上皮缺损诱导角膜新生血管小鼠模型中VEGF与sFlt-1变化趋势的实验研究

目的观察小鼠角膜上皮缺损与角膜新生血管发生发展的关系，初步探讨新生血管发生发展过程中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与血管内皮生长因子可溶性受体（soluble VEGF receptor-1，sFlt-1）含量的变化趋势。方法正常成年雄性昆明小鼠294只，平均分为2组，分别接受角膜缘损伤加角膜上皮刮除（A组）和单纯角膜上皮刮除（B组）2种处理，干预后1、3、5、7、10、14d取角膜，分别行苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）及过碘酸-希夫染色，铺片，免疫荧光标记血管内皮细胞，非变性蛋白印迹分析各时间点结合态和游离态VEGF蛋白含量，实时定量聚合酶链反应分析对应时间。sFlt-1信使核糖核酸（message ribonuclei cacid，mRNA）的表达强度。结果两组均成功诱导角膜新生血管。除第14天外，A组各时间点新生血管面积均高于B组，但前者上皮修复延迟，早期炎性细胞浸润程度亦较高，晚期角膜部分结膜化。A组各时间点VEGF总蛋白及游离蛋白含量均明显高于B组；sFlt-1 mRNA表达于早中期下降而后期上升。结论持续一定时间的角膜上皮缺损可相对减少sFlt-1的表达，增加游离VEGF，诱导血管生成；角膜缘损伤通过加重上皮缺损程度，增加血管形成。（中国眼耳鼻喉科杂志，2009，9：80—82）     

粉防己碱对大鼠角膜新生血管HIF-1α和VEGF表达的影响

目的研究粉防己碱（tetrandrine，Tet）对大鼠角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法建立大鼠角膜碱烧伤诱发CNV模型，采用裂隙灯照相、免疫组化和RT-PCR等方法，分别检测使用Tet前后HIF-1α和VEGF在SD大鼠CNV中的表达情况。结果在正常角膜，HIF-1α和VEGF没有表达或在上皮基底膜有微弱表达；在新生血管对照组，角膜全层HIF-1α和VEGF表达明显增强，其表达部位主要分布在新生血管形成区域和上皮全层；用药组角膜新生血管密度明显减低，HIF-1α和VEGF相应在角膜基质层新生血管形成区域表达减少。经SPSS软件分析，3组间具有统计学差异。结论Tet可以有效地抑制大鼠角膜碱烧伤诱发CNV的生长，降低角膜新生血管HIF-1α和VEGF的表达。[眼科新进展2007；27（2）：102—105]     

大鼠角膜化学伤后PEDF和VEGF的不平衡表达

目的比较硝酸银化学伤后大鼠角膜和正常角膜色素上皮衍生因子（PEDF）和血管内皮生长因子（VEGF）表达水平，揭示两者与角膜新生血管的相关性。方法10只大鼠左眼角膜硝酸银化学伤后为实验组，右眼为正常对照组，伤后15d行免疫组织化学法定位及Western blot定量检测样本角膜PEDF、VEGF等的表达。结果免疫组织化学检查：实验组角膜VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）强表达，PEDF未见表达或弱表达。正常组角膜PEDF高表达，VEGF弱表达，bFGF几乎不表达。Western Blot分析：实验组角膜PEDF表达明显下降（t=8．0049，P〈0．01），VEGF表达显著升高（t=48．3637，P〈0．01）。结论角膜严重化学伤后新生血管抑制因子PEDF破坏，刺激因子VEGF产生增加，PEDF／VEGF比值降低，角膜血管新生。     

