胃癌组织hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态研究

目的 探讨hMSH2基因启动子区的甲基化状态与微卫星DNA不稳的关系。方法 采用甲基化特异性PCR方法检测hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态，采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳。结果 正常胃粘膜未见hMLH1和hMSH2基因启动子区的高甲基化。68例胃癌中检出hMLH1高甲基化11例，占16．2％，而且均为去甲基化和高基化并存，未见有hMSH2高甲基化者。将MSI分为高频率MSI（MSI－H，≥2个位点）8例、低频率MSI（MSI－L,仅为1个位点）9例和MSI阴性（MSS）51例3组，结果MSI－H组hMLH1高甲基化的检出率显著高于MSI－L和MSS组（P＜0．01）。结论 hMLH1高甲基化可能参与了MSI病理途径，而hMSH2甲基化状态可能与MSI途径无关。     

微卫星不稳定性与胃癌的发展

DNA错配修复(MMR)缺陷与许多癌症的发生有关。细胞MMR缺陷会导致广泛的遗传突变及肿瘤的发生和发展。MMR缺陷肿瘤的一项重要诊断学特征为核苷酸重复区域高突变率的累积,这些突变即微卫星不稳定性(MSI)。现就近年来国内、外关于MSI与胃癌发生、发展的研究进展综述如下。     

胃癌细胞系中组蛋白H3-K9甲基化与错配修复基因hMLH1表达及DNA甲基化的关系

目的 探讨胃癌细胞系中组蛋白H3-K9甲基化与DNA甲基化及错配修复基因hMLHI表达的关系.方法 应用去甲基化制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)作用于2个胃癌细胞系,MGC-803和BGC-823.应用染色质免疫沉淀(CHIP)、甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析药物作用前后hMLH1基因启动子区域组蛋白H3-K9甲基化、DNA甲基化和hMLH1基因表达.结果 MGC-803细胞系中,沉默的hMLH1基因启动子区域表现为DNA甲基化和组蛋白H3-K9高甲基化,5-Aza-dC不但能使DNA发生去甲基化,使沉默的hMLH1基因重新表达,而且能降低沉默位点的H3-K9甲基化水平.BC,C-823细胞不表达hMLH1基因,其DNA非甲基化,与MGC-803细胞相比较,其组蛋白H3-K9甲基化水平低.5-Aza-dC对BGC-823细胞中的基因表达、DNA甲基化和H3-K9甲基化没有影响.结论 在胃癌中,hMLH1基因启动子区组蛋白H3-K9的甲基化与DNA甲基化及基因沉默相关,去甲基化制剂可调控DNA甲基化、基因表达和组蛋白1-13-K9甲基化.     

MSI在结直肠癌中的应用研究新进展

微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)是由DNA错配修复(mismatchrepair,MMR)蛋白功能缺失所导致,其分子特征被认为是重要的基因标记物,在结直肠癌的筛查、分类、诊断、治疗和预后的应用中有重要临床意义。就MSI及其与结直肠癌(遗传性和散发性肿瘤)的关系,并着重对应用MMR和MSI检测的分子技术及免疫检查点抑制剂(immune check-point inhibitors,ICPIs)的免疫治疗的新进展进行综述。     

DNA异常甲基化在肿瘤中的作用

DNA甲基化与肿瘤有密切的联系,DNA甲基化状态改变是致癌的一个关键因素,是抑癌基因失活的方式之一。本文对相关基因甲基化与肿瘤发生,肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗的关系进行了阐述。     

果糖和甘露糖代谢在泛癌中的综合多组学分析

目的：探讨果糖和甘露糖代谢基因在各种癌症类型中的变化。方法：利用生物信息学方法分析果糖和甘露糖代谢基因在各种癌症类型中的变化。结果：在部分癌症类型中果糖和甘露糖代谢基因表达上调，这些基因表达的变化源于拷贝数变异和DNA甲基化。进一步的通路分析发现，果糖和甘露糖代谢基因的改变可以影响常见的致癌通路，如细胞凋亡、细胞周期、上皮—间质转化通路等。结论：癌症疾病中存在果糖与甘露糖代谢失调，而这一变化影响到癌症的发生发展。     

