细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导的保护力观察

目的探讨细粒棘球绦虫（Eg）转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c小鼠后对Eg原头节攻击感染的保护性作用。方法热絮凝法提取转基因苜蓿的叶蛋白,配成浓度为20μg/μl。分别用100μl（约含1μg融合抗原）口服灌胃和10μl（约含0.1μg融合抗原）滴鼻接种免疫BALB/c小鼠,每3d免疫1次,连续免疫2月,同时设转空质粒（pBI121）苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白对照组。末次免疫后8周,用Eg原头节进行攻击感染（腹腔注射50个Eg原头节/每只小鼠）,感染后24周剖杀各组小鼠,检获包囊质量,计算囊重减少率;采眼球血,常规酶联免疫吸附试验法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中IgG及其亚类和IgE水平。结果疫苗口服灌胃接种组小鼠检获包囊质量明显降低,囊重减少率为64.1%,与正常蛋白对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）,血清中IgG、IgG2b和IgE水平显著高于正常苜蓿叶蛋白对照组,其值分别为0.175±0.013、0.096±0.028和0.096±0.028。结论细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗口服接种能使免疫鼠获得保护力以抵抗Eg原头节攻击感染,IgG、IgG2b和IgE在疫苗诱导的保护力中起重要作用。     

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的动态观察

目的动态观察细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫Balb/c小鼠后诱导的免疫应答。方法热絮凝法提取转基因苜蓿的叶蛋白,再用无菌双蒸水将叶蛋白提取液的浓度配制成20μg/μl。88只Balb/c小鼠随机分为2组,分别用100μl灌胃和10μl滴鼻免疫小鼠,每3天1次,连续免疫2个月。在末次免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周各组随机剖杀4只小鼠,眼球取血,常规酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中IgG及其亚类和IgE水平;取脾,分离脾细胞,流式细胞仪(flow cytometr,FCM)检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比,体外经脾细胞悬液或加入Eg粗抗原(EgAg)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激培养,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测免疫鼠脾T淋巴细胞增殖情况,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IL-12、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平。结果在末次免疫后4～6周,2组免疫小鼠的血清IgG及其亚类和IgE水平升高,脾T淋巴细胞增殖水平升高,CD4+和CD8+T细胞亚群百分比分别升高,脾细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别升高。结论细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗在免疫早期(4～6周)可诱导免疫鼠脾T淋巴细胞增殖,产生Th1和Th2混合型免疫应答,CD4+和CD8+T细胞亚群在细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导的保护性免疫机制中起重要作用。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合蛋白诱导小鼠免疫应答

目的研究细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合蛋白免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法 56只SPF级雌性Balb/c小鼠随机均分7组,分别为重组Bb-Eg95-EgA31皮下注射组(A组)、肌肉注射组(B组)、鼻腔内接种组(C组)、口服灌胃组(D组)、空载体对照组(E组)、Bb对照组(F组)和Bb培养用液体培养基(MRS)对照组(G组)。免疫后8周各组鼠用50个Eg原头节攻击,攻击25周后,处死小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE和脾细胞上清液IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平;MTT法测定脾细胞增殖反应;流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T细胞百分比和脾细胞凋亡发生率。结果重组Bb-Eg95-EgA31免疫组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平升高,IgG3和IgE降低;脾IFN-γ、IL-12和TNF-α水平升高,IL-10水平降低;脾T淋巴细胞明显增殖;脾CD4+和CD8+T细胞显著增加;脾细胞凋亡发生率显著降低。结论细粒棘...     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究

目的 探讨细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的变化.方法 将细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径分别免疫Balb/c鼠,免疫后8周用Eg原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的百分比,同时设有BCG和PBS对照.结果 疫苗接种组的脾CD4 和CD8 T细胞亚群显著增加,口服接种组和肌肉注射组的CD4 T细胞亚群和CD4 /CD8 亚群比值显著高于皮下注射组和鼻腔内接种组.结论 CD4 T细胞亚群可能与细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导的小鼠抗Eg原头节攻击感染的保护力有关,疫苗口服接种和肌肉注射是两种较好的免疫途径.     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠免疫应答的动态观察

目的:观察细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后其免疫应答的动态变化。方法:将疫苗分别采用口服灌胃和鼻腔内接种免疫BALB/c鼠,分别于免疫后2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周用ELISA法测定免疫小鼠血清中IgG及其亚类和IgE水平。用MTT法测定脾淋巴细胞的增殖,用ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平,用流式细胞术(FCM)检测脾CD4+和CD8+T细胞百分率。结果:口服免疫小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后8、2、6、6、8和10周达到峰值。脾淋巴细胞悬液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后4、2、4和6周达到峰值。脾淋巴细胞增殖在免疫后6周达到峰值;脾CD4+T细胞在免疫后6周达到峰值,脾CD8+T细胞无明显变化。鼻腔内接种免疫小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后10、6、10、8、8和10周达到峰值。脾淋巴细胞悬液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后2、2、4和8周达到峰值。脾淋巴细胞增殖在免疫后6周达到峰值;脾CD4+T细胞在免疫后6周达到峰值,脾CD8+T细胞无明显变化。口服免疫和鼻腔内接种是两种较好的免疫途径,且前者优于后者。结论:细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫应答。     