趋化因子受体4拮抗剂对实验性角膜新生血管的抑制作用及其机制

背景基质细胞源性细胞因子1α/趋化因子受体4（SDF-1αCXCR4）信号途径是机体内介导多种细胞趋化、黏附以及增生的关键分子,能通过促进血管内皮祖细胞向肿瘤组织的迁移而促进肿瘤新生血管的发生,同时也参与新生血管性眼病的病理过程。目的探讨阻断CXCR4信号通路对实验性角膜新生血管（CNV）发生发展的抑制作用及机制。方法收集8周龄BALB／c小鼠80只,将浸有1mol／LNaOH的滤纸贴附在左眼角膜中央40S以诱导小鼠CNV,按随机数字表法将动物分为透明质酸钠组（质量分数0．2％透明质酸钠点眼）及CXCR4拮抗剂组（0．2％透明质酸钠配制的CXCR4拮抗剂点眼）,自碱烧伤当日分别用相应的药物点眼共14d,于第14天裂隙灯下观察两组小鼠的CNV,然后制备角膜悬液,用流式细胞技术检测角膜悬液中CD31的表达值;制备角膜组织切片,以逆转录PCR（RT—PCR）和Western blot法检测CXCR4mRNA和蛋白在小鼠角膜组织中的表达,以免疫组织化学法检测角膜组织内CD31阳性标记的血管内皮细胞。以ELISA法检测角膜组织裂解液内血管内皮生长因子（VEGF）的表达。使用CXCR4拮抗剂干预小鼠腹腔来源的巨噬细胞,检测粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM—CSF）刺激后培养上清液中VEGF的表达。结果小鼠角膜碱烧伤后2周,裂隙灯下可见CNV达高峰,与透明质酸钠组比较,CXCR4拮抗剂组CNV明显减少;角膜免疫组织化学检测显示,CXCR4拮抗剂组小鼠角膜中CD31阳性染色强度弱于透明质酸钠组,CD31阳性细胞数量明显减少;进一步流式细胞技术检测发现,CXCR4拮抗剂组CD31阳性表达率为（9．50±2．34）％,明显低于透明质酸钠组的（17．50±3．16）％,差异有统计学意义（t=-7．312,P〈0．05）;RT—PCR和Western blot法检测表明,碱烧伤后2、4、7d小鼠角膜组织中CXCR4mRNA和蛋白的表达均明显高于正常小鼠角膜组织,组间比较差异均有统计学意义（P〈0．01;P〈0．05）。ELISA检测结果显示,CXCR4拮抗剂点眼后4d、7d角膜组织内VEGF表达明显低于透明质酸钠组,差异均有统计学意义（t=10．927、5．151,P〈0．05）。体外实验发现,细胞培养后12、24和48h,GM—CSF＋CXCR4拮抗剂组上清液中VEGF的表达水平明显低于GM—CSF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论CXCR4拮抗剂能通过下调VEGF的表达抑制实验性CNV的形成。     

shRNA抑制缺氧条件下人视网膜色素上皮细胞低氧诱导因子-1α基因对血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨缺氧条件下人视网膜色素上皮（hRPE）细胞低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法利用体外转录法合成针对HIF—1α mRNA序列的靶点之一的小发卡环RNA（shRNA）,以化学低氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞缺氧环境,对缺氧培养条件下hRPE细胞的HIF-1α进行RNA干扰,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF-1α和VEGF mRNA的表达,免疫印迹法检测HIF—1α和VEGF蛋白水平,以正常组、缺氧组及阴性转染组作为对照,观察其对HIF-1α基因的沉默效果及对VEGF表达的抑制作用。结果转染HIF-1α mRNA的特异性shRNA后,RT-PCR检测结果显示缺氧条件下hRPE细胞HIF-1α基因沉默效果为77．1％,VEGF mRNA的表达水平下降了27．8％;免疫印迹法检测结果显示HIF—1α和VEGF蛋白水平显著降低。结论针对HIF-1α mRNA的shRNA能有效地使HIF-1α基因沉默,进而抑制缺氧对VEGF的上调作用。（中华眼科杂志．2007。43：1022—1027）     

shRNA抑制人RPE细胞HIF-1 α基因表达对VEGF及PEDF表达的影响

目的利用小发卡环RNA（shRNA）使缺氧培养条件下的人视网膜色素上皮（RPE）细胞缺氧诱导因子1α（HIF-1α）基因沉默，观察对血管内皮生长因子（VEGF）及色素上皮衍生因子（PEDF）的影响。方法体外转录法合成对HIF-1αmRNA序列的两个靶点的shRNA，对缺氧（150μmol／LCoCl2模拟）培养条件下人RPE细胞的HIF-1α进行干扰，使用RT—PCR检测HIF-1α、VEGF和PEDFmRNA的表达及Western印迹分析检测HIF-1α、VEGF和PEDF蛋白水平。结果HIF-1αmRNA的两种shRNA均能有效地抑制RPE细胞在缺氧条件下HIF-1α的表达，同时也有效地抑制VEGFmRNA和蛋白表达，并促进PEDF蛋白表达，但对PEDFmRNA的表达无影响。结论HIF-1αmRNA的shRNA能有效地使缺氧条件下RPE细胞HIF-1α基因沉默，进而有效地抑制缺氧对VEGF的上调作用，同时也促进PEDF表达。揭示了HIF-1与缺氧条件下PEDF翻译后的下调机制有关，是促进视网膜新生血管形成最为关键的细胞因子之一。     

