与肝癌细胞系HepG2特异性结合单链抗体的筛选与序列分析

目的：从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系HepC2特异性结合的单链抗体，为寻找肝癌细胞表面特异性标志及靶向研究奠定基础。方法：以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞，以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞，从人源噬菌体抗体库(Griflfin．l Library)经三轮筛选后，阳性菌质粒PCR确定其中含有单链抗体基因的克隆，通过细胞ELISA及FCM筛选特异性的单链抗体噬菌体，通过ABL3130全自动荧光测序仪测序，并通过GeneBank比对进行同源性分析，IPTG诱导可溶性单链抗体表达，并检测其与肝癌细胞株结合的特异性。结果：获得了2个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆。经DNA测序后，在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对，并用IMGTF／V-Quest软件进行分析，确定为2个插入序列不同的单链抗体片段。经细胞ELISA证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合。获得的序列成功登陆Genebank，序列号为AY686498-AY686499。结论：从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系HepG2特异性结合的具有功能活性的单链抗体，为进一步寻找肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础。     

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。     

单链抗体的研究与应用进展

单链抗体是一种重要的基因工程抗体,以其独有的优势倍受关注,并在AIDS,肿瘤影像分析及治疗方面取得长跑产进展,本对近年单链抗体的构建,表达及应用作一综述。     

从噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白单链抗体

目的　从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体 (scFv)并进行鉴定。方法　以人表皮角蛋白为抗原 ,通过“吸附 洗脱 扩增”过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白单链抗体 ,对其抗原结合活性、识别角蛋白的相对分子质量 (Mr)和序列进行分析鉴定。结果　经过筛选 ,获得 6株能与角蛋白特异性结合的阳性克隆 ,所识别角蛋白的Mr 相同 ,均在 5 6 0 0 0～ 5 70 0 0之间 ;序列分析显示 ,所获抗体克隆的可变区基因分别属于免疫球蛋白基因家族的不同亚群。结论　利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白单链抗体     

单链抗体及其在生物医学中的应用

单链抗体是一种小分子基因工程抗体,以其独有的优势在显像定位诊断、靶向治疗和基因治疗等方面展示了乐观的应用前景.本文对单链抗体的构建、表达及在生物医学中的应用作一综述.     

抗肝癌单链抗体的构建及其结合特性

本文构建特异性抗肝癌 (HCC )噬菌体单链抗体 (ScFv )库并观察其靶向性。应用噬菌体表面呈现技术 ,从经HCC细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞构建特异性抗HCC噬菌体ScFv库 ,应用HCC细胞和正常肝细胞筛选。制备游离ScFv,以正常肝细胞作为对照 ,应用ELISA、点杂交和免疫组织化学方法以及流式细胞仪 (FCM )检测ScFv与HCC细胞的特异性结合能力。结果显示抗体库库容为 2 14× 10 6 ;核酸序列分析显示ScFv基因结构正确 ;游离ScFv相对分子质量为 3 2 0 0 0 ;ScFv抗HCC效价为 1∶16;点杂交和免疫组织化学技术检测显示HCC细胞被染成棕黄色 ,阴性对照、空白对照未着色 ;FCM检测发现ScFv具有与HCC细胞特异性结合的能力。特异性抗HCC噬菌体ScFv具有与HCC结合的靶向特异性。     

肝癌细胞特异性结合抗体的筛选及序列测定

目的通过噬菌体展示技术筛选与肝癌细胞特异性结合的抗体.方法用肝癌细胞系SMMC7721免疫小鼠,提取脾细胞总RNA,构建单链抗体库,从中筛选特异性结合的抗体.结果构建了一个库容量为2×105的单链抗体库,并筛选到1个与肝癌细胞系HepG2特异性结合的噬菌体-单链抗体.此单链抗体与HepG2细胞结合滴度比正常肝细胞低125倍以上.结论本研究成功构建了单链抗体库并筛选到与靶细胞特异性结合的噬菌体-单链抗体.     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

SLE患者自身抗体单链噬菌体抗体库构建及抗体活性检测

本文用ＳＬＥ病人外周血淋巴细胞抽提ＲＮＡ,采用ＲＴ ＰＣＲ反应以人的特异性ＨｕＶＨＢＡＣＫ、ＨｕＪＨＦＯＲ和ＨｕＶＬＢＡＣＫ、ＨｕＶＬＦＯＲ引物扩增人抗体的ＶＨ和ＶＬ基因片段,并将其与ｌｉｎｋｅｒ拼接成ＳｃＦｖ片段克隆于大肠杆菌,使其与噬菌体基因Ⅲ的产物以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达,从而构建了ＳＬＥ病人的单链噬菌体抗体库,ＥＬＩＳＡ检测证明ＳｃＦｖ基因产物具有抗体活性。ＳＬＥ噬菌体抗体库的构建为ＳＬＥ发病机理、诊断和治疗研究打下了良好的基础。     

抗恶性疟原虫HRP-II单链抗体的筛选与特性分析

目的　筛选抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白 2 (HRP II)单链抗体 (ScFv)并对其进行鉴定。方法从抗恶性疟原虫HRP IIScFv库中 ,挑取单菌落鉴定重组噬粒 ,采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP II结合的阳性克隆 ,并选其中 2株强阳性克隆进行序列分析。结果筛选到 8株具有HRP II结合活性的阳性克隆 ,所测 2株克隆的基因序列一致 ,其重链及轻链分别属于鼠抗体基因家族中第I及κVI亚群。结论从抗体库中成功地筛选出阳性克隆 ,为基因工程抗体在恶性疟诊断试剂中的应用奠定了基础     

抗恶性疟原虫HRP—Ⅱ单链抗体的筛选与特性分析

目的：筛选抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白2（HRP－Ⅱ）单链抗体（SeFv)并对其进行鉴定。方法：从抗恶性疟原虫HRP－Ⅱ ScFv库中，挑取单菌落鉴定重组噬粒，采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP－Ⅱ结合的阳性噬粒，采用ELISA法筛选能与重组抗原HRP－Ⅱ结合的阳性克隆，并选其中2株强阳性克隆进行序列分析。结果：筛选到8株具有HRP－Ⅱ结合活性的阳性克隆，所测2株克隆的基因序列一致，其重链及轻链分别属于鼠抗体基因家族中第I及kVI亚群。结论：从抗体库中成功地筛选出阳性克隆，为基因工程抗体在恶性疟诊断试剂中的应用奠定了基础。     

抗恶性疟SERA噬菌体抗体库的构建及单链抗体的筛选与鉴定

目的 研制用于疟疾简便,快速诊断试剂盒的试剂。方法 利用噬菌体抗体库技术,构建抗恶性疟原虫丝氨酸重复抗原（SERA）的噬菌体抗体库。经3轮“吸附－洗脱－扩增”的富集反应后,从中筛选抗SERA的阳性克隆株,并进行可溶性诱导表达,最后用ELISA和Western blot等进行鉴定。结果 成功地构建了中等库容的噬菌体抗体库,并从中筛选到9株抗SERA的阳性克隆株,表达的单链抗体的相对分子质量大小约为31kDa,能与SE47‘抗原起特异性结合反应。结论 成功地构建了抗SE47‘的噬菌体抗体库,从中筛选制备的单链抗体为研制疟疾快速诊断试剂盒奠定了基础。     

人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定

目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.     

从半合成抗体库克隆抗TNF-α人单链抗体

通过噬菌体抗体库技术,不经免疫克隆抗ＴＮＦ－α人单链抗体,用固相化的重组ＴＮＦ－α抗原对半合成噬菌体抗体库进行了４轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选。     

鸡源性免疫单链抗体库的构建与鉴定

目的:建立鸡源性免疫单链抗体库的构建方法。方法:根据鸡抗体基因结构特点,借助噬菌体展示技术原理,以免疫变形链球菌全菌抗原后的鸡脾脏B细胞为抗体基因来源,构建鸡源性免疫单链抗体库;采用固相淘选法筛选抗变形链球菌的噬菌体单链抗体(scFv),以此鉴定所构建的免疫单链抗体库。结果:从鸡脾脏总RNA中扩增出了鸡免疫球蛋白的轻、重链可变区的全部基因;得到了一个库容量为1·6×107的鸡免疫单链抗体库;筛选到了抗变形链球菌的噬菌体scFv,并测出了其DNA序列。结论:结合噬菌体抗体库技术原理与鸡抗体基因结构的特点,可以成功地构建鸡源性免疫单链抗体库。     

从噬菌体抗体库克隆抗人RBC单链抗体基因

目的用噬菌体抗体库技术克隆抗人红细胞（ＲＢＣ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法以人ＲＢＣ免疫小鼠，取脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＶＨ和Ｖκ基因，组装到ＳｃＦｖ－噬菌体抗体表达载体中，构建了噬菌体抗体库，以人ＲＢＣ为固相抗原，对该库进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得了抗人ＲＢＣ的ＳｃＦｖ基因。结果ＤＮＡ序列分析表明其可变区基因分别属于小鼠ＶＨⅢ亚群和ＶκⅤ亚群。结论所表达的ＳｃＦｖ可与不同人ＲＢＣ结合，与ＡＢＯ血型抗原无关，可用于构建快速血凝诊断的工程抗体     

抗人纤维蛋白噬菌体单链抗体库的构建和鉴定

目的应用噬菌体展示技术构建抗人纤维蛋白单链抗体(scFv)文库,筛选高亲和力抗人纤维蛋白scFv并进行鉴定。方法利用人纤维蛋白免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸聚合酶链反应(PCR)将VH和VL基因拼接成scFv基因,SfiⅠ/NotⅠ双酶切克隆入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1构建成库,采用人纤维蛋白原对抗体库进行负筛选,人纤维蛋白进行正筛选,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测阳性克隆的抗原特异性并进行测序分析。结果构建了库容为8.7×106的抗人纤维蛋白scFv库,ELISA测定显示scFv具有较高的抗原特异性;抗人纤维蛋白scFv基因序列长732 bp,编码244个氨基酸,VH和VL基因均有明确的3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗人纤维蛋白scFv文库,并筛选到高亲和力的抗人纤维蛋白scFv,为新型血栓显像剂的开发奠定了实验基础。     

抗恶性疟HRP—Ⅱ单链抗体的筛选和鉴定

目的 研究开发简便、快速和有铲的疾诊断技术。方法 利用菌体抗体库技术，在构建抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗加的基础上，经３轮“吸附－洗脱－扩增”的富集反应后，筛选抗ＨＲＰⅡ阳性克隆株并进行可溶性诱导表达，最后用ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ等进行鉴定。结果 筛选出６株抗ＨＲＰⅡ阳性克隆株表达的单链抗体Ｍｆ为３１０００左右，能与ＨＲＰⅡ抗原起特异性结合反应。结论 本研究为研制疟疾快速诊断试剂盒奠定     

β-淀粉样蛋白特异性单链抗体的制备及鉴定

目的制备1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv),并进行性能鉴定。方法利用噬菌体展示技术,用20个AD病人的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库。以Aβ1-40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一株抗Aβ单链抗体H1,对其重链和轻链可变区基因进行测序分析。通过表达载体pET28a(+)对目的蛋白进行大量表达,并利用Western-blot对单链抗体H1的免疫活性进行鉴定。结果成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×106。从库中筛选并表达出一株抗Aβ1-40的单链抗体H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列。Western-blot检测证实该抗体可特异性结合Aβ1-40。结论利用噬菌体抗体库技术可成功制备Aβ肽特异性单链抗体,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径。     

从噬菌体抗体库中筛选抗Cry1Ac蛋白单链抗体

目的:从Tomlinson J噬菌体抗体库中筛选人源化抗Cry1Ac蛋白单链抗体(scFv)并进行鉴定.方法:以Cry1Ac蛋白为抗原包被固相,经4轮"吸附-洗脱-扩增"过程后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对其进行基因序列测定.结果:经过4轮筛选,获得了2株能与Cry1Ac蛋白特异性结合的阳性克隆.结论:利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Cry1Ac蛋白scFv,为Cry1Ac毒素蛋白检测提供了条件.