藻酸盐凝胶三维培养条件下牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠对兔关节软骨细胞表型的影响

目的 探讨牛胰岛素一转铁蛋白-硒钠(ITS)对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞表型的影响. 方法 分离培养兔关节软骨细胞,将单层培养的P2代细胞接种于藻酸盐凝胶中,分别在DMEM培养液中加入10%胎牛血清(FBS).0.2%FBS+1%ITS、1%ITS即设为FBS组、ITS/FBS组,ITS组行DNA、蛋白聚糖(GAG)含量测定及组织化学检测. 结果 软骨细胞在藻酸盐凝胶中始终保持球形样外观,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性.3组GAG合成无显著性差异(P＞0.05).培养的第6天ITS组DNA含量低于FBS组(P＜0.05),第12天低于ITS/FBS组和FBS组(P＜0.05). 结论 ITS可促进藻酸盐凝胶中软骨细胞的增殖,并保持其表型.     

人脐带源间充质干细胞体外成脂、成骨、成软骨诱导分化

目的体外分离培养脐带来源间充质干细胞,确定其向脂肪、骨、软骨细胞的分化能力。方法取新鲜的脐带组织,剔除脐动静脉,剩余部分剪成极为细小的组织块,02%Ⅱ型胶原酶37℃静止消化17 h,用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基/Ham′s F12培养基终止消化,培养3~5 d后得到较为均一的贴壁细胞。取第3代细胞做流式检测,并定向诱导分化,14 d后成脂、成骨染色鉴定,21 d后取诱导分化的细胞团做冰冻切片,阿尔法蓝染色软骨鉴定。结果体外培养的间充质干细胞高表达CD29、CD13、CD90、CD105、CD44等间充质细胞标志物,不表达CD34、CD45、人类白细胞抗原DR等造血细胞标志物;诱导分化后油红O染色、冯库萨染色均为阳性,冰冻切片阿尔法蓝染色呈明显阳性。结论人脐带间充质干细胞在体外能够培养并定向分化为脂肪、骨、软骨细胞。     

人羊膜间充质干细胞膜片的构建及其成软骨诱导的实验研究

目的:探讨应用一种简单的方法构建人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,HAMSCs)膜片,并研究其向成软骨细胞分化的潜能,探索利用HAMSCs膜片构建组织工程软骨的可行性。方法:取产妇胎盘通过酶消化法获得HAMSCs,通过流式细胞术鉴定其表型特征;通过免疫荧光检测细胞波形蛋白和CK-19的表达。取第3代HAMSCs通过CCK-8检测细胞增殖活性;取第3代HAMSCs加入成膜片培养基培养以构建HAMSCs膜片;取第3代HAMSCs加入成膜片培养基培养7天,再换用成软骨诱导培养基培养以构建成软骨诱导的HAMSCs膜片。通过流式细胞术检测成膜片诱导后HAMSCs表型分子的表达;扫描电镜(SEM)观察细胞形态和细胞外基质的分泌。RT-PCR定量分析成软骨分化相关基因(SOX9、ACAN、COLⅡ)的表达;HE染色观察细胞形态、分布;甲苯胺蓝和番红染色检测蛋白聚糖的分泌,Ⅱ型胶原免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达。结果:流式细胞术结果表明HAMSCs表达间充质干细胞(MSCs)表型。免疫荧光检测结果示:波形蛋白阳性表达,CK-19阴性表达。CCK-8检测结果示:细胞生长曲线呈S型,第3天进入对数生长期,第7天达到顶峰。HAMSCs成膜片诱导后流式结果表明干细胞特性分子CD44、CD73、CD90、CD105仍高表达。SEM结果示:HAMSCs膜片呈复层结构,梭形的细胞分泌大量细胞外基质,细胞被细胞外基质所包埋并逐渐融合。RT-PCR结果显示:与HAMSCs膜片组相比,成软骨诱导的膜片组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA的表达量显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果示:成软骨诱导的HAMSCs膜片可见分布均匀的类圆形细胞并被大量细胞外基质包围;甲苯胺蓝染色结果显示:椭圆形细胞分泌大量细胞胞外基质,成铺路石样排列;番红染色结果示:成软骨诱导的膜片有大量蛋白聚糖分泌;Ⅱ型胶原免疫组化结果示:成软骨诱导的膜片高表达Ⅱ型胶原。结论:本实验应用一种简单的方法在普通培养皿上成功构建了HAMSCs膜片,体外研究证实HAMSCs膜片具有良好的成软骨分化潜能。因此,HAMSCs膜片可以作为软骨组织工程的种子细胞之一,HAMSCs膜片的应用将为软骨缺损修复提供一种新思路。     