缺氧诱导因子1α在碱烧伤后兔角膜新生血管形成中的作用

目的 观察碱烧伤后兔角膜新生血管形成的不同时期缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在角膜内的表达,探讨HIF-1α对角膜新生血管形成的影响.方法 实验研究.取30只健康家兔,采用随机数字表法分成5组,每组各6只兔,右眼采用1 mol/L氢氧化钠溶液建立角膜碱烧伤模型,左眼作为自身对照.分别于碱烧伤前和碱烧伤后1、3、5、7、14 d,在裂隙灯显微镜下观察家兔角膜新生血管增生情况,HE染色观察角膜组织病理学特征,并采用免疫组织化学法检验角膜组织中HIF-1α的表达,计算炎性细胞（多形核白细胞和淋巴细胞）和HIF-1α阳性细胞核数,对其结果行单因素方差分析及相关分析.结果 角膜碱烧伤后,HIF-1α主要表达在角膜基质中的炎性细胞、血管内皮细胞的细胞核中.随着时间的增加,炎性细胞表达增强,HIF-1α表达量也相应增加,并于碱烧伤后5 d达到高峰,以后逐渐减少.碱烧伤后1、3、5、7、14 d,角膜组织中炎性细胞和HIF-1α表达水平的差异均有统计学意义（F=422.086,437.555;P均＜0.05）,且HIF-1α的表达与新生血管的形成在时空上一致.经相关分析,角膜中炎性细胞和HIF-1α阳性细胞表达呈正相关（r=0.860,P＜0.05）.结论 碱烧伤后炎症反应能诱导HIF-1α的表达,而HIF-1α能促进角膜新生血管的形成.     

HIF-1与VEGF在翼状胬肉中的表达及意义

目的研究缺氧诱导因子-1（HIF-1）与血管内皮生长因子（VEGF）在翼状胬肉组织中的表达及其相关性。方法采用免疫组织化学法研究HIF-1与VEGF分别在32例翼状胬肉与11例人正常球结膜组织中的表达。结果32例翼状胬肉中HIF-1的阳性表达率为62.5%（20/32）,VEGF的阳性表达率为84.8%（27/32）,11例正常结膜组织中HIF-1的阳性表达率为9.1%（1/11）,VEGF的阳性表达率为18.2%（2/11）,正常球结膜与翼状胬肉组织中HIF-1与VEGF的表达差异有统计学意义,且翼状胬肉中HIF-1与VEGF的表达呈正相关（P〈0.05）。结论HIF-1及VEGF在翼状胬肉中高表达,提示其可能参与了翼状胬肉的发生和发展。HIF-1与VEGF在翼状胬肉中的表达呈正相关,提示在翼状胬肉中HIF-1可能参与了对VEGF的调控。     

Racl和HIF-1在激光诱导小鼠脉络膜新生血管模型组织中的表达

目的研究Racl和缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF—1α）在激光诱导实验性小鼠脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）模型组织中的表达及意义。方法用532nm激光诱导小鼠CNV模型，分别在光凝后1d、3d、7d、14d、28d行荧光素眼底血管造影后处死小鼠，摘除眼球制作标本，行病理切片观察及免疫组织化学检测Racl和HIF—1α蛋白在CNV组织中的表达。结果正常小鼠视网膜脉络膜组织未见Racl和HIF—1α蛋白阳性表达。激光诱导的小鼠CNV组织形成过程中均有Racl和HIF—1α蛋白的表达，激光光凝早期二者表达均增高；光凝后1d即有明显的阳性表达，二者的阳性表达率分别是11．21％和24．80％；光凝后3～7d均达到高峰，RacI蛋白的阳性表达率分别为34．58％和53．35％，而HIF-1α蛋白的阳性率为33．05％和50．35％；光凝后14d，二者的表达均下降，阳性率分别为25．50％和31．97％；光凝后28d，阳性率分别为9．32％和11．26％；二者表达呈显著正相关（r=0．943，P=0．016）。结论Racl和HIF—1α在CNV组织中存在高表达，且二者表达密切相关。     

