NT-3基因过表达慢病毒载体的构建和包装及鉴定

目的构建神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因慢病毒载体,检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达。方法体外扩增NT-3,将NT-3全长载体GV287-GFP与扩增出的NT-3用AgeI进行酶切,将NT-3全长序列克隆入GV-287-GFP,转化大肠杆菌DHS a感受态细胞,筛选出阳性克隆进行基因测序。重组GV287-EGFP质粒、pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒三质粒共转染至包装细胞293T,培养48 h后收集细胞上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在MSCs的转染效率。荧光显微镜观察转染是否成功,RT-PCR和Western blot检测MSCs细胞中NT-3蛋白的表达。结果测序结果和Western blot检测均证明NT-3慢病毒载体构建正确,且在细胞中正确表达。与辅助质粒共包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MSCs细胞。包装慢病毒、浓缩病毒悬液的滴度为2×109/ml慢病毒浓缩液。结论成功构建了稳定高效表达NT-3基因的慢病毒载体。     

重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定*☆

背景：基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向，目的基因和载体是基因治疗的关键。 目的：构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein, EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor，hBDNF)基因重组腺病毒载体。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成。 材料：感受态大肠杆菌DH-5α购自美国Stratagene公司；pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre、腺病毒包装系统AdMax和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobix-Biosystems公司。 方法：以pDC316-hBDNF为模板，聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段，连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上，构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP。利用AdMax包装系统，穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1，3Cre共转染293包装细胞, 同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP，反复感染293细胞扩增病毒后，离子交换法纯化病毒，并测定病毒颗粒数及滴度。 主要观察指标：①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定。②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定。③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化。④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定。⑤纯化病毒的滴度测定结果。 结果：经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定，证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP；扩增纯化后，测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP / mL，A260/A280值约为2.0，滴度为0.8×1010 CCID50/ mL。 结论：已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP，为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞转染人TH基因的实验研究

目的评价酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因修饰骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)后TH的表达情况及转染TH基因对MSCs的影响.方法构建含人TH基因的pCMV/hTH质粒,用脂质体转染原代培养的大鼠MSCs;Western blot及免疫细胞化学染色鉴定TH基因的表达及MSCs的分化情况;MTT比色法测定转染后的MSCs细胞活性,并与未转染的MSCs进行细胞活性比较.结果构建的pCMV/hTH质粒经ECoRI酶切后产生1.9okb和5.3kb的片段,与回收的目的基因及载体基因片段大小相符;转基因后的MSCs Western blot及免疫细胞化学染色显示TH染色阳性;转染后MSCs未见有NeuN,GFAP的表达;MTT比色法测定细胞活性,未转染与转染者差异无显著性.结论构建的TH基因能在体外培养的鼠MSCs中较好的表达,转染不会诱导MSCs向神经样细胞分化,对MSCs细胞活性无明显影响.     

SNCA基因过表达慢病毒质粒构建及稳定转染293T细胞系

目的构建SNCA基因过表达慢病毒质粒,转染293T细胞,建立稳定转染细胞系。方法应用PCR技术扩增目的基因,并将扩增产物插入慢病毒载体质粒pGC-FU上,并对阳性克隆进行基因测序鉴定。pGC-FU-SNCA-GFP重组质粒包装293T细胞,转染24小时后,用荧光显微镜观察标签GFP绿色荧光蛋白的表达,并用West blotting法测定目的蛋白的表达。结果成功构建了pGC-FU-SNCA-GFP慢病毒过表达质粒,获得了稳定转染的293T细胞株。结论人SNCA基因过表达慢病毒载体成功,构建和稳定转染293T细胞系的建立,为进一步体外研究α-突触核蛋白的功能奠定了基础。     

大鼠GAD65基因慢病毒载体的构建及其在MSCs中的表达

目的构建谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)重组慢病毒表达载体,感染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行鉴定。方法 PCR法扩增GAD65基因,构建LV5-GFP-GAD65慢病毒载体;与包装质粒共转染293T细胞包装病毒;将慢病毒感染大鼠MSCs,荧光显微镜鉴定转染率,Western blot检测GAD65的表达。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFP-GAD65慢病毒载体构建成功;包装病毒产生的病毒液滴度为5×107TU/ml;慢病毒感染大鼠MSCs的转染率高于90%,Western blot结果显示GAD65蛋白表达比对照组明显升高。结论 GAD65重组慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度病毒液,感染大鼠MSCs能稳定过表达GAD65蛋白,为进一步探索侧脑室注射基因化的MSCs治疗癫痫奠定实验基础。     

