腺病毒—单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗载体的构建及鉴定

对腺病毒－单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＡＤＶ－ＨＳＶ－ＴＫ）治疗载体进行构建与鉴定。利用脂质体介导的共转染,将质粒ＰＪＭ１７与ＦＰＡ／ＴＫ－ＲＳＶ共转染入２９３细胞系,利用挑取单噬斑,获取单克隆的重组腺病毒,并在２９３细胞系中进行扩增、纯化．经ＰＣＲ、ＤＮＡ测序,酶切鉴定,用空斑实验（ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）测定,分析病毒的活性。结果：重组病毒经ＰＣＲ测序证实已携带ＴＫ片段,酶切鉴定出现特异性的酶     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肝癌基因治疗实验中的初步应用

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肝癌基因治疗实验中的初步应用戈凯郑仲承冯学胜孙兰英汤钊猷刘新垣自１９９２年８月以来，美国利用逆转录病毒载体将ＨＳＶ－ＴＫ基因直接导入治疗恶性脑瘤，治疗了１０例患者，其中６例仍然存活［１］，显示ＨＳＶ－ＴＫ基因治疗肿瘤可能有临...     

腺病毒-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗载体的构建及鉴定

对腺病毒－单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＡＤＶ－ＨＳＶ－ＴＫ）治疗载体进行构建与鉴定。利用脂质体介导的共转染,将质粒ＰＪＭ１７与ＦＰＡ／ＴＫ－ＲＳＶ共转染入２９３细胞系,利用挑取单噬斑,获取单克隆的重组腺病毒,并在２９３细胞系中进行扩增、纯化。经ＰＣＲ、ＤＮＡ测序,酶切鉴定,用空斑实验（ｐｌａｑｕｅａｓｓａｙ）测定,分析病毒的活性。结果：重组病毒经ＰＣＲ测序证实已携带ＴＫ片段,酶切鉴定出现特异性的酶切图谱,重组病毒具高滴度的感染活性。结论：ＡＤＶ－ＴＫ基因的构建为ＨＳＶ－ＴＫ基因的临床应用提供了更为有效的手段。     

单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因治疗对前列腺癌治疗的联合应用

前列腺癌是常见的恶性肿瘤 ,在西方国家位居第二大肿瘤死亡原因。目前其治疗手段仍不尽人意 :去势治疗仅为姑息性治疗 ,一般经过 1～ 2年后前列腺癌均成为雄激素不依赖性而使治疗失败 ;前列腺癌根治术仅适用于局限于前列腺包膜内的早期肿瘤 ,而且 3 0 %～ 50 %患者术后 5年仍会肿瘤复发 ,其恶性程度多较前升高[1] ;放射治疗同样 ,治疗后 1 7个月60 %患者血PSA重新升高[2 ] 。因此对于前列腺癌 ,尤其是晚期、复发或转移肿瘤 ,迫切需要寻找新的有效治疗途径。基因治疗是目前肿瘤治疗方面的研究热点 ,针对前列腺癌的基因治疗方式主要有 :失活…     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的表创

目的：构建含单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV—tk)基因的真核表达载体(pcDNA3-tk),并观察能否在食管癌细胞株中表达。方法：将HSV—tk的cDNA亚克隆于真核表达载体pcDNA3上,构建pcDNA3-tk。后者经脂质体介导转染食管癌细胞株Eca-109,通过高剂量的G418选择培养,筛选出抗性克隆。经RT-PCR检测确定HSV—tk基因是否能在转染细胞内转录。结果：成功地构建了真核表达载体pcDNA3-tk,并且在pcDNA3-tk转染的食管癌细胞内发现tk基因的mRNA。结论：含hSV—tk基因的真核表达载体能在食管癌细胞中表达。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法：应用基因工程技术构建了携带单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk，通过脂质体法转染PA317细胞，G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺部细胞系GLC-82的生长抑制率。结果：重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论：肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后，能有效地被GCV杀死。     

