重组L-门冬酰胺酶前体脂质体与重组L-门冬酰胺酶对小鼠毒性作用比较

为了考查L-门冬酰胺酶(L-Asparaginase,L-ASNase)前体脂质体(Proliposomes)( L-ASNasePL) 与L-ASNase的急性毒性及对外周血中白细胞总数及血小板数的作用.脂质体组小鼠静脉注射给药(L-ASNasePL),给药剂量为给以最大药物浓度(4000KU/m1),最大静脉注射体积(0.5m1/20g);L-ASNase 组给药体积为0.4ml/20g,给药一次,给药后每天观察记录小鼠活动、死亡情况,共观察14d.结果L-ASNasePL 的毒性与L-ASNase 相比明显降低,其小鼠iv的L-ASNasePL的最大耐受量为10.0×105KU/kg,相当于每日人临床拟用剂量的5000倍.对正常小鼠体重、外周血中白细胞总数及血小板数的影响:L-ASNase高剂量组(1000KU/kg)有显著降低小鼠外周血中白细胞总数及血小板数的作用(P<0.05),而L-ASNasePL对小鼠外周血中白细胞总数及血小板数无明显影响.L-ASNasePL组及L-ASNase组对小鼠体重增长均无明显影响.说明L-门冬酰胺酶前体脂质体急性毒性明显小于L-门冬酰胺酶,L-ASNasePL对小鼠外周血中白细胞总数及血小板数无明显影响.     

重组L-门冬酰胺酶前体脂质体对HL-60细胞生长的影响

目的:研究L-门冬酰胺酶(L-ASNase)脂质体对体外培养的人早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞活性的影响.方法:实验分3组:对照1组加入新鲜RPMI1640培养液倍比稀释的空白脂质体;对照2组加入L-ASNase(终浓度分别为2.5,5,10,20和40 μg·mL-1);实验组加入L-ASNase脂质体(前体脂质体水合而得,终浓度分别为2.5,5,10,20和40 μg·mL-1).MTT法测定细胞存活率,电镜观察细胞形态学,流式细胞仪检测肿瘤细胞周期的改变.结果:L-门冬酰胺酶脂质体(经前体脂质体水合而得)组HL-60细胞的G0/G1期细胞量明显增加,S期的细胞明显减少;增殖指数(PI)显著下降;HL-60细胞凋亡比例显著增多.结论:L-门冬酰胺酶脂质体抑制HL-60细胞的繁殖,可能与抑制细胞的S期有关.     

重组L-门冬酰胺酶前体脂质体对HL-60细胞的生长影响

目的研究L-门冬酰胺酶脂质体对体外培养的人早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞活性的影响.方法MTT测定L-门冬酰胺酶脂质体的抗肿瘤活性,电镜观察药物对肿瘤细胞形态学的影响,流式细胞仪检测药物对肿瘤细胞周期的影响.结果L-门冬酰胺酶脂质体(经前体脂质体水合而得)组与肿瘤细胞作用后,HL-60细胞的G0/G1期细胞量明显增加,而进入S期的细胞明显减少.增殖指数L-门冬酰胺酶脂质体组的PI值显著下降.HL-60细胞凋亡比例显著增多.结论L-门冬酰胺酶脂质体抑制HL-60细胞的繁殖,可能与抑制细胞的S期有关.     

L-门冬酰胺酶的稳定性研究

目的探讨临床配制L-门冬酰胺酶(L-ASP)注射液时出现浑浊的原因及解决办法。方法用5%NaHCO3注射液调整L-ASP注射液pH值,观察不同PH下输液的外观及不溶性微粒数的变化。结果L-ASP注射液出现浑浊的原因在于溶媒pH值的不合理,用5%NaHCO3调整溶媒pH值为7.5时L-ASP静脉注射最稳定。结论此方法简便,价格低廉,有推广价值。     