角膜碱烧伤后VEGF的表达与新生血管的关系

目的研究碱烧伤后角膜血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）的表达与角膜新生血管化的关系。方法30只Sprague-Dawleg（SD）大鼠碱烧伤，诱导角膜新生血管模型。碱烧伤后不同时间形态学分析来评价角膜新生血管的情况，免疫组化及Westem blot评价角膜VEGF的表达。结果角膜碱烧伤后24hVEGF的表达开始增高，伤后4d达高峰，伤后7d VEGF的表达下降，14d后显著下降。碱烧伤后，角膜新生血管与VEGF的表达呈明显的平行关系。结论碱烧伤后大鼠角膜VEGF的表达水平与新生血管的形成有相关性，并在其中发挥重要作用。     

慢病毒介导sFlt-1基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的研究可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）对小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法将54只C57/6J小鼠随机分为3组,每组18只。将其中2组小鼠于生后第7天开始置于体积分数75%氧环境中,5d后返回正常空气环境中以建立氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型,于17d时玻璃体腔内分别注射1μLlenti-GFP和携带sFlt-1基因片段的重组慢病毒,设为模型对照组和lenti.sFlt-1组,18只正常空气环境中生长的小鼠玻璃体腔内注射1μL磷酸盐缓冲液,设为正常对照组。通过小鼠眼球连续切片苏木精-伊红染色和心脏荧光素灌注视网膜铺片法观察小鼠视网膜新生血管的变化情况,采用免疫组织化学染色法检测视网膜血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF受体-2（KDR/Flk-1）的表达变化。结果经RT-PCR扩增的靶基因片段序列与GenBank中的标准序列相吻合。感染后的人RPE细胞能够表达sFlt-1蛋白。正常对照组小鼠视网膜内界膜平整,模型对照组小鼠突破内界膜血管内皮细胞核的数目为（47.26±6.76）,而lenti.sFlt-1组为（5.21±1.93）个,差异有统计学意义（P〈0.05）。视网膜铺片可见新生血管荧光素渗漏表现。慢病毒携带的sFlt-1基因片段转移至模型小鼠视网膜后,发现突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数较模型对照组显著减少,并且视网膜毛细血管扩张、微血管瘤样改变、新生血管等荧光素渗漏表现亦明显减少;同时lenti.sFlt-1组VEGF的表达与模型对照组相比在视网膜神经节细胞层和内核层仍呈现强阳性染色,无明显变化,而KDR/Flk-1的阳性染色显著减少。结论慢病毒介导sFlt-1基因转移能显著抑制小鼠视网膜新生血管的发生。     

缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子干扰性RNA抑制鼠视网膜新生血管的研究

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)小片段干扰性RNA(siRNA)对小鼠视网膜新生血管的抑制作用.方法 本研究采用随机对照方法.构建HIF-1αsiRNA重组质粒.C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pEGFP-N1,1 d后视网膜铺片观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达.选7天龄C57BL/6J小鼠90只,17只为正常组,73只建立氧诱导的视网膜新生血管模型,分为模型对照组、空载体组和基因治疗组(HIF-1α siRNA组、VEGF siRNA组及共转染组).于出氧舱前1 d,向空载体组小鼠玻璃体腔注射空载体质粒;HIF-1α siRNA组注射HIF-1α siRNA,VEGF siRNA组注射VEGF165 siRNA,共转染组注射HIF-1αsiRNA+VEGF165 siRNA.采用荧光造影视网膜铺片方法观察血管形态变化;制作组织切片计算突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用逆转录聚合酶链反应和Western blot检测视网膜HIF-1α和VEGF的表达.采用单因素方差分析和组间最小显著差法进行统计学分析.结果 pEGFP-N1经脂质体LF2000介导转染视网膜细胞后1 d即可见GFP表达.基因治疗组较模型对照组新生血管丛明显减少,荧光渗漏明显减轻,其中共转染组效果最明显.基因治疗组[HIF-1α siRNA组为(27.73±2.33)个,VEGF siRNA组为(15.43±3.23)个,共转染组为(8.70 ±2.88)个]较其他3组突破视网膜内界膜的细胞核数量减少,差异均具有统计学意义(F=3016.527,P＜0.01).视网膜HIF-1α mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.08±0.06,0.383±0.009)和空载体组(1.09±0.05,0.386 ±0.010)较正常组(0.81 ±0.07,0.035±0.003)上调,而HIF-1α siRNA组(0.46±0.06,0.182±0.008)较模型对照组下调,抑制效率分别为57.4%和52.5%,差异均有统计学意义(F=139.804,2686.001;P＜0.01).VEGF mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.53 ±0.07,0.340±0.004)和空载体组(1.59±0.06,0.337±0.009)较正常组(0.27±0.08,0,051±0.008)明显上调,而基因治疗组较模型对照组明显下调,差异均有统计学意义(F=421.423,2513.583;P＜0.01),其中共转染组下调最明显,抑制效率分别为85.6%和80.9%.结论 HIF-1α siRNA和VEGF165siRNA均可有效抑制小鼠视网膜新生血管形成,两种siRNA共转染抑制效果最明显.     