成肌干细胞在透明质酸凝胶载体中诱导分化为软骨细胞的研究

目的 探讨以透明质酸钠凝胶作为组织工程软骨载体、以成肌干细胞作为种子细胞诱导分化形成软骨细胞的可行性. 方法体外分离培养兔成肌干细胞,采用结蛋白(Desmin)细胞化学染色进行鉴定,并观察兔成肌干细胞在不同浓度透明质酸钠凝胶中的生长状态.在5%透明质酸钠凝胶中以骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导兔成肌干细胞,倒置相差显微镜观察细胞生长情况,并通过甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学及RT-PCR技术对诱导后的细胞进行鉴定. 结果原代培养兔成肌干细胞Desmin细胞化学染色呈阳性表达,且在不同浓度透明质酸钠凝胶中均生长良好.BMP-2诱导培养1d后,成肌干细胞即开始于透明质酸钠凝胶中伸展生长,诱导培养10d后,细胞形态由梭形向多边多角形转化,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫荧光检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和聚焦蛋白聚糖mRNA呈阳性表达. 结论兔成肌干细胞可在适当浓度BMP-2诱导下分化为软骨样细胞,透明质酸钠凝胶可作为软骨组织工程的良好载体.     

不同细胞移植修复兔全层关节软骨缺损的比较研究

目的 :比较软骨细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞对全层关节软骨缺损的修复作用。材料和方法 :取幼兔的软骨细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞 ,共 3种有生成软骨潜力的细胞进行体外分离培养 ;以聚乳酸 (PLA)为载体 ,将培养的原代细胞植入PLA支架上 ,形成细胞 -PLA复合物。于 2 8只成年新西兰大白兔的股骨滑车关节面上造成直径 4 5mm、深 3 0mm的全层关节软骨缺损 ,将 3种细胞 -PLA复合物分别植入关节软骨缺损处。植入细胞 -PLA复合物为实验组 ,单纯植入PLA支架为对照组。术后 6周、12周观察缺损修复情况及新生组织类型。结果 :软骨细胞移植组为软骨样组织修复 ,分界明显 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阳性 ;软骨下骨部分重建 ;细胞排列紊乱。骨髓基质细胞移植组为软骨样组织修复 ,分界不明显 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阳性 ;软骨下骨重建良好 ,软骨下潮线恢复 ;细胞排列趋于正常。成纤维细胞移植组为纤维组织修复 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阴性 ;软骨下潮线消失。对照组为纤维组织修复。结论 :软骨细胞、骨髓基质细胞移植修复软骨缺损明显优于成纤维细胞及对照组。骨髓基质细胞与软骨细胞移植组的修复结果无统计学差异 ,但骨髓基质细胞修复组织的细胞排列有序 ,软骨下骨重建良好 ,与周围组织融合密切 ,更接近正?     

低浓度人血清对兔关节软骨细胞培养的影响

关于软骨细胞的体外培养旨在为创伤性骨关节病的临床治疗提供有效的方法,本文实验结果表明:用5-10%的低浓度人血清较之10%小牛血清对体外培养的关节软骨细胞有明显的促细胞生成作用,但在保持软骨细胞合成硫酸软骨素蛋白的生物特性方面,人血清明显不如小牛血清。     

脐血间充质干细胞无血清培养的实验研究

目的建立一种体外无血清培养扩增脐血间充质干细胞(MSC)的方法。方法从脐血中分离制备单个核细胞悬液,分别接种于有血清培养基及自制的无血清培养基中,比较两种培养条件下细胞生长情况,并进行瑞氏、过碘酸雪夫(PAS)、非特异性酯酶(NAE)和碱性磷酸酶(ALP)染色观察,流式细胞仪分析两种培养条件下MSC表面CD分子表达情况及细胞周期。结果有血清培养第3天出现较多贴壁细胞,8天有细胞丛生长,12～18天细胞融合成片,呈典型的成纤维细胞样外观。无血清培养第5天出现较多贴壁细胞,8天有细胞丛生长,14～20天细胞融合成片。单层融合的脐血MSC消化传代培养1周左右达融合,可继续传代扩增。最终有血清培养获得(3.45±0.28)×108个细胞,无血清培养获得(2.97±0.26)×108个细胞,两者比较差异显著(P<0.05)。无血清与有血清培养21天,贴壁细胞PAS和ALP染色阳性,以成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞为主。流式细胞仪检测显示,两种培养条件下扩增后的脐血MSC均不表达CD34、CD13和CD45,而强表达CD166、CD29、CD105,较强表达CD54;无血清培养组G0/G1期细胞比例明显高于有血清培养组(P<0.05)。结论利用自行研制的无血清培养基添加一些辅助因子能较好地培养扩增间充质干细胞。     