重组L-门冬酰胺酶的聚乙二醇化学修饰及修饰后酶的稳定性研究

目的单甲氧基聚乙二醇 (mPEG)化学修饰大肠杆菌重组L 门冬酰胺酶 (L ASP) ,考察经过修饰的酶的稳定性。方法N 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)活化酯法活化mPEG ,生成的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰琥珀酸亚胺酯 (SS mPEG)按不同摩尔比例与L ASP偶联 ,确定适合的反应时间和反应pH值。通过聚乙二醇化学修饰后的酶 (L ASP PEG) ,酶活力和纯度通过奈氏法和丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)检测 ,高效液相色谱检测L ASP PEG相对分子质量并考察了L ASP PEG体外稳定性等。结果SDS PAGE显示mPEG已经偶联到L ASP分子上 ,以两者摩尔比 1 0∶1为最佳 ,反应pH条件为 8.5 ,获得的L ASP PEG平均比活单位为 6 4 .8IU/mg ,相对分子质量为 30 1 80 0 ,体外稳定性高于L ASP。结论此实验确定了mPEG化学修饰L ASP最佳反应条件为 2 5℃反应 30min ,两者投料摩尔比为 1 0∶1 ,获得的L ASP PEG比L ASP稳定性高     

黄体酮前体脂质体口服制剂水合后包封率的测定

目的:为了提高口服黄体酮后的生物利用度,开发黄体酮口服制剂,制备了一种新型黄体酮前体脂质体口服制剂,并测定了其水合后的包封率。方法:采用一种新型前体脂质体制备方法将黄体酮制成前体脂质体,开发新型前体脂质体口服制剂。采用葡聚糖Sephadex G-50凝胶柱对黄体酮脂质体进行柱分离,测定其包封率。结果:包封率与稀释倍数和药脂比有关。当药脂比为1∶20、稀释倍数为1∶10时,黄体酮前体脂质体包封率可达(72.36±11.69)%。结论:利用前体脂质体制备技术可将黄体酮包裹成脂质体,所形成的脂质体包封率较高,可为黄体酮前体脂质体口服制剂的开发奠定基础。     

单甲氧基聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶的研究

用一种单甲氧基聚乙二醇修饰剂修饰L-门冬酰胺酶，初步确定了最佳修饰条件，应用阴离子交换色谱和分子筛色谱分离纯化得到单修饰产物，酶活性回收率在40％以上，修饰产物的稳定性提高，免疫原性显著下降。     

顺铂前体脂质体的制备及包封率测定

目的:对顺铂前体脂质体制备工艺及包封率测定方法进行初步研究。方法:选用山梨醇为水溶性载体,采用前体脂质体法与超声分散混合法制备顺铂前体脂质体;高效液相色谱法测得包封率。结果:制得的顺铂前体脂质体为球形双层脂质体,包封率为71.8%。结论:本法制备的顺铂前体脂质体,在水化前便于贮存,重新混悬时易于分散、工艺简单、可规模化生产、包封率高;高效液相色谱法测定顺铂的含量,方法简便、准确。     

C端融合RGD三肽的重组L-门冬酰胺酶基因克隆、表达和对血液系统的影响

利用加端PCR技术构建asnB-RGD工程菌，获得C末端带有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，ArgGly-Asp)三肽的门冬酰胺酶(AnsB-RGD)，以改进L-门冬酰胺酶的作用。以pUA18为模板，利用pUC18上游普适引物和根据L-门冬酰胺酶Ⅱ基因(ansB)C末端下游序列设计的引物来扩增目标基因。将目标基因连于pMD18-T载体，转化宿主菌JM109，筛选出的阳性克隆通过HindⅢ、NcoⅠ双酶切下目标基因连到含T7启动子的高效表达载体pET28a上，再转化BL21宿主菌。高效表达的工程菌摇瓶发酵，渗透休克法提取AnsB-RGD融合蛋白，12％的SDS-PAGE检测酶蛋白并考察酶的活力、特异性及其对血液系统的影响。2％琼脂糖凝胶电泳、DNA测序鉴定构建的pET28a．ansB．RGD工程菌，奈氏法、SDS-PAGE及免疫学方法检测AnsB-RGD融合蛋白。DNA序列分析证明RGD三肽已经连接在L-门冬酰胺酶的C末端，带有RGD三肽的融合蛋白仍然能与抗L-门冬酰胺酶的抗体结合，初步发现AnsB-RGD融合蛋白有促进血液凝固作用，但酶活力下降。     

脂质体包封率的测定方法

脂质体系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊。脂质体的包封率是包封于脂质体中的药物量占脂质体系中药物总量的百分比。也有人用测定包封体积来表征脂质体的包封特性。包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标之一,也是脂质体能否发挥较普通制剂高效、低毒特点的关键。因此,研究脂质体时,包封率是一个重要的考察项目。     

