基因转移人TGF-β1在NIH/3T3细胞中表达鉴定

目的：研究转移人转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）在真核细胞系中蛋白表达。方法：借助真核质粒表达载体,将人ＴＧＦ－β１转移入小鼠成纤维细胞株（ＮＨ／３Ｔ３）细胞中,经Ｇ４１８筛选,克隆扩增,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＰＣＲ、ＰＴ－ＰＧＲ鉴定,并经水貂肺上皮细胞（ＣＣＬ－６４）生长抑制法,对克隆细胞分泌ＴＧＦ－β１蛋白进行活性检测。结果：证实了重组人ＴＧＦ－β１基因在ＮＩ     

STK15的表达对NIH3T3细胞的影响

目的构建pcDNA3.1-STK15表达质粒,探讨STK15基因对小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的影响。方法构建pcDNA3.1-STK15质粒,将其转染NIH3T3,应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹方法检测STK15的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力。结果转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞在48 h有STK15的表达,而且该细胞的增殖速度和穿透Matrigel胶的细胞数均明显高于对照组(P0.05)。结论STK15基因具有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。     

稳定表达野生型和突变型DNA聚合酶β的NIH3 T3细胞系的建立及其生长特性

目的：建立稳定表达野生型及突变型DNA聚合酶β（polβ）的NIH3T3细胞系。方法：用脂质体转染法分别将野生型和突变型polβ真核表达载体pcDNA3．1-PW和pcDNA3．1-PM3转染入NIH3T3细胞,经G418筛选得到稳定转染细胞系。用RT—PCR、免疫印迹法检测转染细胞polβmRNA和POLB蛋白的表达水平．MTT法测转染细胞生长曲线,免疫组化法测增殖细胞核抗原（PCNA）,并用流式细胞仪测细胞周期。结果与结论：成功建立了稳定表达野生型及突变型polβ的NIH3T3细胞系。野生型polβ对NIH3T3细胞生长无明显影响,突变型polβ则使NIH3T3细胞生长速度加快,细胞周期发生改变,细胞多被阻滞在S期。     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

外源金属硫蛋白基因表达对NIH3T3细胞耐寒力的影响

目的：研究金属硫蛋白基因对细胞耐寒力的影响．方法：通过将金属硫蛋白基因（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,ＭＴ）的表达载体ｐＢＡｃＮｅｏ－ＭＴⅡＡ转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）,筛选获得了高表达ＭＴ的细胞克隆ＭＴ１（ＭＴ阳性细胞百分比为２９．４％）,用四唑盐（ＭＴＴ）比色实验观察了该细胞的生长曲线以及不同低温条件下的存活能力,并通过电镜观察超微结构以进一步证实．结果：与转染ｐＢＡｃＮｅｏ空载体的细胞克隆Ｎｅｏ相比,常温下二者的增殖能力无显著差别．在不同的低温条件下,存活能力都受到一定程度的影响,细胞克隆ＭＴ１的存活细胞数明显高于阴性对照（Ｐ＜０．０１）,超微结构改变不明显．结论：上调金属硫蛋白基因表达可能具有增强耐寒的能力．     

小鼠24p3基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠24p3基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH3T3细胞中24p3/SIP24蛋白的表达情况,初步鉴定24p3/SIP24蛋白介导铁向细胞内转运的生物学功能.方法RT-PCR自小鼠肺组织中克隆24p3 cDNA.用基因重组技术构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体并行酶切和测序鉴定.脂质体DOTAP方法转染NIH3T3细胞,48 h后用G418筛选阳性克隆并培养扩增至21 d.对阳性克隆的培养基上清中24p3/SIP24蛋白的表达用ELISA和Westernblot分析,进一步用原子吸收分光光谱观察其介导铁向NIH3T3细胞内转运的生物学功能.结果成功克隆24p3cDNA并构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体,筛选出稳定表达24p3/SIP24蛋白的NIH3T3细胞株,24p3/SIP24蛋白在NIH3T3细胞上清中获得表达,并能介导铁向NIH3T3细胞内转运.结论24p3基因在NIH3T3细胞中获得表达,有良好的生物学活性,为进一步研究24p3/SIP24蛋白介导铁转运的生物学功能及作用机制奠定了基础.     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。     

乙醇对NIH 3T3成纤维细胞成脂分化的影响

目的观察乙醇对NIH 3T3成纤维细胞分化为脂肪细胞的作用,及其对成脂转录因子PPARγ表达的影响.方法以不同浓度乙醇作为诱导剂处理NIH 3T3成纤维细胞14 d,苏丹Ⅳ染色,采用电子计算机图像分析软件Image Pro Plus 4.1,确定脂肪细胞百分比.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,检测细胞PPARγ mRNA的表达.结果以递增浓度(0.03 mol/L、0.06 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L)乙醇处理NIH 3T3成纤维细胞14 d,在0.06 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L乙醇组中,脂肪细胞百分比和PPARγ mRNA表达均比对照组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.001).0.03 mol/L乙醇组与对照组间的脂肪细胞百分比和PPARγ mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05).结论乙醇能够直接诱导NIH 3T3成纤维细胞大量分化为脂肪细胞,这可能是乙醇性骨坏死时骨髓内脂肪增多的原因之一.     