粪便p16及FHIT基因甲基化检测在结直肠癌诊断中的价值

目的:探讨粪便中p16及FHIT基因启动子甲基化在结直肠癌诊断中的应用价值。方法:选择我院消化内科2015年1-12月收治的结直肠镜检查证实良性结直肠疾病者50例(A组)、结直肠癌患者50例(B组)、同期健康查体患者100例(C组)为研究对象,采用甲基化特异PCR对上述患者粪便中p16及FHIT基因启动子DNA甲基化进行检测,判断上述标本中各基因启动子的甲基化水平。根据p16及FHIT基因启动子DNA甲基化水平,评价其作为诊断结直肠癌的敏感性和特异性。结果:p16基因启动子DNA甲基化率分别为26%、70%和14%;FHIT基因甲基化率分别为18%、54%和16%。上述基因启动子甲基化率在肠癌组明显高于对照组和良性组,差异均有统计学意义(P<0.05);p16及FHIT诊断肠癌的敏感性分别为0.70和0.54,特异性分别为0.74和0.82。结论:p16及FHIT基因启动子甲基化发生率在肠癌患者粪便中显著增高,可作为肠癌诊断的分子标志物。     

DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的研究进展

DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要方式,可以在不改变DNA序列的情况下调控基因的表达。在结直肠癌的发生发展过程中,DNA异常甲基化发挥着重要作用,而且该异常现象在早期肠癌患者的外周血、粪便等体液中就可检测到。因此,DNA甲基化检测有望成为结直肠癌无创早期诊断的有效手段,对临床肿瘤的防治有着重要意义。     

DNA错配修复系统和微卫星不稳定性与结直肠癌

结直肠癌(CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤之一。其发生发展涉及到一系列遗传学改变。已有大量的研究证实，微卫星不稳定性(MSI)存在于遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)，部分散发性结直肠癌(SCRC)胃癌等当中，MSI是错配修复基因的异常造成的。DNA错配修复基因的突变可以解释90％以上的HNPCC，少部分的HNPCC肿瘤和散发性MSl 的肿瘤可由其他途径所致，比如基因的甲基化。     

粪便中MGMT，p16INK4A及ECAD基因启动子甲基化检测在结直肠癌诊断中的价值

目的：探讨粪便中p16INK4A、ECAD及MGMT基因启动子甲基化在结直肠癌诊断中的应用价值。方法选择我院老年病科2014年2月至2015年11月收治的65岁以上老年健康者50例(对照组)、结直肠镜检查证实良性结直肠疾病者41例(良性肠病组)和结直肠癌患者46例(肠癌组)为研究对象。采用表观遗传学方法应用甲基化特异PCR对上述患者粪便中p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基化进行检测,判断上述标本中各基因启动子的甲基化水平。根据p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基化水平,评价其作为诊断结直肠癌的敏感性和特异性。结果对照组、良性肠病组和肠癌组p16INK4A基因启动子DNA甲基化率分别为14.0%、24.4%和71.7%;MGM基因甲基化率分别为16.0%、14.6%和54.3%;ECAD基因甲基化率分别为12.0%、19.5%和65.2%。上述基因启动子甲基化率在肠癌组明显高于对照组和良性肠病组,差异均有统计学意义(P<0.05);p16INK4A、MGMT和ECAD诊断肠癌的敏感性分别为0.72、0.54和0.65,特异性分别为0.76、0.75和0.80。结论 p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子甲基化发生率在肠癌患者粪便中显著增高,可作为肠癌诊断的分子标志物。     