大鼠GLUT3基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，为研究GLUT3的生物学功能提供工具。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT3基因全长cDNA片段，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-GLUT3，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-GLUT3，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印记法（western blot）的方法从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果经DNA测序和PCR分析显示GLUT3 cDNA序列正确。成功筛选出重组腺病毒质粒pAd-GLUT3后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及western blot检测表明重组腺病毒包装成功。结论本研究成功构建了携带大鼠GLUT3基因的复制缺陷型重组腺病毒载体。     

大鼠蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒的构建

背景：研究者们早已发现蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase，PTP1B）可负性调节胰岛素信号转导，但目前制约PTP1B功能研究的重要环节是缺乏有效的工具。 目的：拟构建PTP1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒。 设计、时间及地点：体外细胞学基因转染实验，于2007-05/12在解放军第二军医大学长海医院中心实验室完成。 材料：293细胞由中科院上海细胞研究所提供，真核表达质粒psiRNA-PTP1B由上海吉凯生物公司合成，AdEasy-1菌、穿梭载体pAdTrack、大肠杆菌DH5α由本室保存，重组腺病毒PCR鉴定引物由上海生工生物公司设计合成。 方法：由生物公司合成针对大鼠PTP1B mRNA的特异性siRNA真核表达质粒psiRNA-PTP1B，双酶切得到siRNA-PTP1B表达片段，插入pAdTrack载体上，获得转移质粒pAdTrack-siRNA-PTP1B。后者经线性化后，转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组，PacⅠ酶切鉴定，筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-PTP1B，酶切线性化后转染293细胞包装成重组病毒颗粒。通过反复感染扩增病毒，采用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒。 主要观察指标：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，鉴定重组腺病毒穿梭载体及重组腺病毒是否构建成功。 结果：PacⅠ酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAd-siRNA-PTP1B构建成功，转染293细胞后有绿色荧光蛋白表达。PCR鉴定表明重组腺病毒中含有siRNA-PTP1B片断，成功构建了携带PTP1B干扰RNA的重组腺病毒Ad-siRNA-PTP1B，293细胞扩增纯化后，获得约3.6×109 efu/mL滴度的重组腺病毒。 结论：应用AdEasy-1系统可以高效快速制备表达PTP1B干扰RNA的重组腺病毒。     

以海马神经元为靶细胞Ad-Easy系统快速构建携带PTEN基因的重组腺病毒表达载体

摘要：目的：应用Ad-Easy腺病毒载体系统快速构建携带PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)基因的重组腺病毒表达载体,为应用基因技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定基础。方法：采用RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增获得目的基因PTEN, 克隆入pAdTrack-CMV穿梭质粒（含绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）基因）形成转移载体pAdTrack-CMV-PTEN,将其在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组;重组子酶切鉴定正确后转染HEK293细胞,PCR分析鉴定扩增情况及Western blot检测受腺病毒感染的海马神经元内PTEN蛋白的表达。结果：荧光显微镜检测到受腺病毒感染的HEK293细胞表达GFP,出现明显的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）,经3轮扩增得到了病毒所需滴度。PTEN蛋白在受感染腺病毒神经元内表达显著增强。结论：利用Ad-Easy系统成功快速的构建了携带PTEN基因的腺病毒表达载体,为研究基因治疗缺血性脑损伤奠定了基础。     

腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N的构建及表达

目的构建携带Son ic hedgehog氨基端(Shh-N)基因的腺病毒表达系统并在包装细胞中制备相关病毒颗粒,以用于中枢神经系统疾病的基因治疗。方法应用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增Shh-N,然后克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pAdTrack-CMV,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdEasy-1进行重组,构建pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,然后转染包装细胞293细胞系。结果成功获得Shh-N片段并构建了缺陷型腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,经限制性酶切后证实该表达载体含Shh-N基因,在293细胞中小规模扩增病毒后,经PCR检测证实病毒颗粒中存在Shh-N基因。结论获得了携带Shh-N的腺病毒颗粒,可将之用于基因修饰神经细胞,进行促细胞存活和定向分化诱导研究,为自身干细胞和外源性细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临床应用提供理论和实验基础。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达*★