人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达

目的　研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达。方法　采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞 (NIH3T3) ,转染后 72h ,经G4 18抗性筛选出阳性克隆并培养到第 2 4d ,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达 ,同时用ELASA法监测转染后 2 4d的细胞培养液的胰岛素水平。结果　转染PCMV .INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及PCMV转染组 (P <0 .0 1) ,未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的重要治疗手段 ,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

重组白细胞介素13对成纤维细胞增殖的影响

目的：观察重组白细胞介素13（rIL-13）对NIH3T3细胞增殖作用的影响，探讨肺纤维化的发病机制。方法：NIH313细胞分为rIL-13组和不含rIL-13的对照组，rIL-13组加入不同浓度的rIL-13，作用24及48h。透射电镜观察313细胞的超微结构，Hoechst试剂盒观察细胞DNA形态变化，噻唑蓝比色试验（MTT法）测定细胞增殖率。结果：rIL-13呈剂量依赖方式刺激313细胞细胞生长。经rIL-1380ng／ml孵育的细胞DNA合成增加，细胞核增大，细胞质中可见较多核糖体及线粒体。rIL-13组细胞增殖率增加，与对照组比较有显著性差异（P〈0．05）。结论：rIL-13可能通过促进成纤维细胞增殖，在肺纤维化的发病机制中发挥重要作用。     

人白介素-10在NIH3T3细胞中的表达及生物学效应的初步观察

目的观察IL-10的免疫抑制作用.方法将构建好的pLXHIL-10载体,经包装细胞PA317包装后感染小鼠成纤维细胞株NIH3T3,用ELISA和原位杂交的方法检测hIL-10的表达,并对其生物学活性进行初步观察.结果检测到感染细胞中有hIL-10 mRNA的表达,感染细胞培养上清中存在hIL-10,证实感染细胞培养上清对混合淋巴细胞培养反应有明显的抑制作用.结论hIL-10可抑制混合淋巴细胞反应.     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

腺病毒介导的Cbfa1基因转移对NIH3T3细胞的调节作用

目的探讨腺病毒介导的核心结合因子a1(core binding factor a1, Cbfa1)基因转移对NIH3T3细胞的调节作用.方法含有Cbfa1基因的重组腺病毒转染NIH3T3细胞,RT-PCR检测成骨标志基因骨钙素(osteocalcin, OCN)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen)、骨唾液蛋白(bone sialoprotein, Bsp)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、Cbfa1的表达.Western blot检测Cbfa1的表达,免疫细胞化学染色检查OCN的表达.结果 NIH3T3细胞在Cbfa1基因转移后RT-PCR检测到OCN、Bsp、AKP、 type Ⅰ collagen基因的表达, Western blot检测到Cbfa1蛋白的表达,免疫细胞化学染色检测到了OCN蛋白的表达.结论腺病毒介导Cbfa1基因转移NIH3T3细胞后出现成骨表型.     

MTT法检测博莱霉素对小鼠肺成纤维细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度和时间的博莱霉素对小鼠肺成纤维细胞（NIH3T3细胞）增殖的影响。方法：取对数生长期的NIH3T3细胞,用10%胎牛血清培养制成的细胞悬液加入96孔培养板中培养。以NIH3T3细胞为观察对象,分别给予不同浓度（0.1~10 000 mU/mL）博莱霉素处理,于给药后12 h、36 h、48 h后采用4-甲偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖。结果：与空白对照组比较,1~10 mU/mL浓度的博莱霉素,可促进NIH3T3细胞增殖（P〈0.05）。其余浓度博莱霉素对细胞增殖无影响。结论：1~10mU/mL浓度的博莱霉素能够促进NIH3T3细胞的增殖。     

反义四环素转录激活子表达细胞系的构建及鉴定

目的:构建反义四环素转录激活子(reverse Tc-controlled transactivator,rtTA)表达细胞系。方法:将RevTet-On基因表达系统中调控载体pRevTet-On转染NIH3T3细胞,经G418筛选及RT-PCR鉴定。结果:获得7个rtTA不同表达水平的细胞克隆。结论:成功构建rtTA表达细胞模型,为进一步研究特定外源基因的功能提供一个理想实验平台。     

Regularity of ultraviolet (UV)-induced NIH3T3 cell damage and characteristics of DNA cleavage in UV-induced NIH3T3 cells apoptosis

INTRODUCTIONThesolarspectrumonthesurfaceoftheearthcomprisesultraviolet(UV),visibleandinfraredradiation,withrelativeintensityof3%,37%and60%respectively.Inaddition,X--raysandradiowaveshavebeendetected,however,theirintensityisnegligiblylowllj.AlthoughUVradiationisaminorpartofthesolarspectrum,itisconsideredtobeveryeffective.Basedondifferencesinbiologicalresponses,UVradiationissubdividedintothreewavebands:UVC(100urn--280"m),UVB(180urn--320urn)andUVA(320urn--400"m)[ZJ.Inthisstudy,cytotox…