HIF-1α特异性双链RNA抑制鼠视网膜新生血管的剂量-效应关系

背景 脂质体介导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)特异性双链RNA(dsRNA)能够有效抑制鼠视网膜新生血管,抑制效率与其剂量比相关. 目的 探讨HIF-1αdsRNA抑制鼠视网膜新生血管的剂量-效应关系.方法 采用Smith的方法,将出生后7d的C57BL/6J小鼠置于氧舱内,控制氧体积分数为(75±3)％,5d后正常氧环境喂养7d后处死;采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态,鉴定视网膜新生血管模型.将出生后7d的8只小鼠于空气中喂养,为正常组.另51只8日龄小鼠放入(75±3)％的高氧环境中,5d后出舱并随机分为对照组(3只)、空载体组(3只)和基因治疗组,基因治疗组按照剂量比例(脂质体:质粒)亚分为9个组,每组5只.出舱当天空载体组小鼠玻璃体腔内注射空载体pSilencer2.1-U6 hygro,基因治疗组按照不同剂量比例注射HIF-1α dsRNA表达质粒pSilencer2.1-U6hygro,均采用脂质体介导.对照组小鼠不作任何处理.注射后7d采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态变化,采用病理切片统计突破内界膜的血管内皮细胞细胞核数,采用免疫组织化学法检测视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)的表达差异. 结果 视网膜铺片荧光造影发现,正常组视网膜血管分布呈规则均匀的网状结构.对照组和空载体组视网膜血管不规则扩张,中周边部有大量血管新生.基因治疗组中央区视网膜血管迂曲及不规则扩张较对照组和空载体组明显减轻,其中脂质体∶质粒为1∶1组更为明显.病理切片显示,正常组很少见到突破视网膜内界膜的内皮细胞细胞核,而对照组和空载体组中均大量出现,其发生率为100％.各基因治疗组均较对照组的(11.57±5.85)个和空载体组的(11.53±6.15)个明显减少,其中脂质体∶质粒为1∶1组突破视网膜内界膜的内皮细胞细胞核数最少,为(2.17±4.23)个,各治疗组间的差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学染色显示,正常组视网膜中VEGF呈弱阳性表达;对照组和空载体组视网膜中VEGF呈阳性表达.各基因治疗组与对照组和空载体组相比较,VEGF的表达明显减少.结论 采用脂质体介导,玻璃体腔显微注射HIF-1α特异性dsRNA表达质粒pSilencer2.1-U6 hygro能有效抑制小鼠缺血性视网膜病变模型新生血管的形成,其中脂质体∶质粒为1∶1时抑制效率最高.     

重组人内皮抑素抑制角膜新生血管的实验研究

目的研究重组人内皮抑素（rHES）对碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管（CNV）的抑制效应。方法60只Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、阳性对照组、rHES组3组,每组各20只。阳性对照组右眼角膜碱烧伤后不治疗;rHES组右眼角膜碱烧伤后立即100mg／mL rHES点眼,每日3次;20只正常鼠不做任何干预处理作为正常组。观察碱烧伤后1、4、7、10、14d各组角膜情况及CNV的生长面积。碱烧伤后第16天处死动物,取角膜行组织病理学检查。免疫组织化学、PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）蛋白量和mRNA在角膜组织的表达,透射电镜下检查碱烧伤后角膜组织的超微结构变化。结果rHES组角膜在碱烧伤后各时间点新生血管面积均小于阳性对照组（t4d=3．294,P=0．040;t7d=5．391,P=0．000;t10d=6．560,P=0．000;t14d=10．346,P=0．000）。角膜碱烧伤后第16天各组VEGF蛋白表达量的差异有统计学意义（F=337．62,P=0．00）,各组VEGF mRNA表达量的差异有统计学意义（F=114．43,P=0．00）。透射电镜检查显示正常组结构正常,rHES组较阳性对照组角膜结构变化小。PCR结果发现rHES组VEGF mRNA的相对表达量低于阳性对照组,但高于正常组。结论rHES用于眼表可有效抑制碱烧伤诱导的CNV。     