甲基转移酶1表达质粒对结肠癌细胞错配修复基因甲基化及其表达的影响

目的 分析DNA甲基转移酶1(Dnmt1)基因的真核表达质粒对人结肠癌细胞错配修复基因甲基化及其转录水平和微卫星不稳定性(MSI)的影响。方法 分别构建含有人的正义Dnmt1(HMT)和反义Dnmt1(THM)的真核表达质粒,将其转染入结肠癌SW1116细胞,以Western印迹实验分析各组细胞Dnmt1蛋白的表达情况。定量PCR检测hMLH1、hMSH2基因的表达。甲基化特异性PCR分析hMLH1、hMSH2启动子区甲基化情况,银染法研究其对微卫星不稳定性的影响。结果 转染正义Dnmt1质粒的细胞hMLH1、hMSH2的启动子甲基化水平升高,基因mRNA表达降低。转染反义Dnmt1质粒可使细胞中hMSH2启动子呈非甲基化状态,基因表达增强。未发现转染正义和反义Dnmt1基因的SW1116细胞存在MSI的变化。结论 重组Dnmt1表达质粒可通过调控人结肠癌细胞中错配修复基因的甲基化影响基因的表达。     

hMLH1甲基化在散发性大肠癌中的临床意义

目的:了解散发性大肠癌中hMLH1基因启动子区域5'端CpG岛的过度甲基化现象,探讨其与微卫星不稳定性(MSI)在散发性大肠癌发生中的相关性.方法:取散发性大肠癌患者肿瘤组织及其正常对照组织(阴性切缘组织,距肿瘤10 cm以上)标本41对,提取DNA后,以甲基化特异性PCR方法检测标本中hMLH1启动子的甲基化情况,并与相应的临床病理学资料进行统计学分析;将BAT25、BAT26作为检测位点,以自动荧光DNA序列分析法检测MSI,并与甲基化情况进行相关分析.结果:41例散发性大肠癌标本中,75.6%(31/41)存在hMLH1启动子过度甲基化,非甲基化患者年龄(49.2岁)与甲基化患者年龄(63.6岁)相比差异有显著性(P<0.05);43.9%(18/41)的标本表现为MSI阳性;在MSI阳性标本中,94.4%(17/18)有甲基化现象存在,明显高于MSI阴性标本(60.9%,14/23),两者相比差异有显著性(P<0.05).结论:散发性大肠癌中普遍存在年龄相关的hMLH1基因启动子过度甲基化现象,由此引起的MSI可能是老年人大肠癌发病的相关因素之一.     

胃癌微卫星不稳定性和hMSH2基因表达的研究

目的　通过研究胃癌及其癌前病变中微卫星不稳定性与错配修复基因hMSH2蛋白表达 ,来揭示微卫星不稳定性在胃癌演化过程中可能作用机制 ,并探讨导致胃癌中微卫星不稳定性的基因机制。方法　用PCR方法检测 5个微卫星位点MSI表现 ;并通过免疫组化SP法检测hMLH1、hMSH2错配修复蛋白的表达。结果　胃癌组、慢性胃炎组中MSI的阳性率分别为 5 8 82 %(30 5 1) ,2 1 0 5 %(12 5 7)。肠型胃癌与弥漫型胃癌的MSI阳性率间差别有显著性意义 (P <0 0 5 )。在所有标本中仅检测到 1例hMSH2表达缺失 ,异常表达的病例为胃乳头状腺癌。结论　MSI在散发性胃癌的发生及发展过程中均起到了一定作用 ,hMLH1启动子区异常甲基化是导致胃癌MSI的重要因素。     

Infrequent microsatellite instability mutator phenotype in Chinese hepatocellular carcinomas

Objective: In order to elucidate the molecular mechanisms that might be responsible for hepatocarcinogenesis, we examined microsatellite instability (MSI), mismatch repair gene hMLH1 mutation and methylation in hepatocellular carcinoma. Methods: Fifty-two cases of surgically resected sporadic hepatocellular carcinoma (HCC) were studied, hMLH1 mutation was examined by two-dimensional electrophoresis and DNA sequencing; hMLH1 methylation was determined by methylation-specific PCR (MSP); and MSI at BAT26 was analyzed by PCR-based methods. Results: MSI at BAT26 was found in 3 of 52 cases (5.8%) of the tumors analyzed. No hMLH1 mutation or hypermethylation was found in these 52 cancerous tissues. No correlation existed between MSI and clinico-pathological characteristics of the patients. Conclusion: Our results suggest that MSI at BAT26 is rarely associated with carcinogenesis of chinese HCC. The genesis of sporadic HCC may occur in an alternative pathway that is probably different from MSI pathway.     