胞嘧啶脱氨酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗肝门部胆管癌的体内外实验研究

目的:观察逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(E.coli-cytosinedeaminase,CD)基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)基因转染肝门部胆管癌的作用。方法:在脂质体lipofectamine的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,收集其病毒上清,转染FRH细胞,用RT-PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine,5-Fc)和(或)无环鸟苷(ganciciovir,GCV)后,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定转基因组及未转基因组FRH细胞存活率。在0.8cm裸鼠肝门部胆管癌模型转染入双自杀基因后,给予5-Fc500mg/kg体重,GCV100mg/kg体重,1次/d,共10d,观察肿瘤生长情况。结果:双自杀基因在FRH细胞中可稳定表达,联合使用5-Fc和GCV对靶细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-Fc或GCV。在裸鼠实验性肝门部胆管癌,实验组肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05);双自杀基因与单自杀基因的作用有显著差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒介导自杀基因可有效地杀死肝门部胆管癌细胞,明显抑制裸鼠肝门部胆管癌生长,双自杀基因共表达较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用。     

构建单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因真核表达载体

从单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞培养液和细胞裂解液中提取HSV－Ⅱ基因组DNSA，以此为模板，用PCR方法获取胸苷激酶（TK）基因，将获取的DNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3中，筛选阳性克隆测序，结果表明：本研究获取的HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，编码376个氨基酸，结果表明：本研究扩增出HSV－ⅡTK基因的全部编码区序列，并成功构建真核表达载体pcDNA3／TK.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因旁观者效应的实验研究

目的 :研究单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因 (HSV -Ⅱtk)对人原发性肝细胞癌SMMC - 772 1的旁观者效应 .方法 :HSV -Ⅱtk基因通过阳离子脂质体Lipofectin介导 ,体外转染人原发性肝细胞癌SMMC -772 1,孵育 18h .取出细胞及上清液 ,对倍稀释 ( 2× ,4× ,8× ,16× ,3 2× )后分别加入另一 2 4孔板 .结果 :正常SMMC - 772 1细胞的浓度升高 ,亲本细胞的存活率随之降低 ,两者呈明显的负向相关关系 ;细胞组的OD值明显低于上清液组及空白对照组 (P <0 0 1) ;细胞组可见凋亡峰出现 ,而上清液组则无凋亡峰出现 .结论 :HSV -Ⅱtk基因对人原发性肝细胞癌SMMC - 772 1细胞具有旁观者效应 ,其作用机制可能与细胞紧密连接及细胞凋亡有关     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达对人肝癌细胞的生长抑制

使用转导有单纯疱疹Ｉ型病毒胸苷激酶（ＨＳＶ１－ＴＫ）基因的人肝癌ＳＭＭＣ７７２１细胞株建立了裸鼠移植瘤模型，并进行了在体和体外试验性无不环鸟苷（ＡＣＶ）治疗。结果发现基因转导后的肝癌细胞表现出对ＡＣＶ的敏感性，肝癌细胞生长抑制与ＡＣＶ的剂量有关；用药组裸鼠除平均瘤重明显低于对照组外，不凶细胞核分型指数降低，伴有细胞变性和坏死。结果表明：ＨＳＶ１－ＴＫ基因经逆转录病毒转导后，用ＡＣＶ诱导表达明显抑制     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase／ganeyclov—ir,HSV—tk／GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV／hytk-IRES-hrGFP质粒导入HXO-Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO-Rb44／tk。RT—PCR鉴定hytk基因在HXO-Rb44／tk细胞中的转录结果。比较HXO-Rb44和HXO-Rb44／tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44混合细胞的杀伤作用(“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果HXO-Rb44／tk细胞经RT—PCR可检测出530bp的hytk基因片段。HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO-Rb44／tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应,而GCV作用的HXO-Rb44／tk细胞上清对HXO-Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV—tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法,旁观者效应可能是GCV代谢产物通过缝隙连接进行细胞间转运来实现的。     

