包括星形细胞瘤19例，室管膜瘤16例，胶质母细胞瘤11例）及6例脑正常组织中RASSF1A基因甲基化状态。并对RASSF1甲基化发生率与临床各因素之间的关系进行分析。结果（1）46例脑胶质瘤组织DNA标本中RASSF1A基因甲基化发生率为65．2％（30／46）；6例脑正常组织中RASSF1A基因启动子未发生甲基化；RASSF1A在胶质瘤和脑正常组织之间发生甲基化率比较差异有显著性，（P=0．017，P〈0．05）。在46例脑胶质瘤中RASSF1A有30例发生甲基化，其中低级别组14例（14／26），高级别组16例（16／20），两组之间甲基化率比较无明显差异，（P〉0．05）。其中星形细胞瘤，室管膜瘤，胶质母细胞瘤甲基化发生频率分别为63．2％（12／19），68．8％（11／16），63．6％（7／11）。在各组之间甲基化发生率比较均无统计学意义，（P〉0．05）。②RASSF1A基因甲基化程度与脑胶质瘤病理分型、肿瘤大小之间无显著相关性。结论RASSF1A在胶质瘤中有甲基化发生，在脑正常组织中未发生甲基化，检测胶质瘤中RASSF1A基因启动子区甲基化情况对临床判断肿瘤发生发展有指导意义。