目的：拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体，观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。 方法：通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因，PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因，分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上，构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和 pTrack-CMV-VEGF165，经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165，经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞，收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。 结果：PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒，PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变；荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强；经多轮感染、扩增后，病毒效价可达（2.0~5.0）×1010 pfu/mL。转染48 h后，293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高（F=427.93，17.93，P < 0.05）。 结论：成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒，血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

pDsRed-C1-CDNF真核表达载体在大鼠骨髓间质干细胞中的表达*

背景：骨髓间质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞,目前,已有将其作为细胞载体对帕金森病进行治疗的相关报道。 目的：构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并诱导其在大鼠骨髓间质干细胞中表达。 方法：通过RT-PCR的方法从小鼠组织中扩增出CDNF基因片段,并在其两端引入Xho I、BamH I限制性内切酶酶切位点,然后将其克隆至pDsRed-C1真核载体,构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并通过Lipofectin2000将其转染至大鼠骨髓间质干细胞中。 结果与结论：pDsRed-C1-CDNF真核表达载体经双酶切、单酶切、PCR及测序验证正确,提示已成功构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体并已转染至大鼠骨髓间质干细胞中。     

Establishment and characterization of a CHO cell line producing a secreted form of human ciliary neurotrophic factor: neuroprotective effects of the recombinant protein

Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) was inserted into a mammalian expression vector linked to the prepro sequence of human nerve growth factor. A Chinese hamster ovary cell line was established by resistance to neomycin and the plasmid integrated DNA was amplified using the metallothionein gene. This cell line contained several hundred copies of the human CNTF gene and produced an NH₂ terminal truncated form of human CNTF (22 kDa) which was secreted into the medium. Although the copy number of the human CNTF gene was high and its mRNA was actively transcribed, the recombinant protein secreted into the medium constituted only 35–40% of the total amount of human CNTF synthesized by these cells. Both wild-type human CNTF produced in bacterial cells and the human CNTF obtained by forced secretion were effective in protecting hippocampal pyramidal neurons from injury induced by glucose deprivation, a form of excitotoxic neurodegeneration.     

VEGF转染对MSCs向神经细胞诱导分化的影响

目的构建并制备血管内皮生长因子（VEGF）重组腺病毒,观察VEGF基因转染对骨髓基质干细胞（MSCs）的增殖和诱导为神经细胞能力的影响。方法将VEGF的基因亚克隆至穿梭载体;使用Padeasy-1腺病毒系统制备包含VEGF基因的腺病毒。得到的腺病毒感染MSCs,使用无血清诱导法使其向神经元细胞分化。鉴定诱导分化结果,评价VEGF基因转染对MSCs向神经元细胞诱导分化的影响。结果成功制备出编码VEGF的腺病毒,病毒滴度为1×10^10v．g．／L,以MOI=100感染MSCs,无血清诱导条件下VEGF基因转染的MSCs向神经细胞分化的结果与未转染的MSCs无明显差异。结论VEGF基因转染对MSCs向神经细胞诱导分化无明显影响,为下一步应用于临床奠定了基础。     

人sTRAIL基因载体构建及其在真皮干细胞的表达

背景：基于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)可溶性相关凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand, sTRAIL)抗瘤的生物特性，克隆sTRAIL基因，构建其真核表达载体，为肿瘤细胞凋亡的实验研究奠定基础。 目的：构建真核表达载体pEGFP-N1/sTRAIL，并转染真皮干细胞，以探究sTRAIL基因导入真皮干细胞的表达情况。 方法：采用RT-PCR二步法，以人胎盘组织总RNA为模板，扩增sTRAIL的cDNA序列，将其克隆入pMD18-T载体，随后亚克隆入载体pEGFP-N1中，构建其真核瞬时表达载体pEGFP-N1/sTRAIL，以Fugene 6转染技术，将sTRAIL基因导入真皮干细胞。倒置显微镜下观测转染后真皮干细胞生长变化及sTRAIL在其中的表达等情况。RT-PCR法对目的基因转染的真皮干细胞进行鉴定。 结果与结论：克隆到sTRAIL基因的cDNA序列，成功构建了其真核表达载体，该真核表达载体能携带sTRAIL基因在真皮干细胞中正常表达。倒置显微镜下观测到转染后真皮干细胞生长状态与未转染的真皮干细胞无差异。以经sTRAIL基因转染的真皮干细胞该基因组DNA为模板，用RT-PCR法能扩增到sTRAIL基因cDNA序列。     