脐带全层源间充质干细胞分离培养及向成软骨细胞分化的实验研究

目的从人脐带全层中分离培养间充质干细胞(MSCs),并进行成软骨诱导分化,为组织工程软骨和软骨损伤后修复提供种子细胞。方法采用胶原酶消化法从脐带全层中分离培养间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态,细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞表型,采用微团细胞培养在软骨诱导液中向软骨细胞分化,阿尔辛蓝及甲苯胺蓝染色检测细胞分化情况,RT-PCR法检测诱导后细胞表达聚集蛋白聚糖(ACAN)基因情况。结果人脐带全层来源的MSCs呈成纤维样形态漩涡状贴壁生长,细胞高表达HLA-I类分子、CD73、CD90、CD166及CD105,不表达CD34、CD45、CD14、CD31、CD80、CD86及HLA-DR。细胞诱导分化21d后,阿尔辛兰及甲苯胺蓝染色阳性;RT-PCR检测诱导后的细胞表达ACAN,而对照组无表达。结论人脐带全层为成体MSCs提供一种新而方便的来源,人脐带间充质干细胞(hucMSCs)体外培养能够向软骨细胞分化。     

酶预消化组织块贴壁法培养人退变椎间盘髓核细胞

目的 采用胶原酶预消化组织块贴壁法培养人退变椎间盘髓核细胞,与单纯Ⅱ型胶原酶消化法比较培养效果.方法 收集腰椎间盘退变患者的髓核组织分为A、B两组进行培养.A组:体积分数0.025％Ⅱ型胶原酶预消化30 min后组织块接种;B组:体积分数0.025％Ⅱ型胶原酶消化5h后过滤、离心、接种培养.比较两种方法培养成功率和原代细胞融合时间.HE、甲苯胺蓝、免疫细胞荧光染色法观察细胞形态及Sox-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达.结果 A、B两组培养成功率差异无统计学意义(P＞0.05),融合时间A组显著短于B组(P＜0.01).A组培养的髓核细胞可被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫细胞荧光检测Sox-9、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖呈阳性表达.结论 与单纯Ⅱ形胶原酶消化法比较,Ⅱ型胶原酶预消化后贴壁培养法培养人退变椎间盘髓核细胞成功率高,短时间内可获大量细胞,且强表达Sox-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖.     

抗肿瘤干细胞药物体外活性评价方法

目的以乳腺癌MCF-7细胞和盐霉素钠为例,建立体外抗癌干细胞药物活性评价的简单方法。方法无血清、含有生长因子的DMEM/F12培养基培养MCF-7细胞,观察细胞的生长及体外干细胞球形成能力;流式细胞仪检测CD44+/CD24-细胞含量;将无血清培养的、富集的MCF-7干细胞以不同的数量接种到Nu/Nu裸鼠皮下,观察并检验致瘤能力;CCK-8法检测药物对悬浮乳状球样细胞生长的作用。结果用无血清、含有生长因子的DMEM/F12培养基培养的MCF-7细胞,增殖缓慢,呈悬浮乳状球样;流式细胞仪检测CD44+/CD24-细胞含量,10%胎牛血清的RPMI1640培养的MCF-7干细胞为(12.8±0.6)%,无血清培养的MCF-7干细胞为(97.1±2.4)%;裸鼠接种无血清培养的、富集的MCF-7干细胞约100个细胞即可见肿瘤生成。盐霉素钠对无血清培养条件下的富含癌干细胞的MCF-7细胞有较高的毒性。结论所获得的CD44+/CD24-细胞具有乳腺癌干细胞特性,且超低黏附培养板和无血清环境可以促进悬浮球状细胞团的形成,CCK-8法是一种简便的体外评价抗癌干细胞药物的检测方法。     

血管平滑肌细胞对血啉甲醚吸收特性的研究

目的 探讨血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）对光敏剂血啉甲醚（ＨＭＭＥ）的吸收特点及影响因素,为进一步建立动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的光动力治疗方法提供实验依据。方法 培养兔主动脉ＳＭＣ并接种至９６孔培养板。首先,培养液中分别加入ＨＭＭＥ和血卟啉衍生物（ＨＰＤ）,浓度分别为２０、４０、６０、８０、１００μｇ／ｍｌ,采用荧光分析法测定细胞内光敏剂含量,绘缺点ＳＭＣ吸收光敏剂的浓度－含量和时间－含量关系曲     

