BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

OBJECTIVE: To study the optimal dosage and timing for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro. METHODS: Bone marrow-derived MSCs of SD rats were cultured in vitro routinely and the sixth passage was taken for identification of specific surface antigens by flow cytometry. Before reaching cell confluence, the purified MSCs were incubated with BrdU at different concentrations (5, 10, and 15 micromol/L) for different incubating time (3, 12, 24, 36, 48, and 72 h) with 10 micromol/L BrdU, to identify the optimal BrdU concentration and incubating time for cell labeling. Immunohistochemistry was performed to calculate the labeling index (LI). RESULT: Flow cytometry showed that MSCs expressed CD29 and CD44 but not CD11b or CD45. Incubation of the MSCs with BrdU at 10 micromol/L and for an optimal length of 48 h appeared to achieve the highest LI, both of which exceeded 98%, with the labeling identifiable in five consecutive passages. CONCLUSIONS: The continually passaged cells are MSCs, the incubation of which with 10 micromol/L BrdU for 48 h may achieve a LI over 98% without producing obvious cell damages. The results suggest that BrdU labeling provides a feasible means for a dynamic in vivo observation of the survival, growth and differentiation of the implanted MSCs.     

BrdU标记胎兔骨髓间充质干细胞及对细胞生物学行为影响的体外研究

目的:通过用5-溴脱氧尿苷(5- bromodeoxyuridine,BrdU)标记胎兔骨髓间充质干细胞(bone marrow rnesenchymal stem cells,BMSCs),探讨BrdU作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:取胎兔骨髓组织密度梯度离心法分离培养BMSCs.取P3代细胞以终浓度分别为5,...     

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记的实验研究

目的 探讨体外5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyuridine, BrdU)标记兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs) 的方法,探索BrdU体外标记兔MSCs的最佳时间和最佳浓度。方法 通过形态学及流式细胞术鉴定全骨髓培养法分离培养的细胞为MSCs。MSCs经不同BrdU浓度标记及不同BrdU标记时间, 免疫细胞化学法鉴定并评估。结果 全骨髓培养法培养的MSCs经流式细胞术检测,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物BrdU的浓度增加而逐渐增高, 40μmol/L及72h标记阳性率达85-95%。结论 应用BrdU体外标记MSCs是安全可靠的,兔MSCs体外BrdU标记最佳时间和最佳浓度分别为72h和40μmol/L。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究

目的：拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：密度梯度离心和贴壁培养相结合,台盼蓝染色观察离心后细胞活性,绘制BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。诱导传代细胞向成软骨细胞分化,2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达和阿尔新蓝染色检测蛋白多糖的表达。BrdU标记BMSCs,观察最佳标记率及标记时间,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。结果：密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的BMSCs,分离后细胞活性均大于99%,BMSCs表面标记CD90、CD45、CD34阳性细胞表达分别为99.24%、0.03%、1.37%,BMSCs的生长曲线呈S形。成软骨诱导2周后Ⅱ型胶原免疫组化阳性,阿尔新蓝染色细胞基质被蓝染。BrdU标记后,MSCs标记率〉95%,BrdU细胞标记最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L,标记后细胞活性高。结论：采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高BMSCs;BrdU是一种简单、有效的标记BMSCs的方法,BrdU对细胞标记率高。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性.方法:用密度为1.073 kg/L的细胞分离液分离骨髓间充质干细胞.取第3代培养细胞用含0.1 μmoL/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的成骨细胞分化培养液培养.于培养7,14 d取细胞爬片做改良的Gomori钙钴法碱性磷酸酶染色,21 d做Von Kassa染色;脂肪细胞分化培养用含10 mg/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.25 mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤和100 μmol/L吲哚美辛的培养液诱导培养,于诱导3,7 d取细胞爬片做油红0染色.用含1mmol/L β-巯基乙醇和150 mL/L FBS的DMEM培养基先预诱导分化24 h.再用含有5 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM无血清培养基诱导分化5 h.做神经元特异性烯醇化酶、角质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白免疫组化染色.结果:在加入成骨细胞分化培养液后7和14 d钙钴法碱性磷酸酶染色阳性细胞百分率分别为11.5%和37.5%.21 d的细胞爬片Von Kassa染色显示钙盐沉积.在脂肪细胞诱导3和7 d分别得到22%和90.33%油红O染色阳性细胞.5 h神经细胞诱导分化后NSE免疫组化染色阳性率为33%,NF-200阳性细胞率为37.5%,GFAP染色阴性.结论:骨髓间充质干细胞在体外可定向加药诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记

目的：探讨分离、体外培养、鉴定及体外标记兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stemcells,MSCs）的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法：选择健康幼龄新西兰大耳白兔,于双侧髂后上嵴及胫骨上端内侧部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培养法（直接贴壁法）分离培养MSCs,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律。对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞术对CD34、CD44、CD45、CD105这4种MSCs表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU）体外标记兔MSCs,检测其标记阳性率。结果：全骨髓培养法培养的原代MSCs接种4天后可以被观察到,形态均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7～8d MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第4～8d为高速生长期,MSCs在第3～5代生长最为旺盛。经流式细胞术鉴定,CD34（-）、CD45（-）、CD44（＋）、CD105（＋）,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU体外标记兔MSCs的阳性率达到85%～90%。结论：应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞且操作简便,效率高,经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。应用BrdU体外标记兔MSCs是安全可靠的。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