CD、Flt-1基因共表达重组质粒的构建及对BT325细胞增殖的抑制作用

目的构建CD、Flt-1基因共表达重组质粒,并检测其对BT325细胞增殖抑制的影响。方法从大肠杆菌及人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链式反应（RT-RCR）扩增CD基因和FL]r-1基因片段,应用基因重组技术将CD基因和Flt-1基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,经酶切鉴定及DNA序列分析证实所构建的载体。转染BT325细胞株,通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞的增殖抑制作用。结果RT--RCR方法获得CD基因和Flt-1基因片段,酶切分析和DNA测序鉴定表明重组质粒pEGFP-C1-CD-Flt-1构建成功。转染72h后实验组细胞生长速度是control组的（33．20%±5．4％）,流式细胞术发现实验组细胞的G1期细胞比例明显高于control组,细胞出现凋亡,实验组细胞的凋亡率为（19．7％±5．45％）。结论成功构建真核表达重组质粒pEGFP-c1-CD-Flt-1,其体外可抑制BT325增殖并诱导其凋亡。     

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染

目的　构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的真核细胞表达载体,为应用GDNF进行如帕金森综合征之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。方法　采用RT- PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的c DNA序列,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体p EGFP- C1中,对重组质粒p EGFP- GDNF进一步鉴定。采用电转及阳离子脂质体将重组质粒p EGFP- GDNF转染至SH- SY5 Y细胞。结果　大鼠GDNF c DNA已正确地克隆到真核表达载体p EGFP- C1中,而构建成重组大鼠质粒p EGFP-GDNF。GDNF基因可稳定表达在细胞中。结论　真核细胞表达载体p EGFP- GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5 Y的成功构建,为进一步开展GDNF基因治疗PD等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景：已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。 目的：创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。 设计、时间及地点：基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。 材料：人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。 方法：设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段, 构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1~4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率。 主要观察指标：重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。 结果：成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体, 其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA 质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。 结论：成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。     

稳定表达GDNF基因的骨髓基质干细胞对多巴胺能神经元的作用

目的 制备胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)基因修饰的骨髓基质干细胞(MSCs)，观察其对多巴胺能神经元的作用，探索治疗帕金森氏病的新途径。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从新生小鼠大脑皮层细胞克隆出GDNF cDNA片断，以pEGFP-C1为载体导入MSCs，制备稳定表达GDNF基因的MSCs工程细胞，采用联合培养的技术通过倒置显微镜和免疫组织化学的方法观察MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞与多巴胺能神经元之间的相互作用。结果 MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞均能促进多巴胺能神经元的存活和生长，MSCs工程细胞作用更强。结论 成功构建了GDNF基因修饰的MSCs工程细胞，该细胞对多巴胺能神经元有明显营养保护作用，在帕金森病治疗中可能有重要价值。     

Overexpression of CNTF in Mesenchymal Stem Cells reduces demyelination and induces clinical recovery in experimental autoimmune encephalomyelitis mice

Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs) were previously reported to ameliorate neuronal functional deficits in the MOG35-55-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice by inducing T cell anergy. Human Ciliary neurotrophic factor (CNTF) recently was found to promote myelogenesis and reduce inflammation in CNTF-deficient EAE mice. We ectopically overexpressed CNTF in human MSCs to investigate its potential role in promoting remyelination and improving functional recovery in EAE mice. MSCs transfected by Ad-CNTF–IRES–EGFP (MSC–CNTF) were injected intravenously into EAE mice 10 days after the immunization. Neurological functional tests were scored daily by grading clinical signs (score 0–6). Immunofluorescence microscopy was used to detect MSC–CNTF in spinal cord. Expression of NG2, CNTF, and cleaved caspase-3 was measured by immunohistochemistry. CNTF expression was also analyzed by Western blot. Myelin was detected by Solochrome Cyanin staining. Our results found that CNTF concentration in MSC–CNTF cells was 20-fold higher than that in either MSC or Ad-EGFP-transfected MSCs (MSC–EGFP) in vitro. Mice receiving MSC–CNTF cells showed remarkable neuronal functional recovery: the cumulative clinical scores were significantly decreased, and the disease onset was statistically delayed. Mice receiving MSC–CNTF cells showed reduced TNF-α, IFN-γ and increased the level of cytokine IL-10 in peripheral blood and a large number of MSC–CNTF cells were detected in the spleen, but were not detected in other organs such as lung, liver and kidney. In the lesions of these mice, 1) the number of cleaved caspase3-positive cells was significantly reduced; 2) MSC–CNTF- and NG2-positive cells were significantly increased; and 3) the expression of CNTF was dramatically increased. In addition, demyelination was significantly reduced in MSC–CNTF mice. These data indicated that MSC–CNTF may improve functional recovery in EAE mice, possibly by exerting their immunoregulatory activity, inhibiting inflammation, homing MSC–CNTF cells to the lesions, elevating CNTF expression, reducing demyelination, and stimulating oligodendrogenesis.