细粒棘球绦虫重组Bb—Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞增殖变化的研究

目的探讨细粒棘球绦虫（Eg）重组双歧杆菌（Bb）-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率及脾细胞增殖的变化。方法将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB／c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原（EgAg）或刀豆素A（ConA）刺激培养,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测免疫小鼠脾细胞增殖反应,同时设有空载体、Bb和MRS对照。结果以上4种疫苗接种组小鼠的囊重抑制率分别为45．33％、41．33％、70．67％和62．67％;疫苗接种组的脾细胞明显增殖;鼻腔内接种和口服免疫组的脾细胞增殖显著高于皮下和肌肉注射组。结论细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫反应。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导的保护力观察

目的 探讨细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫鼠后对Eg原头节攻击感染的保护性作用.方法 '将细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径分别免疫Balb/C鼠,免疫后8W用Eg 原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率,测定血清中IgG及其亚类和IgE水平,同时设有BCG和PBS对照.结果 疫苗接种组的减蚴率为18.20%～92.46%,血清IgG、IgG2a、IgG2b水平明显升高,IgG1、IgG3和IgE显著降低.结论 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗口服灌胃和肌肉注射是两种较好的接种途径,IgG、IgG2a和IgG2b在疫苗诱导的保护力中起重要作用.     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗对感染小鼠脾细胞凋亡的影响

目的:探讨细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾细胞凋亡的变化.方法:将细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径分别免疫BALB/c鼠,免疫后8周用Eg原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有BCG和PBS对照.结果:疫苗接种组的脾细胞凋亡发生率明显低于感染对照组;口服和肌肉注射组的脾细胞凋亡发生率显著低于皮下和鼻腔内接种组.结论:Eg原头节感染可引起小鼠脾细胞发生凋亡,细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗接种可抑制感染鼠脾细胞的凋亡,疫苗口服和肌肉注射是两种较好的免疫途径.     

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB／c小鼠后脾T淋巴细胞增殖的动态观察

目的动态观察细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫小鼠后脾T淋巴细胞的增殖情况。方法热絮凝法提取转基因苜蓿疫苗叶蛋白,配成浓度为20μg／μL。88只BALB／c小鼠随机分为两组,用100μl（约含1μg融合抗原）口服灌胃和10μl（约含0．1μg融合抗原）鼻腔黏膜接种分别免疫小鼠,每3天1次,连续免疫2月。在末次免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、i8和20周各组随机剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞．体外经Eg粗抗原（EgAg）或刀豆素A（ConA）刺激培养,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测免疫小鼠脾T淋巴细胞增殖情况。结果口服灌胃组的脾T淋巴细胞增殖水平在末次免疫后4～10周升高,在末次免疫后6周达最高水平;鼻腔黏膜接种组的脾T淋巴细胞增殖水平在末次免疫后4～12周升高,在末次免疫后6周达最高水平;鼻腔黏膜接种组脾T淋巴细胞增殖水平高于口服灌胃组。EgAg或ConA刺激组脾T淋巴细胞增殖水平高于相应原液组,且ConA刺激组高于相应EgAg刺激组（P〈0．01或P〈0．05）。结论细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗能诱导免疫鼠产生脾T淋巴细胞增殖反应,鼻腔黏膜接种途径优于口服灌胃途径。     

转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿的培育及鉴定

目的培育并鉴定转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿,为进一步研究转基因苜蓿疫苗提供依据。方法将构建好的pBI—Eg95-EgA31质粒电穿孔转化根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens,At）LBA440d株,利用重组根瘤农杆菌（rAt）侵染苜蓿（alfalfa）叶片,卡那霉素抗性筛选伤愈组织体胚,培育转基因苜蓿．用SDS-PAGE、Western—blot、PCR和RT—PCR鉴定转基因苜蓿。结果SDS—PAGE和Western-blot证实Eg95-EgA31融合基因在苜蓿中得到表达,表达产物分子质量约为37500Mr,表达效率约占苜蓿叶总蛋白的0．05％,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别。PCR和RT—PCR均扩增出1016bp Eg95-EgA31融合基因片段。结论成功培育了转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿,为进一步研究细粒棘球绦虫转基因苜蓿疫苗奠定了基础。