肝细胞生长因子促皮肤愈合及其对皮肤附属器的作用

目的 以新西兰兔耳皮肤切割缺损为模型,探索携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的重组腺病毒(Ad-HGF)促进创面愈合及其对皮肤附属器的作用.方法 新西兰兔12只,麻醉后在耳腹侧切除圆形全层皮肤直至软骨,切口直径0.7mm,每侧耳5个切口.其中10只兔被随机分为Ad-HGF1组、Ad-HGF2组、Ad-HGF3组、携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒(Ad-GFP)组和磷酸盐缓冲液(PBS)组,每组2只,手术完成后即刻将6×107 pfu的Ad-HGF、6×108 pfu的Ad-HGF、6×109 pfu的Ad-HGF、6×109 pfu的Ad-GFP及同体积的PBS一次性依次涂抹于上述各组创面,以观察创面愈合速度及愈合质量.另两只兔创面涂抹6×109 pfu Ad-GFP,以评价腺病毒载体对创面的转染.结果 涂抹Ad-GFP后局部有较强GFP的表达,并可持续到第13天;涂抹第8天可观察到涂抹Ad-HGF的3个组创面愈合速度较Ad-GFP组及PBS组快(P＜0.05);至第23天,涂抹Ad-HGF的3个组创面已全部愈合,而涂抹Ad-GFP组及PBS组各有2个和6个创面未完全愈合.涂抹Ad-HGF的3个组可见不同程度再生的丛状新生毛.半定量评估创面巾纤维组织,涂抹Ad-HGF的3个组与Ad-GFP组和PBS组间差异有显著性意义(P＜0.01).涂抹Ad-HGF的3个组创面中可见多处密集的毛囊及皮脂腺的存在.结论 HGF不仅可促进皮肤创面愈合,还可促进愈合皮肤中附属器的形成.     

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的防治作用

目的 研究抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11)对博莱霉素(BLM)诱导的小鼠肺纤维化的防治作用.方法 C57BL/6小鼠分为空白对照组、盐水对照组、BLM组和低、中、高剂量scFv(3G11)组.BLM组气管内注射BLM 400 ng/g;低、中、高剂量scFv(3G11)组注射BLM当天记为0 d,第1～7天每天腹腔注射scFv(3G11) 15、30、45 μg/g.第21天处死盐水对照组、BLM组和中剂量scFv(3G11)组小鼠各6只,取左肺行组织病理学观察,并测定肺泡隔面积比和有核细胞计数;另处死空白对照组、盐水对照组、BLM组和低、中、高剂量scFv(3G11)组小鼠各6只,取肺组织测定羟脯氨酸含量以衡量肺胶原沉积状况.取小鼠腹腔巨噬细胞进行原代培养,采用明胶酶谱法观察不同浓度scFv(3G11)(0、15、30、45、60 μmol/L)对巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的影响.结果 组织病理学观察显示scFv(3G11)组小鼠肺纤维化程度明显轻于BLM组,肺泡隔面积比(45.3%± 3.2%)和有核细胞计数(451 ± 47)均明显低于BLM组(59.0% ± 3.0%,599 ± 42,均P<0.01).中、高剂量scFv(3G11)组小鼠肺组织羟脯氨酸含量[分别为(0.82±0.05)和(0.80±0.03)μg/mg]明显低于BLM组[(0.92±0.07)μg/mg,P<0.05,P<0.01].明胶酶谱分析显示,scFv(3G11)浓度为15 μmol/L时即可抑制巨噬细胞分泌的MMP-2和MMP-9的活性.结论 抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11)能抑制BLM诱导的小鼠肺纤维化.     

PEPT2 mRNA在博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织表达研究(摘要)

目的:研究PEPT2(peptide transporter 2)mRNA在肺纤维化大鼠肺组织的表达.方法:(1)实验动物与分组:健康SD大鼠56只(200±20g),雌雄各半,随机分为3组:①正常对照组(n=10),不作任何处理;②生理盐水组(n=10),气管内一次性滴入0.2 mL生理盐水,14 d后放血处死,检测羟脯氨酸含量;③博莱霉素(BLM)组(n=36),将BLM(日本化药株式会社)按5mg/kg溶于生理盐水中配成浓度为0.5%的BLM溶液,气管内一次性滴入0.2 mL复制肺纤维化模型,分别于给药后7 d、14 d和28d检测羟脯氨酸含量.     