大鼠骨髓间质干细胞的BrdU体外标记和体内示踪研究

目的探讨骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外标记和体内示踪技术。方法分离培养并鉴定大鼠BMSCs,进行5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后,体外培养被标记的BMSCs,观察其连续传代后的BrdU可标记时间和标记效率;建立大鼠胃黏膜损伤模型,将分离纯化的BrdU标记BMSCs移植到损伤的胃黏膜下,体内观察BrdU对活体移植BMSCs的示踪作用。结果免疫组化显示体外培养大鼠BMSCs的CD44、CD90表达阳性,CD14、CD45表达阴性,显微结构表现出干细胞特征。进行BrdU标记后,标记阳性率随标记时间延长而增高,48h达高峰,72h仍维持高阳性率。终浓度为10μmol/L的BrdU孵育48h、72h阳性标记率高于5μmol/L BrdU组(P<0.05),但与15μmol/L BrdU组阳性标记率差异无统计学意义(P>0.05),并且连续传代培养21d后也可检测到。BrdU可示踪BMSCs在损伤的胃黏膜下局部定植。结论 BrdU在浓度为10μmol/L、标记时间48h至72h标记效率较高;BrdU标记可用于一定时间段内BMSCs移植入体内后定植和生长的动态示踪观察方法。     

骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的可能机制研究

在心肌梗死的实验探索与临床研究方面,学者已发现骨髓间充质干细胞移植对治疗心肌梗死具有显著的作用。骨髓间充质干细胞的增殖能力强,分化范围广,能修复损伤的功能组织,通过移植来帮助心肌细胞再生,能有效改善患者的心肌功能。国内外学者已成功进行干细胞移植治疗心肌梗死的动物实验和医学临床试验,取得了可喜的效果。     

全骨髓贴壁改良法分离培养人骨髓间充质干细胞及标记鉴定

目的对比、探求分离培养人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的方法,探讨hMSCs鉴定和标记的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法采集成人健康志愿者骨髓5mL,全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法、密度梯度离心法分离纯化、培养和扩增,获得hMSCs,对比三种方法。＂慢冻速融＂的原则进行细胞冻存、复苏。流式细胞术检测hMSCs的表面标志。hMSCs经5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）标记,免疫细胞化学法测定并评估。结果 hMSCs运用三种方法均可获得,比较全骨髓贴壁改良培养法最为方便高效分离获取hMSC、体外扩增迅速。流式细胞仪检测结果显示：CD44阳性及CD71弱阳性,表达率分别为95.05%,78.86%;CD34、CD45阴性,表达率分别为3.40%,2.88%。Brdu最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72 h。结论 hMSCs采取全骨髓贴壁改良法进行较好的纯化和扩增,Brdu标记可用于hMSCs的生长和分化的动态示踪观察。有望建立hMSCs库,为组织工程、细胞移植研究打好基础。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

心肌细胞体外微环境中骨髓间质干细胞向心肌样细胞的分化

目的：分析心肌组织内何种细胞对骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的定向分化起决定作用。方法：利用BMSCs与心肌细胞（cardiomyocytes,CM)、内皮细胞（endothelial cells,EC)共培养和单独培养，分析形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果：与CM共培养后，相邻的BMSCs之间融合成肌管样结构，并与相邻胎鼠CM初步形成闫盘样结构。心肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC)抗体染色呈阳性。在与EC共培养以及BMSCs单独培养时，BMSCs均未出现肌管样结构，MHC染色呈阴性。结论：CM对BMSCs的定向分化具有一定作用。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性观察

目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)部分生物学特性。方法：自健康人骨髓中分离出MSCs,进行原代培养,第5d首次更换培养液,以去除未贴壁细胞,以后每周换液2次,细胞铺满整个培养瓶底90％时开始传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性,并绘制传代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第3代MSCs细胞表面分子CD29、CD44,以进行MSCs鉴定。结果：MSCs体外培养为贴壁生长。MSCs原代培养约18～21d才达传代要求;传代培养细胞生长潜伏期仅24～36h,对数增长期约3～5d,之后为平台期,4～6d传1代。传至第8代,出现凋亡征象。第3代MSCs细胞表面CD29、CD44的表达率分别为90．6％和91．5％,MSCs均一性较高。结论：从人骨髓中分离出的MSCs在体外环境中具有很强的自我更新和分裂增殖能力。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定

目的：建立一种体外分离，培养和鉴定小鼠骨髓间质干细胞的方法，探讨体外培养中间质干细胞的一些生物学特点，为利用MSCs促进创伤修复提供实验基础，方法：分离5－6周龄的小鼠胫骨，股骨，用预冷的IMDM培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后12－16d形成意志贴壁的成纤维状细胞，体外多向诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线的测定，观察其接种贴壁率，检测细胞周期和超微结构。结果：体外传代培养的MSCs具有分化形成成骨和成脂细胞的能力；MSCs倍增时间约为38h，传代后12h贴壁达90％以上，细胞周期显示有80％细胞处于G0／G1期，并用电镜照片显示其超微结构。结论：在本实验条件下，体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点，可望用于自体创伤促愈。     

兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养

目的：评价兔自体骨髓间充质干细胞作为半月板组织工程理建中种子细胞的可能性。方法;采用体外细胞培养技术将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和和培养,并研究其增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示,兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖增能力。结论：兔自体骨髓间充质干细胞生物年龄较为年轻,用作半月板组织工程 种子细胞具有较强的可行性。