转录因子KLF4在内皮祖细胞分化过程中的表达及意义

目的探讨转录因子KLF4在内皮祖细胞分化过程中的表达及意义。方法以Ficoll密度梯度离心法从SD大鼠骨髓分离单个核细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,以DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色和FITC标记的CD133、CD34进行鉴定。细胞免疫化学法检测原代培养7d内皮祖细胞KLF4的表达,RT-PCR法检测原代培养5、10、15d后细胞内KLF4及一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达。结果经DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色鉴定证实获得的细胞为内皮祖细胞。细胞免疫化学检测发现KLF4表达于细胞核内;RT-PCR检测结果显示,5、10、15d大鼠内皮祖细胞的KLF4mRNA表达(分别为0.830±0.017,0.980±0.014,1.090±0.014)逐渐增强(P<0.01),eNOSmRNA表达(分别为0.310±0.008,0.500±0.011,0.650±0.010)也逐渐增强(P<0.01)。结论在内皮祖细胞分化为内皮细胞的过程中,KLF4的表达逐渐增强,并与成熟内皮功能相关。     

不同消化方式对脐带华通胶间充质干细胞提取的影响

目的探讨使用不同酶浓度、消化不同时间及不同浓度胎牛血清的培养基稀释对消化脐带华通胶后提取培养间充质干细胞的影响。方法无菌条件下取出正常剖腹产胎儿脐带,剔除动脉、静脉及外膜,取其之间的胶状物,剪成1 mm3及更小的块状,分别加入0.1%和0.2%的Ⅱ型胶原酶,分为A、B两组,37℃水浴消化。每一组消化时间分别为4、81、2、16、202、4、28、323、6、40 h共10个消化时间点,每一个消化时间点又分为两组,分别为A1、A2组和B1、B2组。消化后的黏稠细胞悬液用完全DMEM稀释,并加入特级胎牛血清至浓度为10%(A1、B1)和20%(A2、B2),充分混匀。悬液移至75 cm2培养瓶,15 ml/瓶,37℃、5%CO2、饱和湿度培养,3 d换液。通过细胞计数观察原代细胞贴壁生长的最早时间和80%细胞铺满瓶底的时间和生长活力。结果 0.2%的Ⅱ型胶原酶消化脐带华通胶在消化时间为20h,且稀释血清浓度为20%时,获得的细胞悬液在培养36 h即有细胞贴壁,培养6 d细胞贴壁达到80%,其余各组细胞生长情况各不相等,均弱于此组。其中消化时间在8 h以内和32 h以上时不论使用多少的酶浓度和稀释时使用多少的血清浓度,细胞均不生长。结论在使用胶原酶消化脐带华通胶提取间充质干细胞的过程中,使用0.2%Ⅱ型胶原酶、消化16～24 h、稀释培养时加入至20%的血清对干细胞的提取效果最佳。     

111In]oxine labelling of polymorphonuclear leucocytes: doubts concerning elution and effects on cell behaviour

Polymorphonuclear leucocytes (PMN) from normal human subjects were labelled with [111In]oxine (20 muCi 10(8) cells). In the presence of 20% autologous serum (AS), dissociation of 111In from the cells resulted in mean losses of radioactivity of 13% at 3 h and 30% at 24 h. Adherence of 111In-labelled PMN to cultured porcine endothelial monolayers was increased by 40.7 +/- 31.6% after 60 min incubation in 20% AS at 37 degrees C when compared with unlabelled cells. Phagocytosis and intracellular killing of Candida albicans were unaltered by labelling. Elution of 111In from labelled PMN together with enhanced adhesiveness may have important implications for the study of PMN kinetics and the investigation of inflammatory disease.     

4种中药对体外培养兔关节软骨细胞代谢的影响

采用家兔关节软骨细胞体外培养的方法，通过同位素示踪探讨当归、丹参、黄芪、川芎嗪４种中药对软骨细胞ＤＮＡ、蛋白多糖以及胶原合成的影响。实验结果显示：１％当归、１％黄芪、１％川芎嗪能促进ＤＮＡ合成，１０％当归无促进作用，１％丹参、１０％丹参，１０％黄芪、１０％川芎嗪则能起抑制作用；１％或１０％当归、黄芪、川芎嗪可促进胶原合成，１０％丹参无影响，１％丹参有抑制作用；１％当归、１０％当归、１％丹参、１０％川芎嗪能促进蛋白多糖的合成，１０％丹参、１％黄芪、１０％黄芪、１％川芎嗪则无影响。本研究证明：当归、黄芪、川芎嗪能显著地促进体外培养的兔关节软骨细胞代谢，有可能促进软骨损伤的修复。这对探讨中药制剂对关节软骨损伤修复的作用机理和寻找有效的治疗药物有一定意义。     