人参总皂苷对黑色素瘤自杀基因治疗的增效作用

[目的]观察人参总皂苷联合自杀基因HSV-tk/GCV治疗系统对小鼠黑色素瘤的生长抑制效应,探讨人参总皂苷对黑色素瘤自杀基因治疗的增效作用.[方法]选用85只C57BL/6J雄性小鼠,除正常组5只外其他均接种含20%B16tk+细胞的tk+和tk-混合细胞,造模成功后随机分为模型组、人参总皂苷组、tk/GCV组、人参总...     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

六味地黄丸对自杀基因系统治疗黑色素瘤的增效作用

【目的】研究六味地黄丸对HSV1-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤的增效作用,以期探讨建立中西医结合肿瘤自杀基因联合治疗方案的可行性。【方法】培养病毒包装细胞PT67/tk,病毒上清感染黑色素瘤细胞株B16,G418筛选2周,获得抗性细胞克隆,命名为B16/tk并进行体外GCV杀伤试验;证明具有杀伤活性后,将B16/tk与野生型B16按1∶4的比例混合后接种于C57BL/6J小鼠右腋下皮下组织内,以复制小鼠移植性黑色素瘤模型。将复制模型的小鼠分为模型对照组、六味地黄丸组、自杀基因tk/GCV治疗组和联合治疗组(N=11),六味地黄丸从接种第2天起治疗25 d,tk/GCV从接种第7天起治疗20 d,另设正常对照组观察疗效。【结果】体外杀伤实验显示,GCV对B16/tk肿瘤细胞具有明显的杀伤效应,而对野生型B16肿瘤细胞无明显的杀伤作用,表明体外病毒感染黑色素瘤细胞成功,病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性。联合治疗(自杀基因联合六味地黄丸)对小鼠移植性黑色素瘤生长具有明显抑制作用,联合治疗组肿瘤质量与模型对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),其抑瘤率达到87.1%;而单纯自杀基因组和六味地黄丸组肿瘤质量与模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),抑瘤率分别为62.8%和54.4%。病理检查结果显示,肉眼见治疗组肿瘤体积减小,以联合治疗组更明显。光镜下见治疗组肿瘤细胞密度相对较低,肿瘤周围有较多纤维结缔组织增生及炎症细胞浸润,其中联合治疗组更明显。结果表明:自杀基因联合六味地黄丸治疗对小鼠移植性黑色素瘤生长具有抑制作用,其疗效优于单纯自杀基因治疗或单纯六味地黄丸治疗。【结论】六味地黄丸可能通过自杀基因疗法旁杀伤效应的免疫机制或其他机制对肿瘤自杀基因疗法起到增效作用。该研究工作初步证明了建立自杀基因联合中医药疗法的中西医结合肿瘤基因治疗方案具有可行性。     

腺病毒介导HSV-tk/GCV系统杀伤脑胶质瘤C6细胞

目的 :观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /丙氧鸟甘 (herpessimplexvirusthymidinekinase/ganci clovir HSV tk/GCV)系统对脑胶质瘤细胞的杀伤作用 .方法 :将AdCMVLacZ感染胶质瘤细胞C6,X gal染色 ,测定腺病毒的转染率 .AdCMVtk感染C6细胞后加入 10mg·L-1GCV ,观察肿瘤细胞存活率及旁观者效应 .结果 :tk基因对C6细胞的转染率随着腺病毒的感染复数 (MOI)量增加而增加 (r=0 .819,P<0 .0 5 ) ,10 0 %转染所需要的MOI为 10 0 .AdCMVtk/GCV对C6细胞的杀伤强度与AdCMVtk的量成正相关 (r =0 .870 ,P <0 .0 5 ) .此杀伤作用存在旁观者效应 ,且较强 .结论 :腺病毒介导的HSV tk/GCV系统具有杀伤脑胶质瘤的作用     