Methylation of hMLH1 and hMSH2 promoters in gastric carcinomas

Objective: To study the correlation of the methylation of the promoters of hMLH1 and hMSH2 with microsatellite instability (MSI) in the tissues of gastric carcinomas. Methods: A total of 68 sporadic cases of gastric carcinoma were studied. Ten specimens of normal gastric mucosa served as control. Methylation of hMLHl and hMSH2 was observed with methylation-specific PCR, and MSI analyzed with PCR-based techniques. Results: No methylation of hMLHl and hMSH2 was found in 10 specimens of normal gastric mucosa. Methylation of hMLHl was detected in 11 cases (16. 2%) of gastric cancers and MSI in at least one locus was found in 17 cases (25%) of the 68 with aid of 5 microsatellite markers, in which eight were MSI-H (≥2loci showed instability) nine MSI-L (only one locus showed instability), and fifty-one were MSS (no instability at any marker). The frequency of methylation was significantly high in MSI-H (87. 5%) than in MSI-L (11.1%) and MSS (5. 9%). CP<0. 01 - 0. 001) but there was no difference of methylatio     

胃癌及癌前病变组织中hMLH1基因启动子甲基化与MSI的关系

目的研究散发性胃癌中hMLH1基因启动子区5′端CpG岛甲基化、微卫星不稳定性（MSI）发生的情况及两者之间的关系，探讨胃癌发生的分子机制。方法采用PCR扩增-聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染法检测（BAT25、BAT26、BAT40、D2S123、D5S346）5个位点的MSI，甲基化特异性-PCR（MSP）检测hMLH1甲基化异常情况。结果30例胃癌标本中检出hMLH1甲基化8例．占26．7％；50例胃癌前病变中检出hMLH1甲基化9例．占18．0％；30例正常胃黏膜未见hMLH1甲基化。30例胃癌中微卫星高度不稳定（MSI-H）7例，均榆测到hMLH1甲基化（100．0％）；低度不稳定（MSI-L）1例，未检测到hMLH1甲基化；稳定（MSS）22例，hMLH1甲基化仅1例（4．5％）。微卫星不稳定的15例胃癌前病变组织中，hMI，H1甲基化8例（53．3％），而微卫星稳定35例胃癌前病变组织中，hMLH1甲基化仅1例（2．9%）。结论①胃癌中存在hMLH1基因启动子甲基化，hMLH1基因甲基化可能参与了胃癌的发生。②hMLH1基因启动子甲魅化在胃癌前病变阶段就已经存在，町能是胃癌发生的早期事件之一。③hMLH1基因甲基化和MSI密切相关，它是导致胃癌组织出现MSI的重要吲索，MSI在胃癌发生、发展过程中发挥一定作用。     

Increased sensitivity of colorectal cancer cell lines with microsatellite instability to 5-fluorouracil in vitro

Objective To study the relationship between sensitivity to 5-FU and the status of a panel of microsatellite loci in three human colon cancer cell lines.Methods Cell viability in several concentrations of 5-FU was assessed by the MTT test. Expression of hMSH2 and hMLH1 in LoVo, SW480 and SW1116 cells were analyzed by immunocytochemical staining. Ten mononucleotide and dinucleotide microsatellite loci were analyzed by the PCR-SSLP-silver staining method. Results By MTT assay, it showed that LoVo cells were more sensitive than SW480 and SW1116 cells (0.8 μmol/L, 2.2 μmol/L and 1.9 μmol/L, respectively,P&lt;0.05). By immunocytochemical staining, hMSH2 was expressed in SW480 and SW1116 cells but not in LoVo cells, while hMLH1 was positive in all three cell lines. The PCR-SSLP-silver staining of 10 microsatellite loci revealed that LoVo cells had a different pattern of electrophoretic bands compared with SW480 and SW1116 cells, manifesting both additions and band-shifts. Conclusion Together with hMSH2 and hMLH1, the status of a panel of microsatellite loci may be used as convenient predictors for drug-optimization or prognosis-assessment in colorectal cancer patients before chemotherapy.     