关节软骨细胞体外培养时生物学性状的变化

<正> 在运动医学领域中,由于运动员的关节软骨伤病发生率远高于普通人,同时又缺乏有效的治疗方法,影响训练和运动成绩的提高,因此对关节软骨伤病的研究一直是重点科研项目之一。对关节软骨进行研究的手段近20年来有了巨大进步,其标志是关节软骨细胞在体外分离培养取得成功。它作为探索软骨细胞性状的先进手段正越来越广泛地被应用到关节软骨损伤和疾患的研究工作中。我所1982年在体外分离培养关节软骨细胞获得成功。近年来,对关节软骨细胞在体外培养过程中所     

碱性成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子-1对体外兔关节软骨细胞的生物学效应

目的：了解胰岛素样生长因子－1（IGF－1）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)对兔关节软骨细胞分裂增殖及功能代谢的影响，为组织工程方法修复关节软骨缺损提供实验依据。方法：取生长良好的兔正常关节软骨细胞，在含体积分数为10％新生小牛血清的DMEM条件下体外单层培养，细胞贴壁后随机分组，并分别加入不同浓度的bFGF和（或）IGF－1；培养液不加任何因子为对照组，以四唑盐（MTT）法检测细胞相对数，二苯胺显色法测各瓶细胞DNA含量，咔唑硫酸法测基质中糖醛酸含量，以间接反映蛋白多糖含量。并采用流式细胞技术进行细胞周期亚时相分析。结果：在实验浓度范围内，两种因子均促进细胞增殖，DNA合成及增加胞外基质中葡萄糖醛酸含量，且呈剂量－效应依赖关系。当IGF－1浓度≥10ng/ml,bFGF浓度≥1ng/ml时，其促进效果较显著（P＜0．05，0．01）。bFGF的促细胞增殖作用更为明显，最大为对照组的1．32倍，而IGF－1对细胞外基质葡萄糖醛酸含量的影响更显著，最大为对照组的1．78倍，bFGF能明显缩短DNA合成前期（G1期）和分裂前期及分裂期（G2M期）时间；bFGF IGF-1作用后，同样缩短G1期和G2M期时间，显著缩短G1期时间；而IGF－1仅缩短G2M期时间。结论：在本实验条件下，bFGF及IGF－1均以剂量依赖性方式影响细胞，刺激细胞增殖及功能代谢，两种因子的协同作用仅表现在对细胞的增殖作用上，对细胞功能代谢没有明显影响。两种因子促进细胞增殖是通过缩短细胞周期不同亚时相而实现的。     

不同条件对人游离毛囊培养的影响

目的：研究不同培养基对游离毛囊培养的影响。方法：将美容手术后取下的头皮在无菌条件下分离成游离的毛囊培养于含血清或无血清的DMEM培训基、WilliamsE培养基中,观测毛囊的生长速度及形态学改变。结果：在含血清DMEM培养基中毛囊生长速度较慢,扭曲变形早;而无血清DMEM培养基毛囊的生长天数明显延长,毛囊的层次结构及形态可长时间保不变,但前3天长速度与有血清培养时无明显差异;使用WlliamesE培养基毛囊在前3天生长速度明显加快,结论：含血清的DMEM培养基不利于毛囊的生长,而WilliamsE培养基较适用于游离毛囊的培养。     

Quantitative considerations supporting the irrelevance of circulating serum CEA for the immunoscintigraphic visualization of CEA expressing carcinomas

Starting from the phenomenon that the amount of circulating CEA in patients' sera did not significantly influence immunoscintigraphic visualization of CEA expressing tumors, we built up an in vitro model to explain this phenomenon. Blocking experiments in this model system showed that the CEA specific MAbs BW 431/26 and BW 431/31 could not be inhibited in their binding to cell associated CEA, if they were preincubated with a 20 molar excess of serum CEA. In contrast, the CEA-NCA cross reactive MAbs could be inhibited in their binding to tumor associated CEA under identical conditions. These data combined with western blotting analysis of patients' sera and affinity constant determinations argue that conformational changes in serum CEA cause a decreased affinity of the CEA specific MAbs to serum CEA allowing a preferential binding to tumor associated CEA.Abbreviations used CEA carcinoembryonic antigen - NCA nonspecific cross-reacting antigen - DTPA diethylene triamine pentaacetic acid - FBS fetal bovine serum - EDTA ethylene diamine tetraacetic acid - PCA perchloric acid - R.T. room temperature - PBS phosphate buffered saline - BSA bovine serum albumin - SDS-PAGE sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis