人类CD252基因片段在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

目的优化表达含人类CD252胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为单克隆抗体的制备打下良好的基础。方法将测序正确的pET32a（＋）－CD252胞外段重组质粒转入表达菌株BL21感受态细菌中,用SDS－PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,通过改变pET32a（＋）－CD252阳性菌株的诱导时间、温度,以优化出最佳表达条件。采用包涵体纯化法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BalB／C小鼠,采用ELISA法测定血清中抗体效价。结果成功获得表达pET32a（＋）－CD252的阳性菌株。转化有pET32a（＋）－CD252胞外段重组质粒的表达菌经IPTG诱导后,在蛋白分子量标准的31．0～42．7kD之间出现了新的蛋白条带,新的蛋白主要存在于包涵体中。优化表达条件分析表明,在诱导4h、温度37℃、IPTG浓度为1．0mmol／L时,融合蛋白的表达量最高。包涵体洗涤纯化后,经SDS-PAGE电泳证明可得到较纯的目的蛋白。免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1：3200。结论pET32a（＋）-CD252胞外段原核表达载体能够表达CD252蛋白,并获取了目的蛋白的优化表达条件,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

OX40基因原核表达及优化

目的 构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体,进行诱导表达并优化表达条件.方法 PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a(+),重组pET32a-OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的小量诱导表达,并优化表达条件.结果 出现新增蛋白条带,融合蛋白主要存在于包涵体中;Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合.结论 构建了小鼠OX40基因的原核表达载体,获得OX40胞外段融合蛋白的最佳表达条件,为后续单抗制备等工作奠定了基础.     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A(SRA)胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中提取RNA,逆转录为cDNA,采用PCR技术从PBMC-cDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a(+),经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blotting进行分析鉴定。FCM及ELISA方法检测SRA胞外段对Con A诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果 PCR扩增得到长约1 100 bp的目的基因片段,插入pET41a(+)载体所获重组表达载体pET41a-SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75 000 Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白,为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。     

HER-2蛋白疫苗的制备及在小鼠中诱导的抗体应答

目的：制备HER-2抗原疫苗．方法：采用RT—PCR方法从HER-2＋SKBR3细胞株中获得HER-2基因胞外段编码区cDNA,构建pQE-30-HER-2原核表达载体,在大肠杆菌中表达HER-2胞外区蛋白．Ni—NTA柱亲和层析纯化后,梯度尿素复性,Western Blot鉴定．用获得的蛋白免疫小鼠,检测重组蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答．结果：构建的pQE-30-HER-2质粒经酶切和DNA测序分析,结果表明该基因的序列与设计的序列完全相同．构建的质粒转化DI-IS（x后经IPTG诱导表达,SDS—PAGE分析,该重组蛋白以包涵体形式表达,且与mAbHerceptin有较好的结合活性．包涵体用Ni—NTA柱亲和层析纯化后,梯度尿素复性,最大限度的获得了可溶性的HER-2胞外区蛋白．用重组蛋白免疫小鼠,得到了较高的抗体滴度．结论：成功制备了HER-2蛋白疫苗并诱导出较高抗体滴度,为下一步工作打下基础．     

小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法从BALB/c小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法获得CD25分子胞外段序列;将其亚克隆入原核表达载体PET-32a,构建好PET-32a-CD25胞外段,并进行酶切及测序鉴定;将PET-32a-CD25胞外段转染大肠杆菌BL21进行表达,并对表达产物进行纯化和鉴定。结果RT-PCR扩增出708 bp的CD25胞外段的基因片段;pET32a-CD25胞外段/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为47×103,重组蛋白用镍树脂纯化后经Western blot检测显示具有良好的免疫反应性,并且可以在体外有效刺激自体T细胞疫苗免疫小鼠脾细胞的增殖并高分泌IL-4。结论CD25胞外段蛋白在原核细胞中成功表达,纯化后的蛋白保持良好的免疫反应性。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

人TRAIL胞外区原核可溶性表达及活性鉴定

目的获得具有生物活性的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)胞外段蛋白。方法根据大肠杆菌密码子偏爱性要求,设计合成编码TRAIL胞外段的DNA序列,构建成pET30a-TRAIL胞内融合表达质粒,重组质粒转化表达宿主E.coli BL21。在不同温度、不同浓度的IPTG条件下诱导表达TRAIL,SDS-PAGE分析表达产物,MTT法检测产物活性。结果构建的工程菌株表达29KD的可溶性TRAIL融合蛋白,能诱导Jurkat细胞凋亡。结论成功表达了人TRAIL胞外段蛋白,为进一步研究提供基础。     

结核分枝杆菌RipB基因的克隆、表达及对藤黄微球菌生长的影响

提取肺结核分枝杆菌基因组DNA,PCR扩增RipB基因并将其连接到表达载体pET 21a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白。SDS PAGE表明：重组RipB表达蛋白量约占菌体总蛋白量的40%,而其在37 ℃表达时主要为包涵体,在15 ℃表达时主要在可溶上清内;Ni柱一步亲和层析获得重组RipB;100 pmol/L重组RipB可显著促进藤黄微球菌生长。     

柯萨奇-腺病毒受体基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的利用原核基因工程克隆表达柯萨奇-腺病毒受体(CAR)胞外段,并制备多克隆抗体。方法从HeLa细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得编码CAR胞外段的cDNA,与pQE31质粒连接,构建表达型重组质粒,测序证实后诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化后,免疫新西兰兔,ELISA检测抗血清滴度。结果重组质粒转化的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达及亲和纯化后得到滴度较高的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot显示其分子量约为26 kd,具有特异的抗原性,主要以包涵体形式存在于菌体中。纯化的融合蛋白免疫新西兰兔后产生的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1:32 000。结论CAR胞外段基因的克隆表达和多克隆抗体的制备,为进一步研究该受体在以腺病毒载体为基础的基因治疗中的作用及柯萨奇病毒的致病机制奠定了基础。     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64表达纯化

目的表达并纯化结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64。方法将构建好的表达载体pET32a-MPB64测序后,转化到大肠杆菌BL21（DE3）内。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。结果质粒pET32a-MPB64经测序,结果与Geneback中的结核分枝杆菌标准菌株H37RV核苷酸序列基本一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性的形式表达,其分子质量约为24 kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经MagExtractor-His-tag-磁珠纯化试剂盒纯化后浓度达2.49mg·mL^-1;Western-blot结果显示融合蛋白可与抗His-Tag标签的单克隆抗体结合。结论成功得到高纯度的重组目的蛋白pET32a-MPB64,为进一步制备其单克隆抗体奠定了基础。     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。     

肿瘤转移抑制基因Nm23-H1融合蛋白的表达纯化及其功能的初步研究

目的 利用人Nm23-H1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,并对蛋白其活性进行初步分析.方法 将重组质粒pET28a-Nm23-H1转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到Nm23-H1融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot鉴定纯化蛋白,并用RP-HPLC法、电泳迁移率变动分析实验检测Nm23-H1融合蛋白的核苷二磷酸激酶(NDPK)活性及核酸内切酶(AP)修复活性.结果 转化溶原菌后能够表达目的 蛋白,蛋白表达量高,为可溶性蛋白.Ni2+柱纯化后得到Nm23-H1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.RP-HPLC法就及电泳迁移率变动分析实验证明所纯化的Nm23-H1融合蛋白具有NDPK活性,不具有AP修复活性,但可以增加APE1蛋白的AP修复活性.结论 利用原核表达载体pET28a-Nm23-H1在E.coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到具有NDPK活性,但无AP修复活性的Nm23-H1融合蛋白,此蛋白可以增强APE1蛋白的AP修复活性,共同参与细胞的DNA损伤修复.     

人FcγRIIb胞外区原核表达载体的构建及表达

目的构建人FcγRIIb胞外区蛋白原核表达载体pET-sFcγRIIb,诱导表达并纯化。方法 PCR扩增获得人sFcγRIIb基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达重组质粒pET-sFcγRIIb,经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,采用不同温度和时间的IPTG诱导蛋白表达,确定最佳诱导条件,SDS—PAGE分析正确后,用镍琼脂糖磁珠纯化。结果扩增出了人sFcγRIIb基因,成功构建原核表达重组质粒pET-sFcγRIIb,30℃10h IPTG诱导表达并纯化出41.5kDa的融合蛋白。结论获得重组人FcγRIIb胞外区蛋白,为以后人FcγRIIb胞外区蛋白功能的深入研究奠定基础。     

人成熟转化生长因子β1蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人成熟转化生长因子β1（hmTGF-β1）的原核表达载体,表达并纯化hmTGF-β1蛋白。方法应用RT-PCR方法获得hmTGF-β1基因,连接至自带6His标签表达载体pET23b,构建原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,诱导表达hmTGF-β1融合蛋白,镍亲合层析法纯化融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析。结果成功构建了hmTGF-β1原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析,在约15kD处出现了一条新的蛋白条带,WesternBlot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合。应用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,分析纯度达95%。结论成功构建了hmTGF-β1蛋白的原核表达质粒,并成功表达与纯化hmTGF-β1蛋白,为进一步复性、获得有活性的hmTGF-β1打下基础。     

幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础.