Combination Adenovirus-Mediated HSV-tk/GCV and Antisense IGF-1 Gene Therapy for Rat Glioma

Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍｅｄｉａｔｅｄＨＳＶ ｔｋ/ＧＣＶｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｅｎｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｇｌｉｏｍａａｎｄｉｔａｌｓｏｈａｓｂｅｅｎｐｕｔｉｎｔｏｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｐｈａｓｅＩｔｒｅａｔｍｅｎｔ .ＳｅｖｅｒａｌｓｔｕｄｉｅｓｒｅｐｏｒｔｅｄＨＳＶ ｔｋ/ＧＣＶｓｙｓｔｅｍｍａｙｍａｋｅｔｈｅｂｒａｉｎｔｕｍｏｒｓｒｅｇｒｅｓｓｅｄｔｏｔａｌｌｙａｎｄｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｐｅｒｉｏｄｏｆｔｈｅｔｕｍｏ…     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.     

DADS提高HSV—tk／GCV自杀基因系统对兔晶状体上皮细胞旁观者效应的机制

目的：探讨二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide,DADS）提高重组腺相关病毒（recombinant adenoassociated virus,rAAV）介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus kinase,HSV—tk）／丙氧乌苷（ganci—clovir,GCV）系统对兔晶状体上皮细胞旁观者效应的可能机制。方法：应用免疫组织化学方法检测正常兔晶状体上皮细胞间隙连接蛋白43（connexin43,Cx43）及转染HSV-tk基因的晶状体上皮细胞Cx43的表达,以及不同浓度的DADS诱导下的2种细胞的Cx43表达,MTT比色法检测细胞存活率。结果：兔晶状体上皮细胞Cx43及转染删弘砒基因的晶状体上皮细胞的Cx43经DADS诱导后表达阳性明显增强,尤其以50μmol／LDADS最明显。MTT比色法检测显示DADS增强了HSV—tk／GCV自杀基因系统的旁观者效应。结论：DADS可以提高晶状体上皮细胞Cx43的表达,并可提高HSV—tk／GCV自杀基因系统对兔晶状体上皮细胞的旁观者效应。     

DADS提高HSV-tk/GCV自杀基因系统对兔晶状体上皮细胞旁观者效应的机制

目的:探讨二烯丙基二硫化物(dialyl disulfide,DADS)提高重组腺相关病毒(recombinant adenoassociated virus,rAAV)介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus kinase,HSV-tk)/丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)系统对兔...     

六味地黄丸增强黑色素瘤自杀基因系统旁观者效应的体外研究

【目的】探讨六味地黄丸含药血清对单纯疱疹病毒核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞株的增效作用,为提高临床基因治疗肿瘤疗效提供新思路。【方法】构建并鉴定恶性黑色素瘤B16细胞HSV-tk/GCV治疗系统,制备六味地黄丸含药血清及对照血清,将B16、B16/tk细胞按20%(1:4)的比例混合制成细胞悬浮液接种于96孔培养板上,分为对照血清组、含药血清组、对照血清联合GCV组、含药血清联合GCV组,其中含药血清组及含药血清联合GCV组按血清体积分数计又分高(10%)、中(5%)、低(2.5%)3组,GCV的终浓度为25μmol/L,按分组添加相应的含药血清,每孔培养液总体积200μL,37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养。48h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测杀伤效应。采用金正钧Q值法分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。【结果】MTT实验表明联合用药组对B16细胞的抑制率明显高于其他组,六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统的增效作用存在量效关系:2.5%、5%、10%含药血清联合20%tk/GCV组的实际抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)显著高于理论抑制率(38.13%、38.67%、39.92%),金正钧Q值分别为1.28、1.54、1.74,均大于1.15,具有协同增效作用。【结论】六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统旁观者效应有明显的增效作用,且具有一定的量效关系。