普鲁卡因对结肠癌细胞中孕酮及脂联素受体3 甲基化的影响

目的 研究孕酮及脂联素受体3（PAQR3）在结肠癌细胞中的表达水平及甲基化状态,检测普鲁 卡因逆转PAQR3 甲基化的作用。方法 通过RT-PCR 检测PAQR3 在结肠癌细胞株（SW620、COLO205 及SW480）中的表达水平;甲基化特异性聚合酶链反应检测PAQR3 在结直肠癌细胞中的甲基化状态及药 物处理后的甲基化状态;Western blotting 检测不同浓度普鲁卡因处理SW480 细胞中PAQR3 蛋白的表达。 结果 PAQR3 在SW620 结肠癌细胞中的表达量高于COLO205 和SW480（P <0.05）。3 种结肠癌细胞株可 见PAQR3 基因甲基化特异性扩增产物条带,且甲基化百分比比较,差异有统计学意义（P <0.05）。SW620 细胞较SW480 和COLO205 细胞中PAQR3 甲基化百分比高（P <0.05）;普鲁卡因处理后3 种结肠癌细胞 株可见甲基化特异性扩增产物条带和非甲基化特异性扩增条带,且3 种细胞中PAQR3 甲基化百分比降低 （P <0.05）。对照组与实验组PAQR3 蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义（P <0.05）。与对照组比较,实 验组PAQR3 蛋白相对表达量升高（P <0.05）。结论 PAQR3 在结直肠癌中低表达,可能与其发生启动子甲 基化有关。普鲁卡因可部分逆转结直肠癌细胞中PAQR3 甲基化状态,上调PAQR3 蛋白表达量。     

卵巢粘液性肿瘤hMLH1启动子甲基化及微卫星不稳定性

目的观察卵巢粘液性肿瘤中错配修复基因hMLH1启动子甲基化,及与微卫星不稳定性(MSI)间的关系。方法1995～2001年浙江大学医学院附属妇产科医院卵巢粘液性肿瘤组织块共107例(恶性49例,交界性35例和良性23例)。选取BAT-25、BAT-26、BAT-40、D5S346、D17S250和D2S1236个位点用PCR法进行MSI分析;限制性内切酶聚合酶链反应(PCR)法分析hMLH1启动子甲基化。结果良性、交界性和恶性肿瘤的hMLH1启动子甲基化阳性率分别为4.3%(1/23)、14.3%(5/35)和36.7%(18/49)。其中恶性组与交界性、良性组之间存在显著性差异(P=0.023和P=0.004),交界性和良性组之间无显著性差异(P=0.438);良性、交界性和恶性肿瘤的MSI表型阳性率分别为4.3%(1/23)、8.6%(3/35)和16.3%(8/49),有上升趋势,但无统计学意义;75%(9/12)MSI表型阳性的肿瘤存在hMLH1启动子甲基化,MSI表型阴性的肿瘤中84.2%(80/95)不存在hMLH1启动子甲基化,MSI表型阳性和hMLH1启动子甲基化之间显著相关(P=0.000),在恶性组和交界性组中两者均存在相关性(P=0.004,P=0.047)。结论卵巢粘液性肿瘤存在hMLH1启动子甲基化,且可能是造成MSI表型阳性的主要因素,两者可能在卵巢粘液性囊腺癌发生过程中起关键作用。     

胃黏膜上皮及胃癌细胞中错配修复基因hMLH1蛋白的表达及意义

[目的]探讨hMLH1蛋白作为胃癌预警标记物的可能性。[方法]免疫组织化学SP法半定量检测24例非肿瘤患者胃黏膜上皮、39例胃癌患者癌旁黏膜上皮及癌细胞hMLH1蛋白的表达情况,比较该蛋白在不同黏膜上皮组织中表达的差异性。[结果]hMLH1蛋白表达率在非肿瘤患者胃黏膜上皮为33％,明显低于胃癌患者癌旁黏膜上皮的72％(P=0．003)及癌细胞的74％(P=0．001),但在癌旁黏膜上皮与癌细胞间无显著性差异(P=0.799)。[结论]hMLH1蛋白在胃癌患者癌旁黏膜上皮及癌细胞的表达强于非肿瘤患者胃黏膜上皮表达的现象,提示其作为胃癌预警组织学标记物的可能性。