ADP-核糖基化因子抑制剂在实验性碱烧伤诱导角膜新生血管中的作用及其机制

背景角膜新生血管（CNV）是导致角膜盲的主要原因之一,研究表明,ADP一核糖基化因子（ARF）对肿瘤细胞的增生有调节作用,抑制ARF能抑制血管的形成,但ARF抑制剂对CNV是否发挥作用尚不清楚。目的探讨ARF抑制剂在碱烧伤诱导的CNV形成过程中的作用及其机制。方法7～8周龄清洁级雄性BABL／c小鼠60只按照随机数字表法分为PBS对照组和ARF抑制剂干预组,每组各30只。所有小鼠采用角膜碱烧伤诱导法构建CNV模型,ARF抑制剂干预组小鼠于造模后1周腹腔内注射0．5g／LARF抑制剂溶液0．5ml,每周3次,共1周,PBS对照组小鼠以同样方式注射0．5mlPBS。各组分别取24只小鼠,于造模后0、4、7、14d采用实时定量PCR（real—timePCR）和Westernblot法检测小鼠角膜组织中ARFmRNA和蛋白的动态表达,并于造模后14d,采用Westernblot法检测各组小鼠角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达。各组另取6只小鼠,于造模后2、4、7、14d裂隙灯显微镜下观察CNV形成情况,并于造模后14d,采用全视网膜铺片免疫荧光组织化学法检测角膜组织中CD31在CNV中的表达。体外实验中应用ARF抑制剂干预人视网膜血管内皮细胞（RECs）,CCK8法和细胞划痕法检测ARF对人RECs增生和迁移的影响。实验动物的使用和喂养遵循视觉及眼科学研究协会有关规定及苏州大学《实验动物管理及使用指南》。结果造模后PBS对照组和ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织中ARFmRNA在各个时间点均有表达,在造模后14d达高峰,各组小鼠角膜中ARFmRNA的表达随着时间的延长而增加,差异有统计学意义（F时间=65．17,P=0．00）,不同时间点的组间比较差异无统计学意义（F＊＊=1．98,P=0．18）;造模后14d,ARF抑制剂干预组实验后不同时间点ARF蛋白水平相对表达值比较差异有统计学意义（F=10．77,P=0．00）。裂隙灯显微镜下检查发现,ARF抑制剂干预组CNV相对面积为0．45±0．05,PBS对照组为0．72±0．11,2个组间差异有统计学意义（t=-3．87,P〈0．05）。全角膜铺片免疫荧光组织化学法检测表明,ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织CD31表达面积明显小于PBS对照组。造模后14d,Westernblot法检测显示,ARF抑制剂干预组VEGF蛋白表达水平为1．20＋0．21,明显低于PBS对照组的2．47±0．33,差异有统计学意义（t=-5．62,P〈0．05）。CCK8法检测结果显示,随着ARF抑制剂质量浓度的增加,ARF抑制剂对人RECs的抑制率增加,差异有统计学意义（F=8．47,P=0．02）。细胞划痕实验后24h,100μg／L和1000μg／LARF抑制剂干预组人RECs迁移距离分别为（5．46±1．32）μm和（5．04±1．68）μm,与PBS对照组的（8．49±1．18）μm相比明显减小,差异均有统计学意义（t=-2．94、-2．91,P〈0．05）。结论ARF抑制剂能抑制碱烧伤诱导的CNV发生,可能与其下调VEGF的表达以及抑制血管内皮细胞的增生和迁移有关。     

Inhibition of proliferation,migration and tube formation of choroidal microvascular endothelial cells by targeting HIF-1α with short hairpin RNA-expressing plasmid DNA in human RPE cells in a coculture system