薄膜分散法制备白藜芦醇长循环热敏前体脂质体及其表征研究

目的:对白藜芦醇长循环热敏前体脂质体制备的研究以及对其性质进行分析。方法:先用薄膜分散法制备白藜芦醇长循环热敏脂质体后,再用冷冻干燥法来制备白藜芦醇长循环热敏脂质体的前体。采用电势测定仪、HPLC等方法对该脂质体的包封率、粒径、稳定性、载药量、电位、释放度等来展开系统的检查。结果:白藜芦醇长循环热敏前体脂质体水合后形成白藜芦醇长循环热敏脂质体,粒径均值为(107.9±3.6)nm,Zeta电位的均值为(-12.2±1.6)m V,包封率可达89.4%;该脂质体在相变温度42℃下药物释放达到94%以上。结论:采用长循环热敏来制备的白藜芦醇前体脂质体含量与包封率检查方法准确、快速、简单且方法简便易行。载药量大,包封率好,工艺比较稳定。本实验可为新型白藜芦醇静脉注射用热敏脂质体的研究提供基础。     

依托泊苷长循环热敏前体脂质体的制备工艺研究

目的:对依托泊苷(Etoposide,VP-16)长循环热敏前体脂质体的制备工艺进行研究,并对该制备工艺进行方法学及制剂质量考察。方法:应用薄膜分散法制成VP-16长循环热敏脂质体,进一步借助冷冻干燥技术进行依托泊苷长循环热敏前体脂质体的制备;采用zeta电势测定仪及HPLC等技术进行方法学考察,主要包括脂质体的包封率、粒径、载药量、电位、释放度、稳定性。结果:VP-16长循环热敏前体脂质体水合形成长循环热敏脂质体,粒径为(105.2±3.4)nm,Zeta电位为(-11.9±1.7)m V,包封率可达96.8%;该脂质体在相变温度42℃下药物释放达到96%以上。结论:VP-16长循环热敏前体脂质体的制备工艺稳定,脂质体载药量大,包封率高;药物含量及包封率的测定方法简单、快速而准确,因而,该研究可为VP-16开发成静脉注射用新制剂提供数据支持。     

双氯芬酸钠脂质体的制备及包封率测定

目的:制备双氯芬酸钠脂质体并测定其包封率。方法:以pH梯度法制备脂质体,透射电子显微镜考察其形态与粒径;采用高效液相色谱法测定双氯芬酸钠的包封率。结果:制备的脂质体粒径大小均匀,粒径范围为150～175nm;双氯芬酸钠检测浓度的线性范围为0.01～1mg·mL-1(r=0.9990,n=6),平均回收率为100.05%(RSD=1.21%,n=6);包封率最高可达85.8%,最低52.4%。结论:本方法可制备得到包封率较高的双氯芬酸钠脂质体。     

药物载体空白脂质体前体的制备及性质的研究

以蛋黄卵磷脂、胆固醇为膜材,加入适量的高分子表面活性剂,选择合适的支持剂,采用冷冻干燥法制备了空白脂质体前体,并用它作为药物载体,将药物溶液分散在载体中,制成药物脂质体．研究了空白脂质体前体的再分散性及物理稳定性．空白脂质体前体再分散性良好,平均粒径为０．７５μｍ,粒径分布比较集中,在室温下贮存７个月、９个月后再分散其平均粒径分别为０８１μｍ、０８４μｍ,对５ Ｆｕ的包裹率也没有发生显著改变。用５ Ｆｕ,阿霉素（ＡＤＭ）等为模型药物,考察了影响药物脂质体包裹率的因素,并将最优条件固定．研究结果表明：空白脂质体水相的ｐＨ值、离子强度、再分散药物溶液的浓度（即药物与磷脂的重量比）对药物包裹率有显著影响．     

由空白前体脂质体制备抗癌药物脂质体

以空白前体脂质体作为药物载体,将药物溶液分散在载体中,制成药物脂质体.空白前体脂质体对5Fu等几种抗癌药物均可达到一定的包裹率,阿霉素在一定条件下可达到85%以上,并与传统薄膜法进行了比较.抑瘤活性及毒性实验结果表明:与游离药物相比,5Fu、阿霉素等药物的抑瘤活性都有不同程度的提高.急性毒性实验表明:除AraC外,几种药物的毒性均有所降低,以顺铂最明显.     