~(18)F-FDGPET/CT显像检测肺纤维化的实验研究

目的探讨~(18)F-FDG PET/CT显像检测肺纤维化的诊断价值。方法选取12只雄性SD大鼠随机分为肺纤维化组和对照组,每组6只。肺纤维化组大鼠单次气管内注入博来霉素(5 mg/kg),对照组给予等量生理盐水。造模后28天两组大鼠进行肺组织~(18)F-FDG PET/CT显像,检测两组大鼠肺组织对~(18)F-FDG的摄取情况。显像后处死大鼠并取其左肺叶用于Masson染色,测定羟脯氨酸含量。结果肺纤维组肺组织摄取~(18)F-FDG的%ID/g值为(0.6±0.059),明显高于对照组的(0.095±0.005),差异有统计学意义(t=20.74,P0.05)。肺纤维化组大鼠肺组织羟脯氨酸含量为(1.704±0.145)μg/mg,明显高于对照组的(1.066±0.057)μg/mg,差异有统计学意义(t=10.05,P0.05)。Masson染色显示肺纤维化组大鼠肺组织纤维增生和胶原沉积,~(18)F-FDG PET/CT显像示肺纤维化组大鼠的肺纤维灶处可见明显放射性浓聚。肺纤维化组~(18)F-FDG摄取值与羟脯氨酸含量密切相关(R~2=0.9142,P0.05)。结论~(18)F-FDG PET/CT显像可用于无创诊断肺纤维化。     

比格犬注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测

目的:观察Beagle犬重复给予Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)抗体的出现时间及消失规律. 方法:将24只比格犬随机分为四组:正常对照组、手术对照组、Ad-HGF小剂量组(2.4×107 pfu/ kg)和Ad-HGF大剂量组(2.4×108 pfu/ kg). Ad-HGF各组犬给予不同剂量Ad-HGF共14次. 在给药2次后分别利用病毒中和反应和ELISA 方法检测血清中抗腺病毒抗体和抗HGF抗体. 结果:手术组、正常对照组及实验组动物于给药前及给药3次时血清细胞均未出现明显中和反应. 给药4次后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度中和作用,至停药后12 wk抗体水平很低或已不存在. 各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体. 结论:犬肌注Ad-HGF 4次后动物血清中检测到了抗腺病毒抗体,停药4 wk后抗体水平有不同程度下降,直至12 wk后血清中腺病毒抗体基本消失.     

人肝细胞生长因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的: 构建含人肝细胞生长因子(hHGF)基因的骨髓间充质干细胞(MSCs),获得高表达hHGF的MSCs.方法: 构建含hHGF基因的腺病毒表达载体pDC316-HGF-IRES-EGFP.同源重组法获得含hHGF的重组腺病毒Ad-HGF.以仅表达GFP基因的重组腺病毒Ad-GFP为对照,体外分别以Ad-GFP, Ad-HGF感染MSCs.荧光激活细胞分选术检测受染细胞的基因表达效率.酶联免疫吸附测定法检测转导细胞培养上清中hHGF表达的浓度和持续时间.结果: 腺病毒表达载体经限制性内切酶切后有2.2 kb的hHGF目的基因片段和5.2 kb的线性化载体片段;目的片段测序结果与基因库中hHGF cDNA序列一致.病毒液Ad-HGF纯化后滴度可以达到8.02×1010 pfu/ml.FACS检测HGF/MSCs的GFP阳性率达95.19%.HGF/MSCs细胞培养上清中hHGF能持续表达至少14 d;最高浓度达到99 ng/ml.结论: 本实验中腺病毒表达载体构建正确;重组腺病毒液Ad-HGF滴度高;转导后在MSCs中获得高效、稳定和持续表达的hHGF.该载体达到实验设计要求,为进一步的体内外研究提供了实验依据.     

γ-干扰素转基因表达对不同时期博莱霉素致小鼠肺间质纤维化的作用

目的探讨小鼠γ-干扰素(mIFN-γ)在气道上皮细胞局部转基因高效表达对不同时期博莱霉素致小鼠肺间质纤维化的治疗作用.方法选择4周龄的雄性ICR小鼠(25g左右),使用博莱霉素诱导小鼠肺间质纤维化.将小鼠分为5组,阳性对照组(PC)为吸入博莱霉素组,阴性对照组(NC)为经鼻吸入生理盐水组,基因治疗A、B、C组分别于博莱霉素刺激后7、14和21 d给予小鼠滴入含有小鼠γ-干扰素cDNA片段的重组复制缺陷型腺病毒(AdCMV mIFN-γ)5×10s空斑形成单位(pfu/mL),在给予腺病毒后2周处死小鼠,收集小鼠肺组织及肺泡灌洗液(BALF),右肺经HE和Masson染色,左肺匀浆后检测羟脯氨酸含量.结果经气道给予AdCMV mIFN-γ处理的转基因组小鼠BALF中均可测得高浓度mIFN-γ表达,其水平在基因治疗A组(GTA)、基因治疗B组(GTB)和基因治疗C组(GTC)分别为(8 954.68±853.88)pg/mL、(9 312.64±361.28)pg/mL和(9643.32±612.74)pg/mL.博莱霉素刺激后第7d时给予小鼠mIFN-γ转基因处理(GTA组),小鼠肺间质纤维化程度和羟脯氨酸含量为(1 267.09±37.07)μg,与阳性对照组的(1244.86±62.46)μg相近,而于14 d(GTB组)和21 d(GTC组)后给予小鼠mIFN-γ转基因治疗,肺间质纤维化的程度则显著减轻[GTB组与GTC组羟脯氨酸含量分别为(477.24±30.79)μg和(734.29±53.12)μg],其中GTB组的纤维化程度减轻最为明显,且羟脯氨酸含量与阳性对照组相比显著下降(P＜0.001),接近阴性对照组.结论 (1)腺病毒介导的mIFN-γ能在小鼠肺内高效表达;(2)在博莱霉素致肺泡炎期给予mIFN-T转基因治疗和阳性对照组相比并不能减轻肺纤维化程度;(3)在博莱霉素致肺纤维化形成期给予mIFN-γ转基因治疗能有效的抑制成纤维细胞增殖和胶原沉积;(4)mIFN-γ不能逆转已经形成的纤维化改变.     