BACKGROUND: Retinal pigment epithelial (RPE) cells and choroidal microvascular endothelial cells (CECs) are the main cells involved in choroidal neovascularization (CNV), and hypoxia plays an important role in CNV formation via hypoxia inducible factor 1 (HIF-1). Our aim was to evaluate the role of HIF-1 in human RPE cells with regard to proliferation, migration and tube formation of CECs under hypoxia. METHODS: RPE cells were cultured under chemical hypoxia induced by 200 muM CoCl(2), and RNA interference (RNAi) technique was used to knock down HIF-1alpha gene in RPE cells. mRNA and protein expression of HIF-1alpha and VEGF in RPE cells were investigated by real-time RT-PCR and Western blot. Three kinds of coculture models were used to observe the effects of RPE cells transfected by short hairpin RNA (shRNA)-expressing plasmid DNA (pDNA) (pshHIF-1alpha) on the proliferation, migration and tube formation of CECs respectively. RESULTS: Transfection of shRNA-expressing pDNA targeting HIF-1alpha to RPE cells resulted in the knock down of HIF-1alpha gene and reduction of the corresponding mRNA and protein of HIF-1alpha and VEGF under hypoxia. Consequently, the proliferation, migration and tube formation of CECs were significantly inhibited by the knocked-down RPE cells compared with the control in the coculture system. The proliferation rates of CECs decreased by 40.2%, 36.6% and 36.8% on days 3, 4 and 5 respectively. Migration reduced by 49.6% at 5 h, and tube formation decreased by 40.4% at 48 h. CONCLUSION: RNAi of HIF-1alpha in RPE cells can inhibit angiogenesis in vitro and provide a possible strategy for treatment of choroidal neovascularization diseases by targeting HIF-1alpha.     

辐射及环孢素对高危角膜移植术后角膜血管内皮生长因子表达的抑制作用

目的探讨电离辐射对高危角膜移植术后血管内皮生长因子（VEGF）表达及角膜新生血管（CNV）形成的抑制作用。方法用角膜缘缝线法刺激CNV,将15只SD大鼠的角膜作为供体、30只Wistar大鼠的右眼作为受体行穿透角膜移植术。将受体大鼠随机分为3组,每组10只眼。A组为辐射组,术后第1天β射线7Gy照射右眼,每日1次,共7次;B组为质量分数1%环孢素A（CsA）组,术后第1天起点用1%CsA滴眼液,每日3次,共7d;C组为单纯移植组。每日裂隙灯下观察角膜植片的临床反应。分别于干预后7d、14d摘除鼠眼获得角膜标本,采用免疫组织化学法检测VEGF蛋白在角膜中的阳性表达情况,Westernblot方法半定量观察VEGF蛋白在角膜中的表达,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测VEGFmRNA在各组角膜组织中的表达。结果裂隙灯下可见角膜移植后14d,与C组比较,A组和B组角膜植片水肿较轻,CNV较少。免疫组织化学检测表明A组和B组VEGF在角膜组织中的表达呈淡黄色,C组呈棕色。RT-PCR检测显示,VEGFmRNA的反应条带在C组最强、A组最弱,Westernblot检测的结果与RT-PCR相同。结论 90Sr-90Y眼科敷贴器小剂量分次放射治疗及1%CsA滴眼液局部应用可明显抑制高危角膜移植术后新生血管的生长,90Sr-90Y眼科敷贴器辐射作用强于1%CsA滴眼液。     

苏拉明对角膜碱烧伤新生血管抑制作用的研究

目的研究苏拉明对碱烧伤角膜新生血管（CNV）及血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子-I（IGF—I）的影响。方法新西兰大白兔48只,分为空白组、对照组、苏拉明组3组,每组16只（32只眼）。对照组与治疗组制备角膜碱烧伤模型,术后分别给予氯霉素、8g／L苏拉明滴眼液点眼。分别于术后第1、4、7、14d观察新生血管情况,免疫组织化学法检测VEGF、IGF—I的表达。结果术后第1d各组无新生血管生长。第4、7、14d,空白组未出现新生血管,对照组与治疗组可见CNV,且治疗组比对照组新生血管面积小（P〈0．01）。第1、4、7d,对照组与治疗组VEGF、IGF—I的表达均比空白组升高,差异有统计学意义（P〈0．01）,治疗组与对照组相比,差异亦有统计学意义（P〈0．01）。第14d,3个组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论VEGF、IGF—I参与CNV形成,苏拉明通过降低角膜上皮中二者的表达,抑制角膜碱烧伤新生血管形成。