盐酸小檗碱脂质体的制备及其含量、包封率的测定

目的：制备盐酸小檗碱脂质体,并测定其包封率和脂质体各成分含量。方法：采用硫酸铵梯度法制备盐酸小檗碱脂质体,以超速离心法、微柱法、超滤法对盐酸小檗碱脂质体包封率的测定方法进行研究,以HPLC-ELSD测定脂质体各成分含量。结果：超速离心法能将未包封药物与脂质体很好地分离,最佳超速离心条件：离心速度为60000 r·min-1,离心时间为1 h,离心温度为10℃,脂质浓度为6 mg·ml-1。结论：包封率测定方法具有简单、快速分离等优点。 HPLC-ELSD能够同时测定脂质体各成分含量。     

氟比洛芬脂质体的制备和体外透皮实验

目的研究氟比洛芬脂质体的制备和体外透皮扩散。方法乙醇注入法制备不同粒径的氟比洛芬脂质体,微型柱离心法分离脂质体和游离药物,采用Franz扩散池,考察氟比洛芬脂质体透过单位面积鼠皮的累积量、渗透系数和皮内滞留量。结果相对于大粒径脂质体,小粒径脂质体显著提高氟比洛芬的透皮速率;开放式给药组的累积透过量、渗透系数和皮内滞留量高于封闭组。结论脂质体给药方式和脂质体的粒径是影响氟比洛芬体外透皮的主要因素。     

兰索拉唑脂质体包封率的测定

目的:建立兰索拉唑脂质体包封率的测定方法。方法:利用透析法分离脂质体和游离药物,采用紫外分光光度法测定兰索拉唑脂质体的包封率,在284 nm 处测定兰索拉唑脂质体中的含药量。结果:透析平衡时间为10 h,兰索拉唑浓度在2.1～10.5μg·mL~(-1)范围内线性关系良好(r=0.9998);该方法的平均游离药物回收率(98.5%～99.9%)符合要求;高、中、低3种浓度的日内和日间精密度试验的 RSD 均小于1%;透析24 h 内无渗漏,重现性好。结论:本法便捷、准确,适用于脂溶性药物兰索拉唑脂质体包封率的测定。     

高效液相色谱法测定洛莫司汀脂质体药物含量及包封率

目的:建立测定洛莫司汀脂质体药物含量及包封率的RP-HPLC法。方法:采用Diamonsil~(TM)C_(18)柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.05mol·L~(-1)磷酸二氢铵溶液-三乙胺(60∶40∶0.2,磷酸调pH为3.5);柱温:室温;流速:1.0mL·min~(-1);紫外检测波长:232nm。采用Sephadex G-50分离洛莫司汀脂质体中的游离药物。结果:在本色谱条件下洛莫司汀与辅料及溶剂峰分离良好,洛莫司汀在4.0-48.0μ·mL~(-1)范围内线性关系良好(r=1.0,n=5),回收率在98.0%-101.0%之间,日内RSD及日间RSD均小于2%(n=5)。结论:说明该方法准确可靠、简单快速,可用于洛莫司汀脂质体含量及包封率的测定。     

盐酸莫西沙星脂质体的制备及包封率测定方法研究

目的：制备盐酸莫西沙星脂质体,建立盐酸莫西沙星脂质体包封率测定方法。方法：乙醇注入法制备盐酸莫西沙星脂质体,正交试验优选脂质体的最佳处方。采用葡聚糖凝胶柱法、超滤离心法分离脂质体与游离药物,并进行方法学考察,优选出测定盐酸莫西沙星脂质体包封率的方法。结果：盐酸莫西沙星脂质体的最佳处方为：卵磷脂与胆固醇比为 3：1,药脂比为 1：7,水合介质中聚山梨酯20的用量为1%,优化后的包封率为90.73%。葡聚糖凝胶柱法和超滤离心法都能将脂质体与游离药物分离,葡聚糖凝胶柱法的平均柱加样回收率为85.54%~88.15%,超滤离心法的平均加样回收率为94.40%~97.35%。结论：盐酸莫西沙星脂质体的制备工艺稳定,包封率较高。葡聚糖凝胶柱法不适于盐酸莫西沙星脂质体的包封率测定,超滤离心法可高效、准确、方便地测定盐酸莫西沙星脂质体包封率。