虾青素通过TGF-β1介导的Smads/ERK通路抑制肺纤维化

目的 研究虾青素(astaxanthin,AX)对博莱霉素(bleomycin,BLM)所致SD大鼠肺纤维化的干预作用及机制.方法 SD雄性大鼠32只,体质量(200±20)g,采用随机数字表法分为Sham组(假手术组)、AX组、BLM组和AX+ BLM组.经气道注入5 mg/kg的BLM(BLM组和AX+ BLM组)或生理盐水(Sham组)后,每天灌服虾青素(2 mg/kg)油溶液(AX组和AX+ BLM组)或植物油(BLM组)连续14 d,最后一次给药24 h后取材.检测肺系数,肺组织进行HE染色及Masson染色,显微镜下观察大鼠肺部炎症及纤维化程度;碱水解法检测羟脯氨酸含量;免疫组化法观察肺组织α-SMA蛋白表达情况;酶联免疫夹心法(ELISA)检测血清中TGF-β1水平;Western blot法检测Smad2/3及ERK1/2蛋白.结果 与Sham组及AX组相比,BLM组肺损伤严重,有明显的肺纤维化病灶形成;与BLM组比较,AX+BLM组肺炎症程度及纤维化程度明显减轻(P＜0.01),肺组织胶原蛋白沉积减少,羟脯氨酸含量明显降低(P＜0.01),α-SMA蛋白表达减少,TGF-β1水平也明显降低(P＜0.05),同时Smad2/3蛋白及ERK1/2蛋白磷酸化水平明显下降.结论 虾青素能明显抑制BLM诱导的肺纤维化,其作用机制可能与降低TGF-β1水平,从而下调Smads/ERK通路有关.     

喜炎平注射液对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的作用及机制研究

目的 观察喜炎平注射液对博莱霉素(bleomycin,BLM)所致小鼠肺纤维化的作用并探讨可能的机制.方法 将昆明小鼠随机分为对照组、喜炎平(XYP)组、博来霉素(BLM)模型组、BLM+XYP组.经气管内1次性灌注BLM复制肺纤维化动物模型,治疗组造模后同时予尾静脉注射喜炎平直至第28天实验结束,药物干预后第7天、28天分别处死动物,第7天测定肺湿干重比(W/D),髓过氧化物酶(MPO)活性,苏木精-伊红(HE)染色观察肺泡炎症,第28天测定羟脯氨酸(HYP)含量及前Ⅰ型胶原蛋白mRNA(procollagenl mRNA)表达水平,Masson染色观察肺纤维化程度.结果 第7天,BLM+ XYP组小鼠较BLM组的肺泡炎程度明显减轻,肺W/D及MPO活性降低(P＜0.05),第28天,BLM+ XYP组小鼠肺组织HPY含量、procollagen I mRNA表达水平较BLM组明显降低(P＜0.05),Massor染色显示胶原沉积减少,肺纤维化程度减轻.结论 喜炎平对博莱霉素所致小鼠肺纤维化具有一定的干预作用,其机制可能与其抗炎作用有关.     

罗格列酮对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的影响

目的 采用博莱霉素(BLM)腹腔注射诱导大鼠肺纤维化的模型,探讨过氧化物体增殖活化受体γ激动剂(PPAR-γ)--罗格列酮对肺纤维化的治疗作用.方法 经腹腔给予BLM致大鼠肺纤维化模型,将实验大鼠随机分为3组,即对照组、模型组(BLM组)、干预组(罗格列酮组).于造模完成后第21天处死大鼠,取肺组织制备病理切片,行HE,Masson染色后评价各组模型肺组织形态学变化,测定肺组织匀浆中羟脯氨酸(HYP)含量.结果 BLM组的肺组织炎症反应较明显;罗格列酮组与BLM组相比,肺组织HYP下降,肺纤维化程度减轻.结论 罗格列酮能通过活化PPAR-γ信号通路减轻大鼠肺纤维化,机制与干预炎症因子产生及纤维化过程有关.